Podcasts about epithelzelle

Die diabetische Nephropathie ist derzeit weltweit der häufigste Grund für die terminale Niereninsuffizienz mit einem Anteil von einem Drittel aller Fälle. Im Verlauf der diabetischen Nephropathie kommt es zu einer zunehmenden Glomerulosklerose. Die Fähigkeit der parietalen Epithelzelle zur Ausbildung von extrazellulärer Matrix und ein möglicher Beitrag zur Glomerulosklerose ist bislang unklar. Daher sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle bei der diabetischen Nephropathie vermehrt extrazelluläre Matrix bildet und dadurch die Bowman’sche Kapsel verdickt. Diese Frage wurde unter Verwendung einer immortalisierten murinen parietalen Epithelzelllinie und einer primären humanen parietalen Epithelzelllinie im Zellversuch und Stimulation dieser Zellen mit hoher Glukosekonzentration (30mM), TGF-β1 und „advanced glycation endproducts“ nachgegangen. Außerdem wurde retrospektiv die Bowman’sche Kapsel von sechs humanen Nierenbiopsien mit diabetischer Nephropathie per Licht- und Transmissionselektronen-mikroskopie untersucht. Im ersten Schritt war die Aktivierung der parietalen Epithelzelle unter diabetischer Kondition Fokus der experimentellen Untersuchung. Hier lag ein zellspezifischer Effekt vor. Während für die humanen parietalen Epithelzellen keine funktionellen oder morphologischen Zeichen der Aktivierung gefunden werden konnte, zeigten murine parietale Epithelzellen eine Aktivierung nach Stimulation mit TGF-β1. Der zweite Schritt bestand in der Untersuchung der Bildung von TGF-β1 in parietalen Epithelzellen. Auch hier konnten unterschiedliche Stimulationseffekte bei den murinen und humanen parietalen Epithelzellen beobachtet werden. Während die humanen parietalen Epithelzellen weder auf Transkriptions-, noch auf Translationsebene eine geänderte Expression zeigten, exprimierten die murinen parietalen Epithelzellen in einem positiven Feedback-Mechanismus auf Transkriptionsebene verstärkt TGF-β1 nach Stimulation mit TGF-β1. Auf Translationsebene konnte eine verstärkte Bildung von TGF-β1 nach Stimulation mit „advanced glycation endproducts“ und eine verminderte Bildung nach Stimulation mit Glukose beobachtet werden. Der dritte Schritt beinhaltete die Untersuchung der Kollagenbildung in den parietalen Epithelzellen und die Vermessung der Bowman’schen Kapsel. Während Glukose in keiner der Zelltypen zu einer Änderung der Kollagengenexpression führte, induzierte TGF-β1 in den humanen und murinen parietalen Epithelzellen eine Hochregulation der Genexpression verschiedener Ketten von Kollagen IV und Kollagen I α 1. „Advanced glycation endproducts“ verstärkten die Transkription der Kollagene in den humanen parietalen Epithelzellen, wohingegen sie diese in murinen parietalen Epithelzellen herunterregulierten. In der retrospektiven histologischen Untersuchung von sechs Patienten mit diabetischer Nephropathie und sechs Vergleichspatienten wurde per Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie die Dicke der Bowman’schen Kapsel vermessen. In den lichtmikroskopischen Messungen zeigte sich für die Patienten mit diabetischer Nephropathie eine signifikant verdickte Bowman’schen Kapsel. Diese Verdickung konnte bei Patienten mit diabetischer Nephropathie in den transmissionselektronenmikroskopischen Messungen bestätigt werden. Letztlich ist die Lichtmikroskopie die geeignetere Messmethode, weil hier eine höhere Anzahl an Glomeruli gemessen werden kann und sie einen Selektionsbias ausschließt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle unter diabetischer Kondition verstärkt extrazelluläre Matrix bildet und diese basal ablagert. In den murinen parietalen Epithelzellen ergaben sich Hinweise auf den Mechanismus der Aktivierung und einen positiven Feedbackmechanismus von TGF-β1 bei der diabetischen Nephropathie. Die Verdickung der Bowman’schen Kapsel ist von klinischer und diagnostischer Bedeutung, da die Ausbildung der parietalen Fibrose viele Funktionen der parietalen Epithelzellen und Bowman’schen Kapsel einschränkt und der Glomerulus letztlich sklerosiert bzw. verödet. Diagnostisch werden künftige Studien den Wert der Dickenmessung der Bowman’schen Kapsel als zusätzliches pathologisches Kriterium der Stadieneinteilung der diabetischen Nephropathie zeigen.

