Podcasts about proteomebene

Das Mantelzelllymphom (MCL) ist eine neoplastische Erkrankung des blutbildenden Systems, die durch die ektopische Expression des Zellzyklus-regulierenden Proteins Cyclin D1 charakterisiert ist und im Regelfall durch eine chromosomale Translokation t(11;14)(q13;q32) ausgelöst wird. Trotz stetiger Verbesserungen der Behandlungsmethoden, insbesondere der Optimierung der Kombinationstherapie und dem Einsatz der Anti-CD20-Antikörpertherapie- konnte bislang jedoch keine wesentliche Verbesserung des Gesamtüberlebens erzielt werden. Die Untersuchung der Wirksamkeit und der Wirkmechanismen neuer, molekular ausgerichteter Therapieformen hat daher bei dieser Erkrankung besonders große Bedeutung. Zu diesem Zweck wurde ein 2D-PAGE-basiertes Verfahren zur Analyse der zellulären Proteinspiegel etabliert und durch die Charakterisierung der Unterschiede zwischen zwei Non-Hodgkin-Lymphom (NHL)-Subtypen (MCL und FL) auf Proteomebene validiert. Im Verlauf dieser Tests wurde darüber hinaus die Aussagekraft der 2D-PAGE-Analyse durch die Verwendung von „Proben-Pools“ verbessert, wodurch die Detektion zufallsbedingter molekularer „Bystander“-Aberrationen unterdrückt und ein repräsentativer molekularer Phänotyp charakterisiert werden konnte. Die Zahl solcher unspezifischen Proteinpunkte, die nur in einzelnen Zelllinien des Probenkollektivs nachgewiesen wurden, konnten in den „Proben-Pools“ um >66% gesenkt werden. Im Vergleich der zellulären Proteinspiegel der beiden NHL-Subtypen wiesen 175 von insgesamt 1350 Punkte auf den 2D-PAGE-Gelen Subtyp-spezifisch unterschiedliche Proteinspiegel auf, von denen 38 Punkte durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert wurden. Die identifizierten Kandidatenproteine können grob 7 funktionellen Gruppen (Apoptose / Zelltod, Reparaturmechanismen, Zellzyklus und Proliferation, Regulation der Transkription, grundlegende zelluläre Funktionen, Tumor-Antigene, unbekannte Proteinfunktion / hypothetische Proteine)zugeordnet werden und interagieren vorwiegend in einem Netzwerk um den Tumorsuppressor p53. Das Verfahren der 2D-PAGE-Analyse mit massenspektrometrischer (MS) Proteinidentifizierung wurde anschließend benutzt, um die molekulare Wirkung des Proteasomen-Inhibitors Bortezomib auf MCL (Zelllinien und primäre Patientenzellen) zu analysieren. Dazu wurden 5 MCL-Zelllinien (Granta519, HBL-2, Jeko-1, NCEB-1 und Rec-1) einer Bortezomib-Konzentration von 25nM ausgesetzt und die Veränderungen der zellulären Proteinspiegel nach 1h und 4h mit denen von unbehandelten Zellen verglichen. In dieser Analyse waren die Proteinspiegel von 148 der insgesamt 1013 in allen MCL-Zelllinien nachweisbaren Proteinpunkten nach Bortezomib signifikant verändert. Durch MS konnten 38 der 41 reproduzierbar nachweisbaren Proteinpunkte identifiziert werden, wobei 20 ausschließlich in Bortezomib-sensitiven Zelllinien veränderte Spiegel aufwiesen. Eine Western Blot-Analyse von 17 der 38 identifizierten Proteine bestätigte in 76% die in 2D-PAGE-Gelen beobachteten Veränderungen der Proteinspiegel. Alle Zelllinien zeigten veränderte Spiegel von verschiedenen Hitzeschockproteinen (HSPA9, HSP7C, HSPA5, HSPD1), während Zelllinien die auf eine Behandlung mit Bortezomib ansprachen, auch veränderte Proteinspiegel bei Parametern des Energiestoff-wechsels (ATP5B, AK5, TPI1, ENO2, ENO3, ALDOC, GAPDH), der RNA- und Transkriptionsregulation (HNRPL, SFRS12) und der Zellteilung (NEBL, ACTB, SMC1A, C20orf23) sowie der Tumorsuppressoren ENO-1 und FH aufwiesen. Diese Proteine konnten in einem engen Interaktionsnetzwerk um das wichtige zelluläre „Checkpoint“-Molekül p53 gruppiert werden. Entsprechend konnten diese Ergebnisse in primären MCL-Patientenproben bestätigt werden, was die Rolle dieser Proteine im Rahmen der Proteasomeninhibition beim MCL unterstreicht.

