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In der vorliegenden Arbeit wurde die Tyrosinphosphatase hVH-5 nach Genveränderungen untersucht. Als Mitglied der Familie der dual-spezifischen Phosphatasen ist hVH-5 (homologue of vaccinia virus H1 phosphatase gene clone 5) an der Signaltransduktion der Zelle durch Dephosphorylierung von stress-aktivierter Proteinkinase (SAPK) und p38 beteiligt. Aufgrund seiner Rolle als potentielles Tumorsuppressorgen können Genveränderungen oder Fehlregulationen von hVH-5 zur Entstehung von Tumoren beitragen. Wie bereits bekannt ist, zählt die Lokalisation dieses Gens auf Chromosom 11p15.5 zu häufig beobachteten Loss Of Heterozygosity (LOH)-Regionen bei Krebserkrankungen, u.a auch bei Brustkrebs. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Expressionsanalyse der hVH-5 Phosphatase in Normalgewebe und Brustkrebszelllinien durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass hVH-5 nicht nur, wie schon bekannt, in humanem Gehirn, Herz und Skelettmuskel transkribiert wird, sondern eine Trankription darüber hinaus auch noch in 10 weiteren humanen Geweben sowie in allen untersuchten Brustkrebszelllinien nachgewiesen werden konnte. Um ein zeitsparendes und effektives Mutationsscreening zu ermöglichen, wurde eine neue Methode, Conformation Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE), etabliert. Dadurch konnte bereits im ersten Exon dieser Phosphatase eine Heteroduplexbildung als Hinweis auf eine Genveränderung sichtbar gemacht werden. Mittels Sequenzierungs- sowie Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus-Analyse konnte die exakte Nukleotidsequenz bestimmt werden. Es wurde festgestellt, dass es sich hierbei um eine bisher unbekannte Gensequenz eines prozessierten Pseudogens der hVH-5 Phosphatase handelt. Prozessierte Pseudogene sind dadurch definiert, dass sie typischerweise durch einen Verlust des Promotors transkriptionell inaktiv sind. Eine Datenbankrecherche (Sanger Center) ermöglichte die Lokalisation des Pseudogens auf Chromosom 10q22.2. Phylogenetische Analysen führten zu dem Ergebnis, dass das Gen vor ca. 6,8 Mio. Jahren entstanden sein müsste. Es konnte gezeigt werden, dass das in dieser Arbeit beschriebene Pseudogen von hVH-5 (ψhVH-5) entgegen der Definition eines Pseudogens in gesunden menschlichen Geweben transkribiert wird. Diese Tatsache deutet auf eine evtl. funktionelle Bedeutung dieses Gens hin. Weiterhin konnte ein möglicher Zusammenhang zwischen der Transkription des Pseudogens und der Entstehung von Brustkrebs nicht ausgeschlossen werden, da dieses in drei von 14 untersuchten Brustkrebszelllinien nicht transkribiert wird. Aus der Übersetzung der Nukleinsäuresequenz von ψhVH-5 in Aminosäuren resultierte ein Peptid von 8.8 kDa, welches sich stark vom hVH-5 Wildtyp unterscheidet und keinerlei funktionelle Domänen aufweist. Es konnte weder ein Nachweis des transient überexprimierten Proteins noch eines in vivo translatierten Proteins erbracht werden. Die Akkumulation der zahlreichen Mutationen im Pseudogen verglichen mit dem Wildtyp deutet stark darauf hin, dass dieses Gen in der Evolutionsgeschichte aufgrund fehlender funktioneller Bedeutung zumindest zeitweise keinem Selektionsdruck unterlag oder aber sich zu einem selbständigen Gen mit noch unbekannter Funktion weiterentwickelte. In der vorliegenden Arbeit konnten Hinweise dafür gebracht werden, dass ψhVH-5 sich möglicherweise derart entwickelt hat, um durch andere Regulationsmechanismen, beispielsweise solche, die für nicht-kodierende RNAs bekannt sind, mit dem Wildtypgen der hVH-5 Phosphatase zu interagieren.

