Podcasts about zellschwellung

In einer Zelle sorgen volumenregulatorische Prozesse wie eine RVD (regulatory volume decrease) und RVI (regulatory volume increase) durch Konstanterhaltung des Volumens für die Aufrechterhaltung der normalen Zellfunktionen. Bisherige Untersuchungen haben gezeigt, dass an der Volumenregulation eine zelluläre Abgabe und Anhäufung von organischen aber auch anorganischen Osmolyten beteiligt sind. Diese werden bei der RVD beim Übergang von Antidiurese zu Diurese von der Zelle abgegeben und bei der RVI beim Wechsel des Diuresestatus in die umgekehrte Richtung akkumuliert. Als Modellstrukturen wurden hierbei vor allem etablierte Zelllinien, wie die von A6- und MDCK-Zellen, eingesetzt. Das wesentliche Ziel dieser Arbeit bestand darin, mit Hilfe der Elektronenstrahlmikroanalyse die Änderung in der Elementzusammensetzung von A6-Zellen nach hypotonem Stress quantitativ erfassen zu können. Zudem sollte ermittelt werden, ob A6-Zellen nach der Wiederherstellung von isotonen Bedingungen zu einer RVI befähigt sind. Der hypotone Stress wurde entweder durch eine abrupt oder kontinuierlich Absenkung der Osmolarität von 260 auf 140 mosmol/l eingeführt. Die Bestimmungen wurden dann 2 und 60 Minuten nach der Einführung sowie 2 und 30 Minuten nach Reperfusion mit isotoner Lösung durchgeführt. Außerdem erfolgten Messungen nach kontinuierlicher Absenkung der Osmolarität von 260 auf 200 bzw. 140 mosmol/l. Die anschließende Elektronenstrahlmikroanalyse der zellulären Elementzusammensetzung erfolgte an gefriergetrockneten Kryoschnitten mittels eines energiedispensiven Röntgendetektors in einem Rasterelektronenmikroskop. Hierbei können alle in Frage kommenden Elemente gleichzeitig erfasst werden. Da die Bremsstrahlung der Röntgenspektren ein Maß für die Masse darstellt, konnten ferner Aussagen über Variationen des zellulären Trockengewichts und somit zur Zellvolumenveränderung getroffen werden. Die Elementbestimmungen nach dem hypotonen Stress führten zu folgenden Ergebnissen und Aussagen: 1. Obwohl sich die A6-Zellen während der ersten 2 Minuten nach Einsetzen des hypotonen Stress weitgehend wie ideale Osmometer verhalten, ist es im Rahmen einer RVD bereits zu einem gewissen zellulären Verlust von Na, K und Cl gekommen. 2. 60 Minuten nach Einsetzen des hypotonen Stresses hat sich das zelluläre Volumen nach einer initialen Zellschwellung (160% nach 2 Minuten) wieder dem Kontrollwert angenähert (120%). 3. Der Verlust an kleinen einwertigen anorganischen Ionen (Na, K und Cl) trägt zu 70% zu dem Osmolytverlust bei, der notwendig ist um das neu eingestellte Zellvolumen zu erklären. 4. Hypotoner Stress führt im Rahmen der RVD nicht nur wie bisher angenommen zu einem zellulären Verlust von KCl, sondern auch zur Abgabe von Na. 5. Der Verlust an Na und K ist beträchtlich größer als der von Cl, was auf eine Beteiligung zellulärer Puffer an der RVD hindeutet. 6. Bei einer kontinuierlichen Absenkung der basolateralen Osmolarität wird eine IVR in Gang gesetzt, so dass das Zellvolumen nach Herabsetzung der Osmolarität von 260 auf 140 mosmo/l nur um 20% größer ist als unter Kontrollbedingungen. 7. Qualitätiv und quantitativ ist der Verlust an kleinen anorganischen Ionen während der IVR mit dem bei der RVD identisch. Die folgenden Ergebnisse, die nach der Wiederherstellung von isotonen Bedingungen erzielt wurden, lassen den Schluss zu, dass auch A6-Zellen zu einer RVI fähig sind: 1. Nach dem Wechsel von hypotonen zu isotonen Bedingungen kommt es nach einer anfangs drastischen Zellschrumpfung zu einem signifikanten Wiederanstieg des Zellvolumens. 2. Dieser Volumenanstieg kann allein durch eine zelluläre Anhäufung von KCl erklärt werden, die primär durch die Aktivität eines basolateralen bumetanidsensitiven Na-K-2Cl-Kotransporters in Gang gesetzt wird.

