Podcasts about zentrifugation

Bei Host Dominik Hoffmann sind zu Gast Frau Dr. Anne de Regt, Molekular Biologin und stellv. Leiterin der zentralen Herstellung beim Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes, Sebastian Fechner, Gruppenleiter Vollblutverarbeiter, und Patric Nohe, Pressesprecher beim Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes. „Mit einer Blutspende drei Leben retten“ wird gerade Wiesentheid mehr als deutlich! Die Themen: Modernstes Produktions- und Logistikzentrum; Lagerung von Erythrozyten-, Plasma- und Thrombozytenkonzentrate; Tagesproduktionswerte; 24h Logistik; Zentrifugation und Separation; Jeder Beutel wird getestet; Anwendungsfälle; Versorgungsauftrag; Persönlicher Bezug; Großlabor, Forschungsinstitution, Großlieferant Aktion Knochenmarkspende Bayern: https://akb.de/ Alle Infos auf https://www.blutspendedienst.com Anmerkungen und Fragen an hello@washeldentun.de

Habt ihr euch jemals gefragt wie Wissenschaftler immer zu ihren Forschungsergebnissen gelangen? Sei es Forensik, Umweltwissenschaften, Pharmazeutika, … Kochen, Kosmetika und noch viele mehr. Chemische Aufreinigung und Analyse steht im Zentrum dieser Frage und ich gebe euch mit diesem Zweiteiler meinen Versuch diese Frage zu beantworten. Dies ist der erste Teil des Zweiteilers, der sich mit Aufrienigungsmethoden beschäftigt. Willst du einen Kommentar zu dieser Episode oder zu diesem Podcast abgeben oder hast du einen Vorschlag für ein Thema, dann gibt es drei Möglichkeiten. Entweder schreibe mir auf Twitter unter @alltagschemie, hinterlasse mir einen Kommentar auf meiner Webseite unter https://alltagschemie152167746.wordpress.com/oder schicke mir einfach altmodisch eine Email auf chem.podcast@gmail.com. Quellen Aufreinigungstechniken · https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_purification_methods_in_chemistry · Advanced Practical Organic Chemistry 2nd Edition, J. Leonard, B. Lygo, G. Procter, 1998, ISBN 0-7487-4071-6 DDT · https://en.wikipedia.org/wiki/DDT Microplastik · https://www.nationalgeographic.org/encyclopedia/microplastics/ Zentrifugation · https://www.youtube.com/watch?v=KEXWd3_fM94 · https://www.youtube.com/watch?v=XAhBzUosvsU Gefriertrocknung · https://en.wikipedia.org/wiki/Freeze-drying

Cronobacter spp. sind opportunistische pathogene Erreger, die insbesondere nach der Aufnahme kontaminierter Lebensmittel schwere Infektionen mit hohen Letalitätsraten bei Neugeborenen und immungeschwächten Erwachsenen hervorrufen können. Um spezifische immunchemische Nachweisverfahren für diese Keimgruppe zu etablieren, wurden in der vorliegenden Arbeit monoklonale Antikörper (mAK) zum Nachweis von Cronobacter spp. generiert und umfassend charakterisiert. Zur Präparation der Immunogene wurden Cronobacter-Keime mit Polymyxin B behandelt und anschließend wurden Mäuse entweder mit dem durch Zentrifugation erhaltenem Zellpellet (Ghosts) oder mit dem zellfreien Überstand (Lysat) dieser Präparationen immunisiert. Beide Präparationen erwiesen sich als hoch immunogen, die nachweisbaren Titer lagen üblicherweise bei > 1:10.000. Insgesamt konnten 14 stabile Hybridomzelllinien (sieben je Ansatz) etabliert werden. Die Intra- bzw. Inter-Genus-Spezifität und Affinität der entsprechenden mAK wurde umfassend unter Verwendung von indirekten EIA-Verfahren überprüft. Für Studien zur