Der Erfolg einer Gravidität hängt von einem komplexen Zusammenspiel molekularer Faktoren von Gameten, Embryonen und Feten mit ihrer maternalen Umgebung ab. Eine intakte embryo-maternale Kommunikation ist die Voraussetzung für die Entstehung und Aufrechterhaltung der Trächtigkeit. Von den molekularen Signalen, die an dieser Interaktion beteiligt sind, sind bis heute nur wenige bekannt. Für ein besseres Verständnis dieser molekularen Faktoren beim Rind wurden auf maternaler Seite embryo-induzierte Veränderungen des Endometriums am 18. Tag der Trächtigkeit auf Proteomebene untersucht. Diese so genannte Periimplantationsphase wurde anhand monozygoter Zwillinge analysiert. Jeweils einer der beiden Zwillinge erhielt einen Transfer zweier in vitro produzierter Blastozysten, der korrespondierende Zwilling bekam einen Scheintransfer und diente als nicht trächtige Kontrolle. Endometriumproben dreier Zwillingspaare wurden mit der zweidimensionalen Differenz-Gelelektrophorese (2D-DIGE) in Kombination mit der Minimalmarkierung untersucht. Um als biologisch relevant angesehen zu werden, mussten die Protein-Spots die folgenden strengen Kriterien erfüllen: Abundanzfaktor ≥ 2; Spots in allen Gelen vorhanden; Student’s t-Test p ≤ 0,01. Vier abundanzveränderte Protein-Spots konnten detektiert und mittels PMF und MALDI-TOF/TOF Analyse identifiziert werden: Die Isocitrate Dehydrogenase 1 (NADP+, soluble) spielt eine Rolle bei der Vorbereitung des Endometriums auf die Implantation. Acyl-CoA-binding Protein ist ein wichtiges Element des Steroidmetabolismus. Rho GDP Dissociation Inhibitor beta interagiert mit Proteinen der Rho-Familie, wobei Rho A an der Implantation beteiligt ist. 20 α Hydroxysteroid-Dehydrogenase ist am Progesteron-Metabolismus beteiligt. Die vier trächtigkeitsrelevanten Proteine lieferten interessante Kandidaten für weiterführende Untersuchungen. Die erfolgreiche Entstehung der Trächtigkeit basiert jedoch nicht nur auf der Vorbereitung der maternalen Umgebung, ebenso essentiell ist die präzise Entwicklung männlicher und weiblicher Gameten. Eine korrekte Eizellreifung stellt die Grundlage für eine erfolgreiche Befruchtung und die darauf folgende Embryonalentwicklung dar. Da in vivo eine Analyse der Oozytenmaturation nicht durchführbar ist, wurde auf der embryonalen Seite die In-vitro-Maturation (IVM) boviner Oozyten auf Proteomebene untersucht. Die IVM ist beim Rind eine routinemäßig durchgeführte Prozedur und der erste und limitierende Schritt für assistierte Reproduktionstechniken (ART) wie die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen. Die Eizellreifung ist definiert als die Phase von der Vollendung der ersten Reifeteilung bis zur Metaphase der Meiose II. Oozyten wurden aus Ovarien präpariert und in vitro maturiert. Auf Proteomebene wurden ungereifte mit in vitro gereiften bovinen Oozyten verglichen. Aufgrund der Limitierung der Probenmenge (10 – 20 Oozyten pro Ovar = 0,9 – 1,8 µg Protein) wurde eine 2D-DIGE-basierte Analyse mit der ultra-sensitiven Sättigungsmarkierung durchgeführt. So konnten die quantitativen Analysen mit nur 0,5 µg Gesamtprotein pro 2D-Gel durchgeführt werden. Sechs unabhängige biologische Replikate von ungereiften bzw. gereiften Oozyten wurden analysiert. Die Auswertung der Analyse nach den oben genannten Kriterien ergab die Detektion von 38 abundanzveränderten Proteinen, von denen zehn mittels nano-LC-MS/MS Analyse eindeutig identifiziert werden konnten: Dihydrolipoamide S-Succinyltransferase und 6-Phosphogluconolactonase sind Enzyme des Energiemetabolismus. Translationally-controlled Tumor Protein könnte bei der Wiederaufnahme der Meiose eine Rolle spielen. Clusterin interagiert mit Komponenten des Komplementsystems und könnte eine Schutzfunktion vor Komplement-vermittelten Abbauprozessen haben. Peroxiredoxin-3 und Glutathion S-Transferase Mu5 sind in das Redox-System involviert. Durch den 2D-Gel-basierten Ansatz war es möglich, drei Formen der Glutathion S-Transferase zu detektieren. Elongation Factor 1 gamma und das Protein 14-3-3 ε sind in den Regulationsmechanismus des Maturation Promoting Factor (MPF) involviert. MPF ist ein Schlüsselenzym der Zellzykluskontrolle. Einige dieser abundanzveränderten Proteine, die während der IVM boviner Oozyten detektiert wurden, könnten wichtige Hinweise zur Optimierung bestehender in vitro Kultursysteme geben. Die abundanzveränderten Proteine, die in den hier durchgeführten 2D-basierten Analysen detektierten werden konnten, sind interessante Kandidaten für weitere, tiefer gehende Analysen im Zusammenhang mit der embryo-maternalen Kommunikation.