Podcasts about organproben

Die Afrikanische Schweinepest (ASP) gehört zu den weltweit gefürchtetsten Infektionskrankheiten des Schweins und ist bei der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE, franz. Office International des Épizooties) anzeigepflichtig. Verursacht wird die in der Regel tödlich verlaufende Erkrankung durch das Virus der Afrikanischen Schweinepest (ASPV), welches zur Gattung Asfivirus innerhalb der Familie Asfarviridae gehört. Empfänglich für das ASPV sind nur Mitglieder der Familie der echten Schweine (Suidae) sowie Lederzecken der Gattung Ornithodoros. Die afrikanischen Wildschweinearten (Warzenschweine, Buschschweine und Riesenwaldschwein) sind die natürlichen Wirte des Virus, wohingegen die Lederzecken als Vektoren fungieren. Ursprünglich war die ASP nur in Afrika beheimatet. Seit den 1950er Jahren kam es allerdings auch zu Ausbrüchen in Europa und Amerika. Auf der italienischen Insel Sardinien ist die ASP seit mehr als 30 Jahren endemisch und auf der iberischen Halbinsel konnte die Erkrankung erst in den späten 90er Jahren des letzten Jahrhunderts wieder getilgt werden. Der letzte Neueintrag auf den eurasischen Kontinent fand im Jahr 2007 im Trans-Kaukasus statt. Von diesem Geschehen ausgehend, kam es seit 2014 zu Ausbrüchen in den baltischen Staaten und Polen. Für die Optimierung von Bekämpfungsstrategien, die derzeit ohne Impfstoff auskommen müssen, ist die Kenntnis der Epidemiologie und Biologie der Erkrankung von großer Bedeutung. Für die ASP wird seit einigen Jahren ein dosisabhängiger Infektionsverlauf diskutiert. Mittels eines gut charakterisierten Isolats aus Armenien wurde diese Fragestellung in Haus- und Wildschweinen untersucht. Insbesondere ging es um die Frage, ob niedrige Infektionsdosen die Gefahr von chronischen oder persistierenden Infektionen erhöht. Da gezeigt werden konnte, dass die aktuellen ASPV-Isolate eine hohe Virulenz besitzen, kommt der Untersuchung von Fallwild für die Früherkennung eine herausragende Rolle zu. Für diesen Zweck werden zum Beispiel Blut- und Organproben von Fallwild entnommen. Mit dem Ziel die Bereitschaft der Jägerschaft zu fördern und die Probenentnahme sowie den anschließenden Versand zu vereinfachen, wurden daher drei unterschiedliche Tupfersysteme untersucht und für den Einsatz in der Praxis validiert.

Infektionen mit Mykobakterien sind beim Vogel weit verbreitet. Am häufigsten werden die Subspezies M. avium ssp. avium und M. avium ssp. silvaticum nachgewiesen, die schwere chronische Erkrankungen bei einem breiten Spektrum von Vogelarten verursachen. Außerdem muss von einem zoonotischen Potential dieser Keime ausgegangen werden. Da die Mykobakteriose beim Vogel letztlich immer zur Erregerausscheidung führt und meist letal verläuft, ist es insbesondere zur Infektionsprophylaxe in Beständen wichtig, eine Infektion frühzeitig und sicher diagnostizieren zu können. Für die Diagnostik standen neben einer serologischen Untersuchung bisher die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Nachweis säurefester Stäbchen und die lang dauernde Anzucht von Mykobakterien aus Organmaterial zur Verfügung. Neuere molekularbiologische Nachweisverfahren können Mykobakterien nur bis auf die Speziesebene differenzieren oder sie sind sehr aufwendig. Insbesondere Kot wurde bisher selten direkt als Ausgangsmaterial für einen Nachweis beim Vogel verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s. in Organproben und Vogelkot entwickelt. Da vor allem bei