Epitopspezifität der generierten mAK wurden Immunoblots und Immunfluoreszenz-Analysen eingesetzt. Alle mAK, die aus der Immunisierung mit Cronobacter-Ghosts resultierten, zeichneten sich durch ein sehr breites Reaktionsspektrum aus, Kreuzreaktionen wurden vorzugsweise mit Vertretern aus der Familie der Enterobacteriaceae aber auch mit anderen gramnegativen Keimen beobachtet. Für alle mAK konnten Proteine als antigene Determinanten identifiziert werden, die relativen Molekulargewichte reaktiver Proteinbanden lagen üblicherweise im Bereich von > 40 kDa. Demgegenüber zeigten sechs der sieben mAK, die aus der Immunisierung von Mäusen mit Polymyxin B generierten Lysat-Präparationen resultierten, eine hohe Affinität für die O-spezifische Seitenkette der Cronobacter-typischen Lipopolysaccharide (LPS): mAK 2G4 αL reagierte hochspezifisch mit dem C. turicensis-Stamm (MHI 21026; Serotyp O1). Im indirekten EIA war dieser Erreger bei Keimzahlen von ca. 104 KbE/ml noch nachweisbar. Für die weiteren fünf mAK, die alle spezifisch mit C. sakazakii des Serotyps O1 reagierten, wurden im indirekten EIA Nachweisgrenzen im Bereich von 105-107 KbE/ml ermittelt. Alle mAK gegen LPS gehören zum IgG-Subtyp und reagierten in der Immunfluoreszenz mit lebenden Cronobacter-Keimen.

Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung des CK/AST-Quotienten im Rahmen der Diagnostik von Muskelerkrankungen bei Rindern zu klären. Im Speziellen sollte geprüft werden, ob es möglich ist, mithilfe einer einmaligen Messung der CK- und AST-Aktivität im Blutserum und Kenntnis des Verhältnisses von CK- und AST-Aktivität im Muskel die Zeitspanne zu berechnen, die seit dem Muskeltrauma mindestens verstrichen sein muss. Weiterhin sollte berechnet werden, wie hoch die Aktivität der beiden Enzyme im Serum maximal war und wie viel Muskelmasse bei dem Trauma zerstört wurde. Zunächst wurden von 60 weiblichen Rindern mit einem Alter von 18 Monaten oder älter nach der Euthanasie Proben aus insgesamt sieben Skelettmuskeln genommen, um den CK- und AST-Gehalt in verschiedenen Muskeln zu bestimmen. Bei den ausgewählten Rindern durfte keine Muskelerkrankung diagnostiziert worden sein. In unterschiedlicher Anzahl wurden beprobt: Mm. adductores (n = 57), M. biceps femoris (n = 60), M. extensor carpi ulnaris (n = 9), M. sternomandibularis (n = 28), M. gastrocnemius (n = 13), M. semimembranosus (n = 13), M. quadriceps femoris (n = 13). Die Muskelproben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C tiefgefroren. Nach dem Auftauen wurden die Muskelproben in einem Mixer zerkleinert, mit physiologischer Kochsalzlösung im Verhältnis 1:10 verdünnt und mithilfe eines Ultraturrax homogenisiert. Im Anschluss an die Zentrifugation wurden die Aktivitäten von CK und AST im klaren Überstand mithilfe des Roche/Hitachi 912 E Analyzers bei 37°C gemessen. Aus den erhaltenen Werten wurde dann der mediane CK/AST-Quotient in jedem Muskel berechnet. Der CK/AST-Quotient variierte in den untersuchten Muskeln zum Teil stark. Im Einzelnen war der Quotient in den Mm. adductores (m = 59,7) signifikant niedriger als im M. biceps femoris (m = 86,1; p = 0,04) und im M. quadriceps femoris (m = 114,6; p = 0,03). Außerdem war der CK/AST-Quotient in den Mm. adductores hoch signifikant niedriger (p < 0,01) als im M. semimembranosus (m = 137,4). Der mediane