Das zytotoxische Hirnödem ist eine wichtige Manifestation des zerebralen Sekundärschadens nach zerebraler Ischämie und Schädel-Hirn-Trauma. Der Analyse von Schwellungs- und Schädigungsmechanismen auf zellulärer Ebene in vivo ist durch die Komplexität der zeitgleich ablaufenden Ereignisse enge Grenzen gesetzt. Für die vorliegenden Experimente wurde deswegen ein in vitro Modell verwendet, welches die Untersuchung von C6-Gliomzellen als Einzelzellsuspension unter definierten und kontrollierten Bedingungen bei Veränderung verschiedener Parameter erlaubt. In den letzten Jahren konnten am Institut für Chirurgische Forschung anhand dieses Modells einige Mediatoren des zytotoxischen Ödems in vitro identifiziert werden. Die vorliegende Arbeit ist eine Fortsetzung der durchgeführten Untersuchungen zur Aufklärung der Mechanismen der zytotoxischen Zellschwellung. Sie befasst sich mit der Frage, welchen Einfluß freie Sauerstoffradikale (ROS) auf das Zellvolumen und die Zellvitalität von C6-Gliazellen in vitro haben. Freie Sauerstoffradikale werden unter akuten pathologischen Bedingungen vermehrt im Gehirn freigesetzt. Sie erzeugen durch ihre starke Reaktionsfähigkeit vielfältige pathophysiologische Wirkungen im Gehirn, die zur Zerstörung von Zellmembranen, Oxidation zellulärer Strukturen und DNS-Strangbrüchen führen. Für die Analyse des im Mittelpunkt stehenden Parameters Zellvolumen wurde die Durchflußzytometrie eingesetzt. Die Vitalität der Zellen wurde anhand der Trypanblau-Ausschlußmethode ermittelt. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde der Einfluß von Wasserstoffperoxid (H2O2) auf das Volumen und die Vitalität von C6-Gliomzellen untersucht. Die Zellvolumenänderung von C6-Gliomzellen durch H2O2 unterliegt einer Dosis-Wirkungsbeziehung. 0,1 mM H2O2 bewirkte über den Beobachtungszeitraum von 120 Minuten keine Volumenänderung. Ab einer Endkonzentration von 0,5 mM H2O2 kam es zu einer raschen Zellvolumenabnahme. Es folgten biphasische Verläufe der Volumenänderungen unter 0,5, 1,0 und 5,0 mM H2O2. Das Zellvolumen erreichte nachfolgend das Ausgangzellvolumen. Unter der Applikation von 5,0 mM H2O2 kam es in der zweiten Stunde des Beobachtungszeitraumes zu einer signifikanten Zellschwellung. 84 In weiteren Versuchen induzierten wir oxidativen Stress extrazellulär durch das Enzym Xanthinoxidase mit dem Substrat Hypoxanthin (HX/XOD) in den Enkonzentrationen 1 mM HX, 10 oder 20 mU/ml. HX/XOD provozierte in beiden Versuchsreihen eine prompte Abnahme des Zellvolumens auf Werte um 90% des Ausgangszellvolumens. Das Zellvolumen zeigte während des Beobachtungszeitraumes keine Rückregulation, wie in den Versuchen mit H2O2. XOD 10 mU/ml ohne HX zeigte einen ähnlichen Verlauf der Volumenänderung. Die Applikation von HX alleine bewirkte keine Volumenänderung. Mit dem Pharmakon Menadion (MQ), das Zellmembranen passieren