Kotproben mit dem Vorkommen von PCR-Inhibitoren zu rechnen ist, wurde zur Qualitätssicherung eine interne Kontrolle in die Extraktion und PCR integriert. Basierend auf den Ergebnissen von Sequenzanalysen von hsp65, der 16SrRNA und von Insertionselementen wurde als Zielgen für die Realtime-PCR das Insertionselement IS901 ausgewählt. Für den Nachweis von M.a.a und M.a.s. wurden anschließend Primer und eine Taqman-Sonde konstruiert, die auf dieses Insertionselement gerichtet sind. Als interne Kontrolle wurde eine Realtime-PCR nach WAKELEY et al. (2006) für Taylorella equigenitalis verwendet und die gesamte Realtime-PCR in Form einer Duplex-PCR konzipiert. Die Reaktionsbedingungen dieser Realtime-PCR wurden anschließend hinsichtlich der Konzentrationen von Magnesiumchlorid, dNTP, Primer und Sonden optimiert. Zur Ermittlung der Spezifität wurden 13 Mykobakterien-Referenzstämme mit dieser PCR untersucht. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze und Überprüfung der Sensitivität wurden zudem Kotproben von SPF-Tauben mit Suspensionen aus unterschiedlichen Mykobakterienkonzentrationen gespickt und dann geblindet sowohl mittels Ziehl-Neelsen-Färbung als auch mit der Duplex-Realtime-PCR untersucht. Des Weiteren wurden 27 Organproben, 18 Kotproben sowie 12 asservierte Mykobakterienstämme, die aus Organproben von Vogelpatienten angezüchtet worden waren, einer Testung mittels PCR unterzogen. Bei der Etablierung der internen Kontrolle wurde die DNA-Menge der internen Kontrolle so eingestellt, dass keine Hemmung der PCR für M.a.a und M.a.s auftrat. Die Relevanz der Verwendung dieser internen Kontrolle wurde insbesondere bei der Untersuchung von 18 Kotproben von Vogelpatienten deutlich, bei der in drei Ansätzen bei der Verwendung von unverdünnter DNA aus der Extraktion eine Inhibition der PCR angezeigt wurde. Bei der Untersuchung der Referenz-Stämme wurde eine DNA-Amplifikation anhand eines spezifischen Fluoreszenzsignals nur bei den vogelpathogenen Erregern M.a.a. und M.a.s. nachgewiesen. In der geblindeten Untersuchung von mit M.a.a gespickten Kotproben wurde für die Duplex-Realtime-PCR eine Nachweisgrenze von 104 Mykobakterien pro Gramm Kot ermittelt, was rechnerisch einem Nachweis von 1,25 Mykobakterien pro PCR-Ansatz entspricht. Die mikroskopische Untersuchung nach Ziehl-Neelsen-Färbung zeigte eine höhere Nachweisgrenze mit 105 Mykobakterien pro Gramm Kot als die PCR und erlaubt zusätzlich keine Aussage darüber, ob es sich um vogelpathogene Mykobakterien handelt. Mit der Realtime-PCR wurden alle negativen Ansätze als negativ erkannt. Bei der Untersuchung von klinischem Material von Vogelpatienten (27 Organproben, 18 Kotproben) und von 12 asservierten Mykobakterienstämmen, bei denen vergleichend auch mikroskopische Untersuchungen nach Ziehl-Neelsen-Färbung durchgeführt wurden, wurde bei 32 von 34 Proben mit Nachweis von säurefesten Stäbchen auch DNA von M.a.a./M.a.s. mittels Realtime-PCR festgestellt. Dies belegt die Bedeutung dieser beiden Unterarten als Krankheitserreger für Vögel. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s erwies sich als sehr gut für die Diagnostik von klinischem Material und ist somit für die Untersuchung von Vogelpatienten und zur Bestandsuntersuchung geeignet. Insbesondere die in die PCR integrierte interne Kontrolle ist für die Qualitätskontrolle der Diagnostik bedeutend, da, wie hier gezeigt wurde, vor allem Kot- und Darmproben hinsichtlich eines hohen Gehalts an Inhibitoren problematisch sind.