CK/AST-Quotient im M. extensor carpi ulnaris betrug 75,7, im M. sternomandibularis 74,3 und im M. gastrocnemius 88,5. Die Einteilung der beprobten Rinder in drei Altersgruppen ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede weder im CK- noch im AST-Gehalt in den Mm. adductores und im M. biceps femoris zwischen den einzelnen Gruppen. Der Vergleich des Muskelenzymgehalts verschiedener Rinderrassen zeigte dagegen, dass Tiere der Rasse Braunvieh (m = 5780 IU/g, n = 6) einen 2,5 mal höheren medianen CK-Gehalt in den Mm. adductores aufwiesen als Tiere der Rasse Fleckvieh (m = 2300 IU/l, n = 40). Dieser Unterschied war statistisch signifikant (p = 0,03). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden retrospektiv die Daten von 164 weiblichen Rindern mit erhöhten CK- und AST-Aktivitäten im Serum ausgewertet mit dem Ziel, die Halbwertszeiten von CK und AST zu ermitteln. Es wurden nur Tiere ausgewählt, welche 18 Monate oder älter waren, keine stark erhöhten Leberwerte hatten und bei denen mindestens zweimal eine Serumprobe untersucht worden war. Die für die Halbwertszeiten der beiden Enzyme ermittelten Werte zeigten eine starke Variation. Der Median der für die CK ermittelten Halbwertszeiten betrug 37,85 Stunden, derjenige der AST 110,81 Stunden. Die kürzeste gefundene Halbwertszeit für die CK war 7,73 Stunden, für die AST war sie 8,65 Stunden. Bei 60 von den 164 ausgewerteten Tieren stieg die AST-Aktivität im Serum noch an, während die CK-Aktivität bereits abfiel. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die AST langsamer aus Muskelzellen freigesetzt wird als die CK und dass die beiden Enzyme nicht zeitgleich ihre Maximalaktivität im Serum erreichen. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass der CK/AST-Quotient in verschieden Muskeln unterschiedlich ist. Dies scheint unter anderem daran zu liegen, dass sich Muskeln in ihrem CK-Gehalt unterscheiden. In dieser Studie war vor allem der CK-Gehalt in den Mm. adductores im Vergleich zu den anderen untersuchten Muskeln deutlich geringer. Die Berechnung des Zeitpunktes, an dem ein Muskeltrauma eingetreten ist, sowie der dabei zugrundegegangenen Muskelmasse und der initialen Enzymaktivität im Serum mithilfe des CK/AST-Quotienten ist also nur möglich, wenn der geschädigte Muskel bekannt ist.

Plazentablut kann unter anderem zur autologen Transfusion von Frühgeborenen verwendet werden. Dabei ist die Kontamination von Plazentablut ein wichtiger limitierender Faktor für die klinische Verwendung. In dieser Studie wurde die Kontaminationsrate von Plazentablutentnahmen untersucht, wobei die Kontamination sowohl für vaginale Geburten als auch für Sectio-caesarea-Geburten getrennt bestimmt wurde. Weiterhin sollte herausgefunden werden, ob es eine Blutfraktion gibt, die für den Kontaminationsnachweis am sensitivsten ist und ob alle Kontaminationen durch eine mikrobiologische Untersuchung an Tag 1 erfaßt werden. Dazu wurde bei 117 Geburten (89 vaginale Geburten, 28 Sectiones caesareae) das Plazentablut nach Durchtrennung der Nabelschnur mit der Plazenta noch in utero durch Punktion der Nabelschnurvene gewonnen. Hierzu wurde das Cord Blood Set MXT 2206DC der Firma Maco Pharma International GmbH verwendet. Das Vollblut wurde nach Zentrifugation mit dem Müller-Krüssel-System in die Komponenten Erythrozytenkonzentrat, Buffy