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Exon 12 Nucleophosmin (NPM1) Mutationen stellen die häufigsten molekularen Aberrationen bei Erwachsenen mit akuter myeloischer Leukämie (AML) dar. Molekulare Detektion der Mutation Typ A (NPM1 A), welche 80% aller NPM1 Mutationen ausmacht, könnte für die Bestimmung von minimaler Resterkrankung (MRD) eingesetzt werden. Der molekulardiagnostische Nachweis minimaler Resterkrankung mittels RQ PCR ist von wesentlichem prognostischem Wert, um in Zukunft eine möglichst präzise Abschätzung des individuellen Rezidivrisikos, sowie eine risikoadaptierte Behandlung des Patienten zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein RT PCR-Test für die relative Quantifizierung von NPM1 Mutation A Expressionslevels im Vergleich zu Genlevels des Housekeeping-Gens ABL1 entwickelt. Die Expressionsratios wurden zusätzlich zur Normalisierung über das Referenz-Gen ABL1 über das Expressionsratio von NPM1 A zu ABL1 eines Calibrators normalisiert. Die PCR wurde mithilfe der Zelllinie OCI/AML3, welche positiv für die NPM1 A Mutation ist, etabliert. Der Calibrator entspricht einer Probe OCI/AML3 cDNA. Mithilfe einer Verdünnungsreihe von OCI/AML3 cDNA wurden getrennte Standardkurven für die Amplifikation von NPM1 und ABL1 erstellt. Der Assay hat eine Sensitivität von 10-5, das heißt die letzte nachweisbare Verdünnung von für die Mutation positive cDNA ist 1:100 000. Die Spezifität der PCR konnte mit mehreren Zelllinien, welche negativ für die NPM1 Mutation sind und keine Amplifikation gezeigt haben, nachgewiesen werden. Die Ergebnisse hinsichtlich Sensitivität und Spezifität konnten mit ausgewählten Patientenproben bestätigt werden. Die klinische Anwendung wurde mithilfe von Verlaufsmessungen von 51 NPM1 A positiven Patienten durchgeführt. NPM1 A mRNA Expressionslevel wurden in 154 Knochenmark- und Blutproben zu unterschiedlichen Stadien der Krankheit bestimmt. Bei 27 Patienten, die zum Zeitpunkt der Diagnose und nach Induktionstherapie analysiert worden sind, zeigten die NPM1 A Expressionsratios eine mittlere log10 Reduktion von 2,48. Dieses Ergebnis korreliert mit dem Erfolg der Behandlung, auch sichtbar in der Reduzierung der Blastenzahlen im Knochenmark. Von den 51 Patienten die zur Diagnosestellung untersucht worden sind, erlitten 21 ein Rezidiv. Zwei der 21 Patienten mit Rezidiv verloren die NPM1 A Mutation im Rezidiv, was durch eine Schmelzkurven-PCR bestätigt wurde. Die Beobachtung vom Verlust der Mutation durch klonale Evolution bei 9,5% der untersuchten Probenpaare von Diagnose und Rezidiv limitiert den Wert der NPM1 Mutation als molekularer Marker für MRD.