Das Ovine Herpesvirus-2 (OvHV-2) ist der Erreger des Schaf-assoziierten Bösartigen Katarrhalfiebers (SA-BKF), einer meist tödlich verlaufenden, lymphoproliferativen Erkrankung, die weltweit bei Rindern und anderen Ungulaten vorkommt. Die meisten der in Bayern beobachteten Fälle von SA-BKF bei Rindern sind auf eine gemeinsame Haltung mit Schafen zurückzuführen, die das Virusreservoir des OvHV-2 darstellen. Wie stark die Virusinfektion in bayerischen Schafherden verbreitet ist, konnte bisher nur vermutet werden. Für Rinder fehlten fundierte Daten über die Häufigkeit und Bedeutung möglicher subklinischer Infektionen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in 20 bayerischen Mischbetrieben die jeweiligen Prävalenzen von OvHV-2-Infektionen im Schaf- und Rinderbestand mittels eines kompetitiven ELISA und einer seminested PCR ermittelt und umfassende anamnestische Daten zu den Betrieben erhoben. Es wurden zwei Studiengruppen zu je zehn Betrieben mit und entsprechend ohne klinische, virologisch bestätigte BKF-Fälle bei Rindern zwischen Januar 2007 und Dezember 2009 gebildet. Alle untersuchten Schafherden waren zu einem großen Anteil OvHV-2-infiziert. In Betrieben der Gruppe 1, in denen klinische Fälle von BKF bei Rindern auftraten, lag die mediane Seroprävalenz BKF-Virus-spezifischer Antikörper der einzelnen Schafherden bei 100 % und die Prävalenz der mittels Genomnachweis festgestellten OvHV-2-Infektionen betrug 92 %. In den Schafherden der Gruppe 2 wurden dagegen nur eine Seroprävalenz von 73 % und eine OvHV-2-Genom-Prävalenz von 58 % festgestellt. Ebenso ergaben die Untersuchungen der Rinder einen klaren Unterschied zwischen den beiden Studiengruppen. In Betrieben der Gruppe 1 lagen die Seroprävalenzen bei 24 % und ausschließlich in Betrieben dieser Gruppe war bei 13 Rindern OvHV-2-DNA im Blut nachweisbar. Die Rinderbestände der Gruppe 2 waren nur zu 16 % seropositiv für BKF-Erreger-spezifische Antikörper und das Blut keines der Tiere reagierte in der PCR. Dass vor allem in den untersuchten Mischbetrieben, in denen ein besonders enger und auch direkter Kontakt zwischen Schafen und Rindern bestand, sowohl die Seroprävalenzen bei den Rindern, als auch die Anzahl der Rinder mit nachweisbarer OvHV-2-DNA im Blut relativ hoch waren, lässt auf einen ursächlichen Zusammenhang schließen. Außerdem traten in diesen Mischbetrieben, die zudem sehr hohe OvHV-2-Prävalenzen in den Schafherden hatten, auch subklinische OvHV-2-Infektionen bei elf Rindern auf. Diese Tiere zeigten bei wiederholter Untersuchung auch bis zu eineinhalb Jahren nach initialer Diagnose keine mit BKF assoziierbaren klinischen Symptome. Der auf die Zellzahl normierte Gehalt an OvHV-2-Genomkopien in den Blutproben dieser Rinder, wie interessanterweise auch der Schafe, lag in einem Bereich von 1,7 x 10-4 bis 1,7 x 10-1 OvHV-2-Genomkopien. In Blutproben von Rindern mit klinischem BKF dagegen lag der relative OvHV-2-Genomgehalt deutlich höher. In den Organproben eines akut an BKF erkrankten Rindes schließlich wurde der höchste relative OvHV-2-Genomgehalt in den Lymphknoten und der Milz nachgewiesen. Der relative OvHV-2-Genomgehalt von in vitro kultivierten, mit Con A stimulierbaren Lymphozyten eines subklinisch infizierten Rindes stieg im Laufe von zehn Wochen deutlich an, fiel jedoch nach einem Peak bei 8,4 x 102 wieder ab. Durch die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen liegen erstmals Prävalenzdaten zu OvHV-2-Infektionen in selektierten bayerischen Rinder- und Schafherden vor. Die Ergebnisse zeigen, dass die meisten untersuchten Schafe tatsächlich mit OvHV-2 infiziert sind und dass subklinische OvHV-2-Infektionen des Rindes in Bayern durchaus vorkommen. Da über diese Form der Infektion bei Rindern noch wenig bekannt ist und generell das Vorkommen der OvHV-2-Infektionen in Bayern unterschätzt wird, besteht ein weiterer Forschungs- und Aufklärungsbedarf.