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Proteomstudien an Halobacterium salinarum durchgeführt, die sich generell in drei unabhängige Themenblöcke unterteilen lassen. Zunächst erfolgte die Erfassung des cytosolischen Proteoms auf standardisierten 2-D Gelen. Hierfür wurde die Auftrennung auf sogenannten Zoom-Gelen aufgrund der engen pI-Verteilung halobakterieller Proteine etabliert. Die erschöpfende Analyse der so aufgetrennten Proteine wurde mit der peptide mass fingerprinting Methode im Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. So konnten so 40% des zugänglichen cytosolischen Proteininventars identifiziert und auf Referenz 2-D Gelen kartiert werden. Des Weiteren konnten die massenspektrometrischen Proteinidentifizierungen zur intensiven Verbesserung der in vielen Fällen nicht eindeutigen Genomannotation herangezogen werden. Durch die Korrelationsanalyse von experimentellen und theoretischen pI-Werten konnten weitere Annotationsfehler behoben werden. Das Zusammenspiel von Genomik und Proteomik erlaubte die Identifizierung eines Bereichs ehemaliger Plasmid DNA, die in das Chromosom eingewandert ist. Weiter konnte für ein Plasmid gezeigt werden, dass dieser ehemalig chromosomale DNA und somit eine Reihe wichtiger und essentieller Gene enthält und deshalb eher als zweites Chromosom angesehen werden sollte. Nach der Inventarisierung folgten Analysen zur differentiellen Expression cytosolischer Proteine in Abhängigkeit unterschiedlicher Wachstumszustände. Hierbei wurde das aerobe Wachstum unter Standardbedingungen mit Wachstum unter Mangelbedingungen wie in synthetischem Medium oder unter anaeroben phototrophen Bedingungen verglichen. Bei der Analyse dieser Zustände mittels 2-DE konnten nur wenig regulierte Proteine identifiziert werden. Generell stellte sich die 2-DE aufgrund schwankender Reproduzierbarkeit und des geringen dynamischen Bereichs der gewählten Färbemethode für diese vergleichenden Analysen als wenig geeignet heraus. Die Verwendung isotopenmarkierter Sonden erlaubte hingegen einen detaillierten Einblick in die Regulationen auf Proteomebene unter besagten Bedingungen. Mit dem methodischen Ansatz der 1D-SDS PAGE LC-MALDI-TOF/TOF Analyse konnten von einem beträchtlichen Teil (ca. 40%) des cytosolischen Proteoms Regulationsinformationen erhalten werden. Auch hier zeigte sich, dass unter anaeroben phototrophen Bedingungen überraschend wenige Proteine reguliert werden müssen, damit sich der Organismus auf diese Lebensbedingung einstellen kann. Wachstum unter Nährstoffmangel in synthetischem Medium induziert überwiegend Proteine der Aminosäure- und Nukleotid-Biosynthese sowie Proteine, die am Proteinschutz und der Glykolyse beteiligt sind. Unter Standardwachstum wurden Proteine als induziert identifiziert, die bei nicht ausreichendem Vorhandensein wachstumslimitierend wirken würden. Dies waren hauptsächlich Enzyme der Thiamin und Cobalamin Biosynthese sowie des Peptid-Transportes und -Abbaues. Auch die CO2-Fixierung und die nachfolgende Gluconeogenese sind induziert. Durch die Verwendung unterschiedlicher Proteomik Ansätze konnte am Ende der Großteil der cytosolischen Proteine von H. salinarum identifiziert werden. Es scheinen nahezu alle chromosomalen Proteine auch unter Standard Wachstumsbedingungen expremiert zu werden, was starke Regulationen der Proteinkonzentrationen in Abhängigkeit unterschiedlicher Lebensbedingungen nicht notwendig macht. Der Organismus kann sich so schnell ohne großen energetischen Aufwand an wechselnde Lebensbedingungen anpassen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum untersucht. Hierbei konnten zunächst über radioaktive in vivo Markierung phosphattragende Proteine identifiziert werden. Ebenfalls gelang es, die ersten halobakteriellen Serin und Threonin Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Generell zeigte sich jedoch, dass das Ausmaß der Proteinphosphorylierung in H. salinarum eher gering ist. Bei den identifizierten Phosphorylierungen handelte es sich ausschließlich um katalytische Zwischenprodukte. Für die Existenz von regulativen Ser/Thr oder Tyr Proteinphosphorylierungen waren keine eindeutigen Hinweise zu finden. Weiter gelang es, eine Vielzahl von N-terminal acetylierten Proteinen als eine weitere Form der posttranslationalen Modifikationen zu identifizieren.