kann, induzierten wir oxidativen Stress intrazellulär. Menadion wurde in den Enkonzentrationen 25 und 50 µM verwendet. Während nach Applikation von 25 µM Menadion keine Volumenänderung bei C6-Gliomzellen zu verzeichnen war, provozierte 50 µM Menadion eine signifikante Zellschrumpfung nach einer Latenzphase von 100 Minuten. Eine extrazelluläre Laktatazidose von 6,8 führte, wie bereits bekannt, zu einer Schwellung von C6-Gliomzellen auf 115% des Ausgangswertes. Die Zellvitalität blieb unverändert. In Kombination mit oxidativem Stress mittels HX/XOD 1/10 mM/mU/ml, zeigte sich eine dazu spiegelbildlich verlaufende Zellschrumpfung. Offensichtlich hemmen freie Radikale demnach die Mechanismen die zur azidoseinduzierten Zellschwellung führen, wie z.B. den Na+/H+-Antiporter. Diese Annahme haben wir mit dem Na+/H+-Inhibitor Amilorid bestätigt. Die radikalinduzierte Zellvolumenänderung konnte mit Amilorid fast vollständig gehemmt werden. Die Vitalität der C6-Gliomzellen zeigte in keiner der Versuchreihen eine Abnahme über den gesamten Beobachtungszeitraum. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass freie Sauerstoffradikale in vitro zu einer Schrumpfung von C6-Gliomzellen führen. Die Ergebnisse legen somit den Schluß nahe, dass freie Sauerstoffradikale nicht an der Pathogenese des zytotoxischen Hirnödems beteiligt sind. Freie Sauerstoffradikale sind allerdings in der Lage, die Clearence-Funktion von Gliazellen zu stören. So konnten ROS die Aufnahme von H+-Ionen (zusammen mit der konsekutiven Aufnahme von Na+-Ionen) und die daraus folgende kompensatorische Zellschwellung hemmen. Freie Radikale scheinen also nicht direkt toxisch zu wirken, sondern über die Hemmung Astrozyten-vermittelter neuroprotektiver Mechanismen, wie z.B. die Clearence von H+ aus dem Extrazellulärraum. Weitere Untersuchungen müssen diesen Anfangsverdacht im Detail klären.

Die vorliegenden Untersuchungen stellen eine Fortsetzung langjähriger Versuche am Institut für Chirurgische Forschung dar, zellbiologische Mechanismen des zytotoxischen Hirnödems zu klären. Bislang konnten in einem in vitro Modell von Gliazellen verschiedene Mediatoren einer Gliazellschwellung im Sinne eines zytotoxischen Hirnödems charakterisiert werden. Darunter unter anderen eine Laktazidose – in Schweregraden wie sie bei Schädel-Hirn-Traumen und zerebralen Ischämien vorkommt. Ursächlich konnten sowohl der Na+/H+-Antiporter wie auch ein Chlorid- und Bikarbonat-abhängiges Transportsystem identifiziert werden die zur Akkumulation osmotisch aktiver Solute (Na+ und Cl-) in der Zelle führen und somit eine Zellschwellung bedingen. In der vorliegenden Arbeit sollten der Azidose-induzierten Schwellung zugrundeliegende Mechanismen, d.h. Membrantransporter und –kanäle weitergehend charakterisiert werden. Dabei wurde ein Schwerpunkt auf Anionentranporter und die Rolle