Zusammenfassung Einleitung Mikrosphären (MS) gelten als Standardmethode zur Messung des regionalen Blutflusses. Hierzu werden MS linksatrial injiziert. Sie verteilen sich dann im arteriellen Teil des Blutkreislaufes. Die Anzahl der in den präkapillären Gefäßen festgehaltenen MS ist direkt proportional der regionalen Organdurchblutung. Da die bisherige Markierung der MS mit instabilen Nukliden die Nachteile des Umgangs mit Radioaktivität mit sich brachte, hat man in den letzten Jahren versucht, die MS mit Fluoreszenzfarbstoffen (FM) zu beladen. Diese neue Art der Markierung erfordert allerdings, daß die FM quantitativ aus den Organproben zurückgewonnen werden müssen. Dies geschah bisher mittels Filtration oder Sedimentation. Beide Methoden bieten jedoch Nachteile. Ziel unserer Studie war es, eine neue Methode zu entwickeln und deren Verarbeitungsprozess zu automatisieren. Dazu wurde ein Filtrationsgefäß entwickelt, das die Probenverarbeitung (Gewichtsbestimmung, Verdauung, Filtration, Spülung und Farbstoffauslösung) in einem einzigen Gefäß zuläßt und hierbei die vollständige Rückgewinnung der FM aus der Organprobe sicherstellt. Material und Methodik: Die von uns am Institut für Chirurgische Forschung entwickelte Sample Processing Unit (SPU) – gebrauchsmustergeschützt - besteht aus drei Untereinheiten: Filterhalter, Filter und Probengefäß. Der essentielle Bestandteil der SPU ist der Filter, der mit einem Polyamid-Filtergewebe (Maschenöffnung 7µm) ausgestattet ist. Das von uns entwickelte Verarbeitungsprotokoll sieht folgende Schritte vor: Die Gewebeprobe wird in den Filter gelegt und das Probengewicht bestimmt. Der Filter wird dann in ein Edelstahlkochgefäß gestellt und zur Verdauung des Gewebes werden 15 ml Digestionsflüssigkeit (4N KOH mit 0,02% Tween) und 1,5 ml Isopropanol 100% hinzugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation bei 60°C ist das organische Material vollständig aufgelöst und die FM schwimmen in der Zwischenschicht zwischen KOH und Isopropanol. Mit Hilfe von Unterdruck wird die Flüssigkeit durch das Filtergewebe filtriert. Dadurch kommen die FM auf der Membran zu liegen. Der später von den FM ausgelöste Fluoreszenzfarbstoff benötigt ein neutrales Umgebungsmilieu. Hierzu müssen alle KOH-Rückstände aus dem Filter entfernt werden. Dies geschieht mittels eines Phosphatpuffers (29.9g K2HPO4 in 800ml aqua dest. vermischt mit 5.88g KH2PO4 in 200ml aqua dest.), der auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist. Mit 15 ml dieses Puffers wird die gesamte Innenfläche des Filters abgespült. Durch kurzes Eintauchen des Filters in den Puffer wird auch die Außenfläche von den KOH-Resten befreit. Nach Trocknung des Filters durch Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff mit 2 ml eines organischen Lösungsmittels (2-Ethoxyethyl acetat - Cellosolve) aus den FM ausgelöst. Durch erneute Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff im Sammelgefäß aufgefangen und die Fluoreszenzintensität in einem Fluoreszenzspektrometer (LS50B, Perkin Elmer, Überlingen, Deutschland) bestimmt. Die Konzentration des Farbstoffes läßt auf die Anzahl der FM rückschließen, welche wiederum direkt proportional zum Blutfluß in der untersuchten Gewebeprobe ist. Der Proportionalitätsfaktor wird durch eine Blutreferenzprobe bestimmt, die während der Injektion der FM aus der Aorta thoracalis unter konstanter Pumpenzuggeschwindigkeit (Harvard Pump, Harvard Apparatus South Nattick, USA) entnommen wird. Diese Blutprobe kann ohne vorherige Verdauung unter Koagulationsschutz (CPDA mit dem Hauptbestandteil Citrat) direkt filtriert werden. Der Farbstoff wird mittels Cellosolve aus den Mikrosphären ausgelöst und die Fluoreszenzintesität bestimmt. Experimente Zunächst wurden die FM und die SPU in vitro Tests unterzogen. Bei den FM wurde mit Hilfe einer