In der hier durchgeführten Studie „Untersuchungen zur mikrobiellen Besiedlung der Nasenhöhle von Patienten mit chronischer Rhinosinusitis unter besonderer Berücksichtigung von Staphylococcus aureus und Staphylococcus aureus Small Colony Varianten“ sollte das Keimspektrum der chronischen Rhinosinusitis (CRS) beim Menschen, mit Schwerpunkt auf Staphylococcus aureus (Sa) und seinem Small Colony Variant (SCV) -Phänotyp, untersucht werden. Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine häufig vorkommende Erkrankung die bei etwa 5-15 % der Bevölkerung westlicher Industrienationen auftritt. Ihre Ätiologie ist noch unbekannt, allerdings wird als mögliche Ursache eine Infektion mit Bakterien diskutiert. Unter den Bakterien wird dem grampositiven Keim Staphylococcus aureus eine große Bedeutung bei dieser Erkrankung zugeschrieben. In dieser Studie wurden Nasenschleimhautbiopsien und Nasenspülproben von 31 Patienten mit CRS und nasalen Polypen (CRSNP+), 13 Patienten mit CRS ohne nasale Polypen (CRSNP-) und 21 Kontrollpatienten mit verschiedenen mikrobiologischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Studie stellen eine bakteriologische Ursache für die chronische Rhinosinusitis in Frage. Es wird deutlich, dass der normale Phänotyp von Sa keine wesentliche Rolle bei der CRS spielt, da dieser Keim sowohl bei erkrankten als auch bei gesunden Probanden etwa gleich häufig auftrat, bei CRSNP- Patienten sogar in noch geringerer Menge als bei den anderen beiden Gruppen. In keiner der untersuchten Proben konnten SASCV nachgewiesen werden, so dass deren Rolle bei der CRS untergeordnet erscheint. Auf Grund der kleinen Fallzahlen kann von dieser Studie zwar nicht auf die Gesamtbevölkerung geschlossen werden, aber die Ergebnisse geben dennoch Hinweise auf die tatsächliche Situation. Auch bei der Untersuchung der übrigen in den Proben vorkommenden gram-positiven und gram-negativen, aeroben und anaeroben Bakterien konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Beim Vergleich der hier angewandten mikrobiologischen Nachweismethoden, stellte sich heraus, dass die Bakterienkultur im Vergleich zur Real-time PCR und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung die sensitivste Methode war. Die PCR hat allerdings den Vorteil dass auch DNA toter Bakterien nachgewiesen werden kann, und dass sie erheblich schneller durchzuführen ist als die Bakterienkultur. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung an Paraffingewebsschnitten scheint nach den hier vorliegenden Ergebnissen nicht geeignet zu sein, Sa im Gewebe nachzuweisen. Auf diesem Gebiet besteht also noch Bedarf an weiterer Optimierung der Methode an Paraffinschnitten. Neben bakteriologischen Untersuchungen von Patientenproben sollten Auswirkungen des Sa und SASCV- Nachweises auf nasale immunologische Parameter erfasst werden. Hierzu sollte das nasale Zytokinmuster erhoben werden und mögliche Unterschiede der Genexpression bei CRSNP+ Patienten mit Sa- Nachweis untersucht werden. Wie eine Infektion mit Sa bzw. SASCV zelluläre Reaktionen auf Proteinebene beeinflusst und ob Unterschiede zwischen Sa und SASCV in der induzierten Zellantwort bestehen, wurde zusätzlich an humanen monozytären MonoMac-6 Zellen (MM6) und an humanen Atemwegsepithelzellen der Zelllinie BEAS-2B (B2B) untersucht. Eine in vitro Infektion dieser beiden Zelltypen mit verschiedenen Sa- Stämmen führte zu einer unspezifischen Stimulierung der Sekretion aller untersuchten Proteine. Eine Polarisation in Richtung TH1 bzw. TH2, also in Richtung CRSNP- bzw. CRSNP+ konnte nicht festgestellt werden. Auch die Microarrayanalysen von Sa-positiven und Sa-negativen Biopsien von CRSNP+ Patienten zeigen keine vermehrte Expression von Genen für Zytokine die für TH1 oder TH2 polarisieren. Ebenso wurde die Konzentration der in der nasalen Lavage gemessenen Zytokine durch eine Infektion mit Sa nicht beeinflusst und ein TH2 Shift war nicht erkennbar. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass bei der CRS vermutlich zunächst eine Entzündung vorliegt, die dann ggf. die bakterielle Besiedlung fördert, als dass diese Entzündung initial durch eine bakterielle Infektion induziert wird. Es sei aber nochmals darauf hingewiesen, dass hier nur kleine Fallzahlen untersucht wurden. Klarheit könnte eine groß angelegte Studie mit möglichst hohen Patientenzahlen und einer gut charakterisierten Patientenpopulation sowie ggf. die Verwendung molekularer Verfahren zum Nachweis bakterieller Erreger bringen. Diese Studie zeigt, dass eine bakterielle Ursache der CRS unwahrscheinlich ist.