coat und Plasma aufgetrennt. Diese drei Fraktionen wurden an drei Tagen (1, 3, 35) auf aerobe und anaerobe bakterielle Kontamination untersucht, wobei an Tag 1 zusätzlich auch noch das Vollblut überprüft wurde. Dafür wurden Kulturflaschen mit je 3 ml der entsprechenden Fraktion beimpft und mit dem Bactec-Gerät sieben Tage bei 35°C überwacht. Es wurde eine Gesamtkontamination von 28,2% (33/117) festgestellt, wobei vaginale Geburten zu 33,7% und Sectiones caesareae zu 10,7% kontaminiert waren. Am ersten Untersuchungstag konnten 28 Kontaminationen erfaßt werden. Die restlichen fünf Kontaminationen wurden erst an Kontrolltag 3 nachgewiesen. Das Buffy coat unterscheidet sich beim Kontaminationsnachweis signifikant von den anderen Fraktionen. In ihm konnten 63,6% der Gesamtkontamination erfaßt werden. Die nachgewiesenen Bakterien waren Keime der normalen Hautflora und der Vaginal- bzw. Perinealregion, wobei am häufigsten Koagulase negative Staphylokokken auftraten. Außerdem konnte beim Vergleich der Kontaminationshäufigkeiten der einzelnen Klassen in dieser Studie ein Einübungseffekt festgestellt werden. Die zum Teil erhobenen Entzündungsparameter ließen keine sicheren Rückschlüsse auf eine eventuelle Kontamination der Plazentablutproben zu. Das durchschnittlich entnommene Plazentablutvolumen betrug ca. 60 ml. Die Gesamtkontamination von 28,8% ist im Vergleich zu anderen Studien hoch. Das kann zum Teil dadurch erklärt werden, daß in dieser Studie die Nachweismöglichkeiten durch mehrere Untersuchungen (Tag 1, 3, 35) und durch die einzeln untersuchten Blutfraktionen besser ausgeschöpft wurden. Wie diese Studie zeigt, konnten unter Verwendung des Bactec-Systems bei nur einer Untersuchung nicht alle Kontaminationen erfaßt werden. Weiterhin zeigen die vorliegenden Ergebnisse, daß im Buffy coat die höchste Nachweisrate erzielt wurde. Somit sollte am besten immer das angewendete Endprodukt auf eine bakterielle Kontamination untersucht werden und zusätzlich wenn möglich immer noch das Buffy coat mituntersucht werden. Bei einer Plazentablutentnahme sollte also immer mindestens das Erythrozytenkonzentrat untersucht werden. Überdies ist es anzuraten ein speziell trainiertes Entnahmeteam für die Gewinnung von Plazentablut einzusetzen, um die Kontaminationsrate auf ein Minimum zu senken.

Zusammenfassung Einleitung Mikrosphären (MS) gelten als Standardmethode zur Messung des regionalen Blutflusses. Hierzu werden MS linksatrial injiziert. Sie verteilen sich dann im arteriellen Teil des Blutkreislaufes. Die Anzahl der in den präkapillären Gefäßen festgehaltenen MS ist direkt proportional der regionalen Organdurchblutung. Da die bisherige Markierung der MS mit instabilen Nukliden die Nachteile des Umgangs mit Radioaktivität mit sich brachte, hat man in den letzten Jahren versucht, die MS mit Fluoreszenzfarbstoffen (FM) zu beladen. Diese neue Art der Markierung erfordert allerdings, daß die FM quantitativ aus den Organproben zurückgewonnen werden müssen. Dies geschah bisher mittels Filtration oder Sedimentation. Beide Methoden bieten jedoch Nachteile. Ziel unserer Studie war es, eine neue Methode zu entwickeln und deren Verarbeitungsprozess zu automatisieren. Dazu wurde ein Filtrationsgefäß entwickelt, das die Probenverarbeitung (Gewichtsbestimmung, Verdauung, Filtration, Spülung und Farbstoffauslösung) in