von Kalziumionen gelegt. Die Untersuchungen erfolgten am Modell suspendierter C6 Gliomzellen als Modellzelle für Astrozyten. Durchflusszytometrisch wurde das Zellvolumen bestimmt ebenso der intrazelluläre pH unter Zuhilfenahme des pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffes BCECF. Die Ergebnisse lassen sich folgendermaßen zusammenfassen: Setzt man C6 Gliomzellen einer Laktazidose von pH 6,2 aus, so kommt es zur prompten Zellschwellung die nach 60 min ihr Maximum bei 125,1 % des Ausgangsvolumens erreicht. Gleichzeitig kommt es zum Absinken des intrazellulären pH (pHi). Analoge Versuche in Chlorid- bzw. Bikarbonat-freiem Medium gingen mit einer deutlichen Hemmung der Azidose-induzierten Schwellung einher. Das Absinken von pHi war ebenfalls geringer ausgeprägt. Ähnliche Ergebnisse ließen sich mit den Inhibitoren des Cl-/HCO3--Antiporters DIDS und Niflumat erzielen. Die Zusammenschau dieser Ergebnisse lässt sie Schlussfolgerung zu, dass im Rahmen der Azidose-induzierten Schwellung der Na+-unabhängige Cl-/HCO3--Antiporter aktiv ist und zur Akkumulation von Chlorid in der Zelle führt und somit zur Zellschwellung beiträgt. Unter physiologischen Bedingungen hingegen ist der Na+-abhängige Cl-/HCO3--Antiporter aktiv und trägt zur Regulierung des ´steady state` pHi bei. In weiteren Versuchen konnte erstmals unter Verwendung der Na+-K+-Cl--Kotransportinhibitoren Bumetanid und Furosemid eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Azidose-induzierten Schwellung nachgewiesen werden. Beide Inhibitoren führten zur deutlichen Reduktion der Zellschwellung ohne relevante Einflüsse auf den intrazellulären pH. Die Aktivierung des Transporters in Azidose führt zur Akkumulation der transportierten Ionen Natrium, Kalium und Chlorid in der Zelle, die dort als osmotisch wirksame Teilchen einen Wassereinstrom nach sich ziehen und auf diesem Wege zur Zellschwellung führen. Daneben wurde eine Abhängigkeit der Azidose-induzierten Schwellung von extrazellulären Kalziumionen gefunden. In Kalzium-freiem Medium ist ausschließlich die Zellschwellung deutlich reduziert während der Verlauf des intrazellulärem pH dem der Kontrollgruppe entsprach. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass extrazelluläre Kalziumionen für die Aktivierung eines pH-unbeeinflussenden Transporters wie z.B. den Na+-K+-Cl--Kotransport notwendig sind. Die Chelierung intrazellulärer Kalziumionen hatte keinen Effekt auf die Azidose-induzierte Schwellung und den intrazellulären pH. Damit konnten die vorliegenden Untersuchungen die Bedeutung des Cl-/HCO3--Antiporters im Rahmen der Azidose-induzierten Schwellung näher charakterisieren und die Beteiligung des Na+-K+-Cl--Kotransportes erstmals nachweisen. Ebenfalls konnte die Bedeutung extra- nicht jedoch intrazellulärer Kalziumionen für die Azidose-induzierte Schwellung gezeigt werden.