Die Inaktivierung des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressors spielt eine Rolle in der Entstehung von verschiedenen gut- und bösartigen Tumoren mit hoher Gewebespezifität. Als substraterkennende Untereinheit des CBCVHL Ubiquitin Ligase Komplexes steuert VHL den sauerstoffabhängigen Abbau des Transkriptionsfaktors HIF1/2α. HIF1/2α aktiviert die Transkription einer Vielzahl von Faktoren, die für den Energiehaushalt der Zelle und die Blutgefäßneubildung von entscheidender Bedeutung sind. Die Akkumulation von HIF1/2α führt zu deren konstitutiver Expression und fördert somit das Wachstum von Tumoren durch eine verbesserte Nährstoffversorgung. Der sauerstoffabhängige Mechanismus der HIF-Erkennung wird durch die Aktivität einer neuen Familie von Prolylhydroxylasen reguliert, die möglicherweise ihrerseits eine Reihe von zellulären Substraten haben. Trotz der guten Korrelation zwischen bestimmten, den HIF-Abbau beeinflussenden VHL-Mutationen und dem Auftreten von verschiedenen Krankheitssubtypen sind noch nicht alle Phänotypen im Zusammenhang mit VHL erklärbar. Vor allem die Identifizierung neuer Substrate für den CBCVHL Komplex ist für ein umfassendes Verständnis der VHL-Krankheit von Interesse. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Methoden zur Identifizierung neuer Substrate von VHL angewendet. Durch Affinitätschromatographie mit einem rekombinanten Komplex aus VHL, Elongin B und Elongin C (VCB) konnte Daxx als neuer Interaktor von VHL identifiziert werden. Daxx bindet Elongin B/C-unabhängig an VHL, und seine Stabilität wird nicht durch VHL reguliert. Zudem bildet Daxx einen Komplex mit dem VHL-Substrat HIF1α. Dies weist auf eine mögliche Funktion von VHL neben seiner Rolle als Ubiquitin Ligase hin, z.B. in der Regulation von Daxx als transkriptionellem Repressor. In einem funktionalisierten „TwoHybrid“-Screen konnte der Mechanismus der HIF-Regulation in S. cerevisiae rekonstituiert werden. Dies ermöglichte die Identifizierung weiterer potentieller VHL-Substrate, unter anderem Diacylglycerol Kinase iota (DGKι). DGKι weist zwei Erkennungsmotive für Prolylhydroxylasen auf und wird in Gehirn und Retina exprimiert. In diesem Organen kommt es bei VHL-Patienten zur Entstehung von Hämangioblastomen. DGKι wird in vivo ubiquityliert und bindet sowohl an VHL, als auch an zwei der drei bekannten Prolylhydroxylasen. Mit Mutanten von DGKι konnte allerdings gezeigt werden, dass Bindung und Ubiquitylierung nicht über den gleichen Mechanismus erfolgen wie bei HIF1α. Möglicherweise spielen Ubiquitylierung und VHL-Bindung getrennte Rollen in unterschiedlichen zellulären Prozessen. Es wird zunehmend deutlicher, dass VHL nicht nur eine Komponente des CBCVHL Komplexes bildet, sondern weitere Funktionen in der Zelle erfüllt. VHL spielt eine Rolle in der Assemblierung der Fibronektinmatrix, der Regulation von Mikrotubulistabilität und –dynamik und der Transkriptionskontrolle. Eine weitere Charakterisierung des nicht-degradativen Einflusses von VHL auf die in dieser Arbeit beschriebenen Bindungspartner ist nötig, um die zelluläre Wirkungsweise von VHL vollständig zu verstehen.