einem einzigen Gefäß zuläßt und hierbei die vollständige Rückgewinnung der FM aus der Organprobe sicherstellt. Material und Methodik: Die von uns am Institut für Chirurgische Forschung entwickelte Sample Processing Unit (SPU) – gebrauchsmustergeschützt - besteht aus drei Untereinheiten: Filterhalter, Filter und Probengefäß. Der essentielle Bestandteil der SPU ist der Filter, der mit einem Polyamid-Filtergewebe (Maschenöffnung 7µm) ausgestattet ist. Das von uns entwickelte Verarbeitungsprotokoll sieht folgende Schritte vor: Die Gewebeprobe wird in den Filter gelegt und das Probengewicht bestimmt. Der Filter wird dann in ein Edelstahlkochgefäß gestellt und zur Verdauung des Gewebes werden 15 ml Digestionsflüssigkeit (4N KOH mit 0,02% Tween) und 1,5 ml Isopropanol 100% hinzugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation bei 60°C ist das organische Material vollständig aufgelöst und die FM schwimmen in der Zwischenschicht zwischen KOH und Isopropanol. Mit Hilfe von Unterdruck wird die Flüssigkeit durch das Filtergewebe filtriert. Dadurch kommen die FM auf der Membran zu liegen. Der später von den FM ausgelöste Fluoreszenzfarbstoff benötigt ein neutrales Umgebungsmilieu. Hierzu müssen alle KOH-Rückstände aus dem Filter entfernt werden. Dies geschieht mittels eines Phosphatpuffers (29.9g K2HPO4 in 800ml aqua dest. vermischt mit 5.88g KH2PO4 in 200ml aqua dest.), der auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist. Mit 15 ml dieses Puffers wird die gesamte Innenfläche des Filters abgespült. Durch kurzes Eintauchen des Filters in den Puffer wird auch die Außenfläche von den KOH-Resten befreit. Nach Trocknung des Filters durch Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff mit 2 ml eines organischen Lösungsmittels (2-Ethoxyethyl acetat - Cellosolve) aus den FM ausgelöst. Durch erneute Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff im Sammelgefäß aufgefangen und die Fluoreszenzintensität in einem Fluoreszenzspektrometer (LS50B, Perkin Elmer, Überlingen, Deutschland) bestimmt. Die Konzentration des Farbstoffes läßt auf die Anzahl der FM rückschließen, welche wiederum direkt proportional zum Blutfluß in der untersuchten Gewebeprobe ist. Der Proportionalitätsfaktor wird durch eine Blutreferenzprobe bestimmt, die während der Injektion der FM aus der Aorta thoracalis unter konstanter Pumpenzuggeschwindigkeit (Harvard Pump, Harvard Apparatus South Nattick, USA) entnommen wird. Diese Blutprobe kann ohne vorherige Verdauung unter Koagulationsschutz (CPDA mit dem Hauptbestandteil Citrat) direkt filtriert werden. Der Farbstoff wird mittels Cellosolve aus den Mikrosphären ausgelöst und die Fluoreszenzintesität bestimmt. Experimente Zunächst wurden die FM und die SPU in vitro Tests unterzogen. Bei den FM wurde mit Hilfe einer Verdünnungsreihe die Proportionalität zwischen der Anzahl der FM und der Fluoreszenzintensität untersucht. Die SPU und die dazugehörige Verarbeitungsmethode wurden einer Wiederfindungsstudie unterzogen. Dabei wurde dieselbe Anzahl von FM aller Farben in Filter und Glasröhrchen pipettiert. Die Filter durchliefen den gesamten Verarbeitungsprozeß. Das Filtrat und die Wände der Filter wurden auf die Präsenz von FM hin kontrolliert. Die Farbstofflösung, welche aus den 40 Filtern gewonnen wurde, wurde mit einer Referenzgruppe (Glasröhrchen