In der Einleitung wird die pathologische Anatomie und Physiologie der Speiseröhrenachalasie nach den bis heute vorliegenden Untersuchungsbefunden wiedergegeben. Der derzeitige Stand des histologischen Aufbaus der normalen Speiseröhrenwand wird beschrieben. Nach einer ausführlichen Darlegung der bereits in der Literatur vorhandenen mikroskopischen und submikroskopischen Untersuchungsergebnisse der Speiseröhrenwand bei der Achalasie wird an Hand von 6 eigenen Fällen pathohistologisch die Art der qualitativen und quantitativen Veränderungen des intramuralen Nervensystems der Speiseröhre insbesondere des Speiseröhrenabschnitts unterhalb der Dilatation in Verbindung mit den Veränderungen der übrigen Strukturelemente der Speiseröhrenwand in diesem Bereich geprüft und beschrieben. Diese Untersuchungen an Gewebsstücken aus dem Übergangsbereich Oesophagus - Magen führten zu folgendem Ergebnis: Die Mukosa aus dem Übergangsbereich Oesophagus - Magen eines Achalasiefalles bietet keinen Anhalt für ausgeprägte entzündliche Veränderungen. Die Längs- und Ringmuskelschicht der Tunica muscularis im Übergangsbereich Oesophagus - Magen weist in allen 6 Fällen eine deutliche Hypertrophie,leichte Dissoziation der Muskelfasern und Vermehrung des Bindegewebes zwischen denselben auf. In 2 von 6 Fällen finden sich kleine ovale bis runde Infiltrate polymorphkerniger Leukozyten in den Muskelfaser-bündeln. Bei einigen Fällen sind zwischen den Muskelfaser-bündelchen vereinzelt Erythrozyteninfiltrate zu beobachten. Im Stratum intermusculare der Tunica muscularis lassen sich teils oedematöse Dissoziation, teils Vermehrung des Bindegewebes oder Sklerose in allen Fällen nachweisen. 2 der 6 Fälle zeigen um die Gefässe sowie diffus im Bindegewebe verstreut Ansammlungen polymorphkerniger Leukozyten. In einem Teil der Fälle sieht man eine vermehrte Vascularisation des intermuskulären Bindegewebes und Verdickung der Gefäßwände. Gelegentlich kann man auch Erythrozyteninfiltrate nachweisen, die wie jene im Bereich der Tunica muscularis sicher bei der Praeparatexcision entstanden sind. In einigen Fällen sind vereinzelt leicht gequollene Achsenyzlinderbruchstuecke eingestreut. Umgeben von diesen Bindegewebsverhältnissen besteht bei den meisten Ganglionanschnitten mehr oder weniger deutliche Kern- bzw. Zellzunahme pro Flächeneinheit, die zum größten Teil auf das Auftreten und die Dichte von Zellen mit spindelförmigen, längsovalen, runden und polymorphen Kernanschnitten und zum geringsten Teil auf Rundzellinfiltrate zurückzuführen ist. Die Zunahme der Zellen mit spindelförmigen, längsovalen, runden und polymorphen Kernen pro Flächeneinheit der im Schnitt getroffenen Ganglien trägt proliferativen Charakter. Die Ganglionanschnitte zeigen teilweise das Bild der Vernarbung, in einigen Fällen das Bild der Dissoziation. Nur ein Teil der im Schnitt getroffenen Ganglien enthält Ganglienzellen,sie können sogar vollkommen fehlen. Auch in Bezug auf den ganglienzellhaltigen Ganglionanschnitt lässt sich eine Verminderung in der Anzahl der Ganglienzellen feststellen. Die Ganglienzellen zeigen teils normales Aussehen, teils pathologische Veränderungen im Sinne feinkörniger oder grobkörniger Zellschwellung mit ganz vereinzelter Hauptdendritenschwellung oder im Sinne einer Kolliquationsnekrose. Ferner lassen sich an den Stellen zugrunde gegangener Nervenzellen Hüllzellknötchen nachweisen. Gelegentlich findet man in den Ganglionanschnitten neuromartige Proliferation praeganglionärer Nervenfasern. In den Anschnitten primärer extraganglionärer Faserstränge treten vorwiegend Zellen mit spindelförmigen und polymorphen Kernen auf. Bei einzelnen primären Faserbündeln kann man eine Dissoziation oder Schwellung derselben beobachten. In einzelnen Fällen besteht körniger oder vakuoliger Zerfall der in die Remak'schen Fasern eingeschmiegten Achsenzylinder. Bei