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen polaren Wachstums im phytopathogenen Basidiomycet Ustilago maydis. Zunächst wurde die zelluläre Rolle des t-SNAREs Yup1 analysiert. Ein temperatursensitiver Defekt im yup1-Gen hatte zu Störungen in der Zelltrennung und im polaren Wachstum von Sporidien geführt. Mutante Zellen bildeten dabei lange verzweigte Ketten aus verdickten Zellen. Die Lokalisation eines Yup1-GFPFusionsproteins auf beweglichen Organellen hatte zum Aufstellen eines spekulativen Modells geführt, bei dem Yup1 auf Endosomen die Fusion mit ankommenden endozytotischen Vesikeln vermittelt. Eine erstmalige Charakterisierung der Endozytose von U. maydis in dieser Arbeit zeigte, dass es sich bei den mit Yup1-GFP markierten, schnellen Organellen tatsächlich um frühe Endosomen handelte. Diese akkumulierten Zellzyklus-abhängig an Regionen aktiven Wachstums in BSDs. Die Akkumulation früher Endosomen im Apex von Hyphen war für das Spitzenwachstum erforderlich. In yup1ts-Zellen war bei restriktiver Temperatur eine gestörte Endozytose zu beobachten. Dieser Zusammenhang zwischen Zellmorphologie und polarer Sekretion einerseits und Endozytose andererseits deutete darauf hin, dass Membranrecycling über frühe Endosomen entscheidend am polaren Wachstum von U. maydis-Zellen im Speziellen und pilzlichen Hyphen im Allgemeinen mitwirkt. Mittels des Yup1-GFP-Fusionsproteins konnten die molekularen Grundlagen der beobachteten Bewegung von Endosomen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass sich frühe Endosomen entlang von MT bewegen. Für diese Bewegung war in erster Linie das Kinesin Kin3 verantwortlich. Dieses Molekül ist ein neues Mitglied der Unc104/KIF1-Familie von Kinesin-ähnlichen molekularen Motoren und bewegt als solches vermutlich in Richtung der plus-Enden von MT. Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass Kin3 in der Zelle als Monomer vorliegt. Die N-terminale Motordomäne zeigte in vitro eine MTstimulierte ATPase Aktivität. Ein Kin3-GFP-Fusionsprotein lokalisierte in schnell beweglichen Flecken, die im Bewegungsverhalten den frühen Endosomen glichen. Ein Kin3-YFP-Fusionsprotein bewegte entlang von MT und kolokalisierte zudem mit einem Yup1-CFP-Fusionsprotein auf Endosomen. Die Deletion von kin3 führte zu einer starken Reduzierung der Endosomenbewegung. Die in vivo-Untersuchung der MT-Dynamik im Δkin3-Stamm ergab, dass der Großteil der Endosomen in Akkumulationen an den minus-Enden der MT konzentriert war. Entsprechend führte die Überexpression von kin3 zu einer verstärkten Konzentration der Endosomen an den plus-Enden von MT. Die Zellform einzelner Sporidien war im kin3-Deletionsstamm nicht verändert. Allerdings trennten sich die Zellen nach der Teilung wie in der yup1ts-Mutante nicht voneinander. Dieser Trennungsdefekt und ein verändertes Knospungsmuster führten zur Bildung von großen Baum-ähnlichen Zellaggregaten. Im Hyphenstadium führte die Deletion von kin3 außerdem zu einer deutlichen Störung des polaren Wachstums. Die nach Deletion von kin3 beobachtete Restbewegung der Endosomen beruhte fast ausschließlich auf der Aktivität des zytoplasmatischen Dyneins von U. maydis. Das konventionelle Kinesin von U. maydis, Kin2, zeigte ebenfalls einen Einfluss auf die Organisation und Position endosomaler Akkumulationen, obwohl es vermutlich nicht direkt am Transport einzelner Endosomen beteiligt ist. Die präsentierten Daten zeigen, dass Endosomen MT- und Zellzyklus-abhängig organisiert sind. Die Position der BSDs korrelierte dabei mit Funktionen der Endosomen bei der Zelltrennung, in der Bestimmung des Knospungsmusters und beim polaren Wachstum. Da die MT während des Knospenwachstums unipolar ausgerichtet sind, nutzt die U. maydis-Zelle das Wechselspiel des plus-Motors Kin3 und des minus-Motors Dynein, um die Endosomen Zellzyklus-abhängig an den plus- oder minus-Enden der MT zu akkumulieren.