Persistent infizierte (PI) Tiere stellen die wichtigste Transmissionsquelle für BVDV-Infektionen dar. Neuere Studien konnten zeigen, dass sich der Virusnachweis aus Ohrgewebeproben für die sichere und frühzeitige Detektion von neugeborenen PI-Kälbern eignet. Inwieweit transiente Infektionen mit dieser Methode erkannt werden, ist bisher nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die transiente BVDV-Infektion mit Hautgewebeproben zu untersuchen. Im Rahmen eines Tierversuches wurden sechs Kälber intranasal mit BVDV inokuliert. Bei fünf Tieren konnte in der Folge eine transiente Infektion beobachtet werden, deren Verlauf mit verschiedenen Diagnostikmethoden untersucht wurde. Der BVDV-Nachweis gelang mittels Virusisolierung, Erns-Antigen-ELISA und real time RT-PCR in Blutleukozyten, Plasma sowie Nasen- und Speichelsekreten. Die höchste Sensitivität zeigte dabei der RNA-Nachweis mittels PCR. Eine Serokonversion konnte zwischen Tag 17 und 21 nach der Virusinokulation durch Antikörper-ELISA nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung von Hautgewebeproben (Tag 2, 4, 7, 10, 14, 17, 21 p. inf.) konnten nur bei einem Kalb zwischen 2. und 17. Tag p. inf. geringe Mengen Virus-RNA (maximal 4000 RNA-Kopien/Probe an Tag 14 p. inf.) detektiert werden. Aus lysierten Hautproben konnte bei keinem Tier Erns-Antigen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Daten von transient infizierten Rindern aus dem Bayerischen Feldprojekt „Studie zur Eignung der Ohrstanzmethode bei neugeborenen Kälbern zur Bekämpfung der BVD/MD“ näher betrachtet. Bei 22 Tieren ließ sich BVDV mittels PCR sowohl im Ohrgewebe (Ct-Werte zwischen 28 und 39) als auch im Blut nachweisen. Die Ohrstanze von drei dieser Tiere war mit dem Erns-ELISA schwach positiv (OD 0,4 bis 0,5), bei vier Tieren konnten deutlich positive (OD >1,1) Ergebnisse beobachtet werden. Darunter waren auch Kälber, deren Muttertiere in der Spätgravidität mit einer Lebendvakzine geimpft wurden. Auffallend waren weiterhin sechs Tiere, die eine sehr lange Virämie (bis zu 99 Tage p. p.) zeigten. Bei einer weiteren Gruppe (elf Tiere) konnte das Virus nur im Ohrgewebe mit PCR (Ct-Werte zwischen 31 und 35) nachgewiesen werden. Diese Kälber wurden in Herden geboren, in denen später mehrere PI-Tiere geboren wurden. Ein Tier aus der Feldstudie zeigte über ein Jahr hinweg abfallende Virusmengen mittels Virusisolierung, real time PCR und Erns-ELISA in Hautbiopsien, Blutproben und Sekreten. Im Alter von zehn Lebensmonaten konnten mittels PCR im Hodengewebe große Mengen an Virus-RNA (Ct-Wert 21) detektiert werden. Das Virus war aus nur 20 Hodenzellen isolierbar, gleichzeitig erwiesen sich Sekrete und Blut als nicht infektiös in der Zellkultur. Im 14. Lebensmonat gelang nur noch der Nachweis der Virus-RNA in der Haut. Weiterhin konnte ein starker Anstieg homologer neutralisierender Antikörper gegen das persistierende Virus bis zum Titer von 25600 gemessen werden. Insgesamt ist festzustellen, dass transiente fetale und postnatale BVDV Infektionen mittels Hautbiopsien bei jungen Kälbern vereinzelt nachweisbar sind. Die PCR war hierbei deutlich sensitiver als der BVDV-Erns-Antigennachweis. Bei Neuinfektionen in Herden werden transient infizierte Kälber bereits vor den persistent infizierten geboren. Auch nach der Vakzination mit BVDV-Lebendimpfstoff sind transiente Infektionen mittels Untersuchung von Hautbioptaten nachweisbar. Erstmals konnte die fetale Infektion eines männlichen Rindes im Feld mit folgender partieller Immuntoleranz charakterisiert werden, bei dem eine Viruselimination im Blut und auf den Schleimhäuten erfolgte, nicht jedoch im Hodengewebe.