ohne Probenverarbeitung, n=20) verglichen. Zur in vivo Validierung der SPU erfolgten an narkotisierten Schweinen (n=8) sechs simultane Injektionen von radioaktiv markierten 15µm MS (RM) (Niob, Strontium, Scandium, Indium, Cerium und Chrom) und 15µm FM (blue, bluegreen, yellowgreen, orange, red, scarlet) zu verschiedenen Zeitpunkten. Nach der Entnahme von Leber und Nieren, wurden diese Organe nach einem vorgegebenen Schema disseziert. Der regionale Blutfluß wurde anhand der Protokolle sowohl für RM (SCHOSSER et al. 1979) als auch FM bestimmt. Zunächst wurde die Radioaktivität der Proben im g-Counter (Canberra Packard, Frankfurt a.M., Deutschland) ermittelt. Hierauf wurde nach Verarbeitung der Organgewebe in der SPU die Fluoreszenzintensität mit Hilfe des Fluoreszenzspektrometers gemessen. Der Vergleich mittels beider Methoden erhobener Meßwerte wurde mit dem Bland-Altman-Plot durchgeführt. Hierbei wird das arithmetische Mittel der Blutflüsse, die durch FM- und RM-Methode berechnet worden sind, gegen die prozentuale Abweichung der FM von den RM aufgetragen. Zur Kontrolle der Filterfunktion und der Zuverläßigkeit der Meßergebnisse wurde die gleiche Anzahl (ca. 2500 FM) einer nicht im Experiment verwendeten 15 µm FM-Spezies (crimson), sowohl in SPU-Filter (SPU-Gruppe, n = 60), als auch in 20 Glasgefäße (Referenzgruppe, n = 20) gegeben. Die SPU wurden dem gesamten Protokoll der Probenverarbeitung unterzogen, wohingegen in der Referenzgruppe lediglich der Farbstoff ausgelöst und gemessen wurde. Die Gruppen wurden mittels t-test nach Student, p0,98). Die Filter weisen eine Wiederfindungsrate von 100% auf. Im Eluat fanden sich keine 15µm FM; zwischen der Filtergruppe und der Referenzgruppe besteht kein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenzintensität. Es zeigt sich eine sehr gute Vergleichbarkeit beider Methoden. In den Bland-Altman Plots für die Nieren- und Leberproben wichen die Blutflußwerte mit der FM-Methode um 8,2 bis 13,4% vom mittleren Fluß (arithmetisches Mittel aus RM und FM) ab. Dabei betrug die mittlere Differenz beider Methoden zwischen -7,4% und 3,8%. Der Vergleich der mittleren Intensitäten der Kontrollfarbe crimson zwischen der Referenzgruppe (9,32±0,74, n=20) und der SPU- Gruppe (9,38±0,98, n=60) ergab keinen signifikanten Unterschied. Diskussion und Schlußfolgerung Mit der SPU ist es möglich, FM vollständig aus Organproben zurückzugewinnen und dadurch den regionalen Blutfluß quantitativ zu bestimmen. Die errechneten Blutflusswerte der radioaktiven und fluoreszierenden Methoden sind miteinander vergleichbar. Somit stellen die FM eine valide Alternative zu RM unter Vermeidung der Problematik des Umgangs mit Radioaktivität dar. Der entscheidende Vorteil der SPU ist, daß der gesamte Verarbeitungsprozeß im selben Gefäß stattfindet, und so der Verlust von FM nahezu ausgeschlossen ist.Das standardisierte Protokoll der Probenverarbeitung mittels SPU vermindert im Vergleich zu früheren Protokollen die Bearbeitungszeit von ca. 24h bzw. 48h auf ca. 6h und reduziert die Arbeitsschritte bei denen große Präzision gefordert ist. Das Design der SPU ermöglicht eine Automatisierung der Probenverarbeitung und somit eine Arbeitserleichterung, da die Von-Hand-Bearbeitung nur noch auf das Befüllen der SPU reduziert wird

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.