Verdünnungsreihe die Proportionalität zwischen der Anzahl der FM und der Fluoreszenzintensität untersucht. Die SPU und die dazugehörige Verarbeitungsmethode wurden einer Wiederfindungsstudie unterzogen. Dabei wurde dieselbe Anzahl von FM aller Farben in Filter und Glasröhrchen pipettiert. Die Filter durchliefen den gesamten Verarbeitungsprozeß. Das Filtrat und die Wände der Filter wurden auf die Präsenz von FM hin kontrolliert. Die Farbstofflösung, welche aus den 40 Filtern gewonnen wurde, wurde mit einer Referenzgruppe (Glasröhrchen ohne Probenverarbeitung, n=20) verglichen. Zur in vivo Validierung der SPU erfolgten an narkotisierten Schweinen (n=8) sechs simultane Injektionen von radioaktiv markierten 15µm MS (RM) (Niob, Strontium, Scandium, Indium, Cerium und Chrom) und 15µm FM (blue, bluegreen, yellowgreen, orange, red, scarlet) zu verschiedenen Zeitpunkten. Nach der Entnahme von Leber und Nieren, wurden diese Organe nach einem vorgegebenen Schema disseziert. Der regionale Blutfluß wurde anhand der Protokolle sowohl für RM (SCHOSSER et al. 1979) als auch FM bestimmt. Zunächst wurde die Radioaktivität der Proben im g-Counter (Canberra Packard, Frankfurt a.M., Deutschland) ermittelt. Hierauf wurde nach Verarbeitung der Organgewebe in der SPU die Fluoreszenzintensität mit Hilfe des Fluoreszenzspektrometers gemessen. Der Vergleich mittels beider Methoden erhobener Meßwerte wurde mit dem Bland-Altman-Plot durchgeführt. Hierbei wird das arithmetische Mittel der Blutflüsse, die durch FM- und RM-Methode berechnet worden sind, gegen die prozentuale Abweichung der FM von den RM aufgetragen. Zur Kontrolle der Filterfunktion und der Zuverläßigkeit der Meßergebnisse wurde die gleiche Anzahl (ca. 2500 FM) einer nicht im Experiment verwendeten 15 µm FM-Spezies (crimson), sowohl in SPU-Filter (SPU-Gruppe, n = 60), als auch in 20 Glasgefäße (Referenzgruppe, n = 20) gegeben. Die SPU wurden dem gesamten Protokoll der Probenverarbeitung unterzogen, wohingegen in der Referenzgruppe lediglich der Farbstoff ausgelöst und gemessen wurde. Die Gruppen wurden mittels t-test nach Student, p0,98). Die Filter weisen eine Wiederfindungsrate von 100% auf. Im Eluat fanden sich keine 15µm FM; zwischen der Filtergruppe und der Referenzgruppe besteht kein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenzintensität. Es zeigt sich eine sehr gute Vergleichbarkeit beider Methoden. In den Bland-Altman Plots für die Nieren- und Leberproben wichen die Blutflußwerte mit der FM-Methode um 8,2 bis 13,4% vom mittleren Fluß (arithmetisches Mittel aus RM und FM) ab. Dabei betrug die mittlere Differenz beider Methoden zwischen -7,4% und 3,8%. Der Vergleich der mittleren Intensitäten der Kontrollfarbe crimson zwischen der Referenzgruppe (9,32±0,74, n=20) und der SPU- Gruppe (9,38±0,98, n=60) ergab keinen signifikanten Unterschied. Diskussion und Schlußfolgerung Mit der SPU ist es möglich, FM vollständig aus Organproben zurückzugewinnen und dadurch den regionalen Blutfluß quantitativ zu bestimmen. Die errechneten Blutflusswerte der radioaktiven und fluoreszierenden Methoden sind miteinander vergleichbar. Somit stellen die FM eine valide Alternative zu RM unter Vermeidung der Problematik des Umgangs mit Radioaktivität dar. Der entscheidende Vorteil der SPU ist, daß der gesamte Verarbeitungsprozeß im selben Gefäß stattfindet, und so der Verlust von FM nahezu ausgeschlossen ist.Das standardisierte Protokoll der Probenverarbeitung mittels SPU vermindert im Vergleich zu früheren Protokollen die Bearbeitungszeit von ca. 24h bzw. 48h auf ca. 6h und reduziert die Arbeitsschritte bei denen große Präzision gefordert ist. Das Design der SPU ermöglicht eine Automatisierung der Probenverarbeitung und somit eine Arbeitserleichterung, da die Von-Hand-Bearbeitung nur noch auf das Befüllen der SPU reduziert wird