einem Fall last sich eine Infiltration polymorphkerniger Leukozyten innerhalb des Anschnitts eines primären Faserstrangs nachweisen. Ferner wird an 4 Kaninchen experimentell die Frage geprüft, ob durch die therapeutische Dehnung der unteren Speiseröhre und der Kardia Zerreißungen der Muskelwand und damit Veränderungen an ihren nervösen Elementen entstehen können, welche möglicherweise das histologische Untersuchungsergebnis beeinflussen. Dabeihaben die histologischen Untersuchungen der Praeparate aus dem untersten Oesophagus und dem Übergangsbereich Oesophagus - Magen vor und nach der Dehnungsbehandlung bei Kaninchen folgendes ergeben; Das durch experimentelle Dehnung erzeugte histologische Bild gleicht doch in keinem Fall den pathohistologischen Befunden von nicht gedehnten Frühfällen der Achalasie und von Achalasiefällen bei denen das Praeparat erst nach Dehnungsbehandlung bei einer später durchgeführten Operation entnommen wurde. Es ist daher anzunehmen, dass eine vorausgegangene therapeutische Dehnung des untersten Oesophagus und des Übergangsbereichs Oesophagus - Magenbei der Achalasie das pathohistologische Geschehen nur geringfügig beeinflussen wird. Aus den in der Literatur vorliegenden und eigenen histologischen Befunden,die in den einzelnen Wandschichten und Wandabschnitten der an Achalasie erkrankten Speiseröhre erhoben worden sind, lässt sich das folgende pathohistologische Gesamtbild ableiten: In der Tunica mucosa, Tunica submucosa, Tunica muscularis und besonders im Stratum intermusculare sind bei der Achalasie von den ersten Krankheitstagen an entzündliche Prozesse nachzuweisen, denen Veränderungen und Zerstörungen einzelner Gewebselemente folgen. Es werden einerseits das Muskelgewebe und das interstitielle Bindegewebe, andererseits die Nervenstrukturen der Oesophaguswand betroffen. Als Endzustand findet man eine ausgesprochene Sklerose oder wenigstens eine Vermehrung des Bindegewebes in der Submukosa, zwischen den Muskelbündeln, den einzelnen Muskelzellen und im Stratum intermusculare. Ferner wird Hypertrophie, Atrophie, hyaline Degeneration, Nekrose oder Verkalkung der Muskelfasern beobachtet. Im submikroskopischen Bild bestehen nur mehr restliche Kontakte zwischen den einzelnen glatten Muskelzellen durch Protoplasmabrücken und Membrankontakte. Zudem kommt es zu ausgedehnter Vakuolisierung des Zytoplasmas glatter Muskelzellen. Im Bereich der Ganglien kommt es zu degenerativen Veränderungen an den Ganglienzellen (Zellschwellung, Hauptdendriten-schwellung, Kolliquationsnekrose), wobei die Veränderungen bis zum restlosen Ausfall der Ganglienzellen (Hüllzellknötchenbildung) reichen können. Eine Neuropilemstruktur ist in letzterem Falle innerhalb des Ganglion nicht mehr nachweisbar. Sie wird durch Narbengewebe in Form von proliferierenden Zellen mit spindelförmigen, ovalen,runden und polymorphen Kernen ersetzt. Vereinzelt kann man in den Ganglien neuromartige Proliferation präganglionärer Nervenfasern erkennen. Die primären extraganglionären Faserstränge zeigen gelegentlich Dissoziation oder Schwellung und in einzelnen Fällen körnigen und vakuoligen Zerfall der Nervenfasern. Für die Megaoesophagusfälle im Rahmen der Chagaskrankheit kann die Ätiologie der pathohistologischen Veränderungen als geklärt gelten. Die entzündlichen Prozesse und die Plexuszerstörung im Bereich der ganzen Speiseröhrenwand lassen sich bei der Chagaskrankheit auf das Neurotoxin bzw. die toxischen Zerfallsprodukte des Trypanosoma cruzi zurückführen. Bei den Megaoesophagus- bzw. Achalasiefällen, die nicht mit einer Chagaserkrankung in Verbindung gebracht werden können und bei denen noch keine Toxine anderer Krankheitserreger oder andere Ursachen für die pathohistologischen Veränder-ungen des Plexus und anderer Elemente der Speiseröhrenwand ermittelt wurden, bleibt die Erstursache weiterhin unbekannt.