Über entzündliche Veränderungen der Gallenblasenwand bei Patienten mit Cholesterinsteinen im Vergleich zu denen mit Pigmentsteinen und deren Einfluss auf die Komposition der Blasengalle ist wenig bekannt. Daher wurden bei 200 Patienten mit Cholesterin- und Pigmentsteinen entzündliche Veränderungen der Gallenblasenwand durch histologische Auswertung von Gewebsschnitten untersucht. Nach Auswertung der Histologien und Analyse der Konzentration der einzelnen Bestandteile der Blasengalle konnten 164 Galleproben für die Untersuchung verwendet werden. Dabei fanden sich 123 Galleproben von Patienten mit Cholesterin- und Mischsteingallen und 41 Proben von Patienten mit Pigmentsteingallen. Die Einteilung in 4 Entzündungsgrade von E 0 bis E 3 gab eine klare Übersicht über das Ausmaß der histologischen Entzündungszeichen in den Gewebeschnitten. Dabei fiel schon auf, dass im Verhältnis deutlich mehr höher entzündlich veränderte Gallenblasen bei Pigmentsteingallen zu beobachten waren, als bei den untersuchten Cholesterin/Mischsteingallen. 102 (83%) der 123 Patienten mit Cholesterin- oder Mischsteinen und 28 (68%) der 41 Patienten mit Pigmentsteinen zeigten keine oder nur eine geringgradige Entzündung der Gallenblase. (E0-E1). Während bei 21 (17%) der 123 Patienten mit Cholesterin- oder Mischsteinen und bei 13 Patienten (32%) der 41 Patienten mit Pigmentsteinen hohe Entzündungsgrade (E2-E3) beobachtet werden konnten. Bei der statistischen Analyse fand sich in allen beobachteten Fraktionen ein deutlicher Abfall der medianen Konzentrationen aller gemessenen Bestandteile der Blasengalle bei höherem Entzündungsgrad (E2-E3) in der Pigmentsteingruppe, bei hoher statistischer Signifikanz der berechneten Werte. Cholesterin- und Mischsteingallen zeigten deutlich geringere Veränderungen der medianen Konzentrationen der Lipidfraktion im Vergleich der Entzündungsgrade. Auch fand sich keine statistische Signifikanz der Ergebnisse. Das eindrucksvollste Ergebnis bei Cholesterin/Mischsteingallen zeigte die Proteinfraktion. Hier fand sich ein statistisch signifikanter Anstieg der Proteinkonzentration in der Gallenflüssigkeit bei höherem Entzündungsgrad. Bei niedrigem Entzündungsgrad zeigten sich keine großen Unterschiede in den medianen Konzentrationen im Vergleich der zwei betrachteten Gallegruppen. Die Tatsache, dass in der Pigmentsteingruppe prozentual fast doppelt so häufig ein höherer Entzündungsgrad zu beobachten war, lässt sich durch die unterschiedliche Morphologie der Pigmentsteine im Vergleich zu den Cholesterin und Mischsteinen erklären. Pigmentsteine, als Ca-bilirubinatsteine haben eine wesentlich rauere und kantigere Oberfläche als der Cholesterinstein. Zudem findet man bei Pigmentsteinträgern meist eine große Anzahl kleinerer Steine als bei Cholesterinsteinträgern. Die auf das Epithel schädigend und reizend wirkende Oberfläche ist deutlich größer im Falle von Pigmentsteinen, als bei Cholesterinsteinen. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass Pigmentsteine wesentlich stärkere Epithelirritationen und -schädigungen auslösen als Cholesterinsteine. Diese Schädigung führt zu einer traumatisch bedingten Störung der Konzentrationsfähigkeit. So kommt es bei weiterem Zustrom von Lebergalle in die Gallenblase zur Verdünnung der aufkonzentrierten Blasengalle. Der Anstieg der Proteinfraktion im Falle der Cholesterinsteine bei höheren Entzündungsgraden ist erklärbar durch die entzündlich bedingte, biochemisch getriggerte Transformation der Epithelzelle von der Absorption von Flüssigkeit zur Sekretion von Flüssigkeit und Protein. Dies führt zu dem deutlich erkennbaren Anstieg der Eiweißkonzentration in der Blasengalle Wichtig für zukünftige Studien in dem Gebiet ist es zu beachten, dass bei Analysen von entzündlichen Veränderungen der Gallenblasenwand und die mögliche Wechselwirkung auf die Komposition der Blasengalle, Cholesterin/Mischsteingallen getrennt von den Pigmentsteingallen betrachtet werden sollten.

Das Kraftmikroskop hat sich in vieler Hinsicht als effizientes Gerät für Untersuchungen und Manipulationen auf molekularer Ebene erwiesen. Dabei wird selbst unter physiologischen Bedingungen eine Auflösung erreicht, die Proteinsubstrukturen erkennen läßt. Als Kraftspektroskop kann es mechanische Eigenschaften wie Dehnungsverhalten und Reißfestigkeit einzelner Moleküle, die zwischen der Sensorfeder und der Unterlage eingespannt werden, untersuchen. Sogar die Bindungskräfte zwischen einem Molekül am Kraftsensor und einem anderen am Substrat können mittels Kraftspektroskopie mit etwa 3 pN Genauigkeit ermittelt werden. Von besonderem Interesse solcher Untersuchungen sind Moleküle mit spezifischer Affinität nach dem Schlüssel-Schloß-Prinzip, wie Rezeptor-Ligand- Systeme und Adhäsionsmoleküle. Bisher waren hauptsächlich wasserlösliche Moleküle solchen Messungen zugänglich. Bindungen zwischen amphiphilen Proteinen oder Membranproteinen zu messen, die durch hydrophobe Wechselwirkungen in der Membran verankert sind, erfordert neue Konzepte. Diesen Molekülen gilt das Augenmerk dieser Arbeit. Da die Verankerung in sogenanten „supported bi-layern“ und Vesikeln nicht immer zum gewünschten Erfolg führt, wird hier eine ungewöhnliche, aber sehr natürliche Alternative vorgestellt: Das Adhäsionsmolekül wird nicht aufwendig isoliert und der Meßmethode zugänglich gemacht, sondern bleibt in seiner natürlichen Umgebung, der Zelle, wohingegen die Methode angepasst wird. Dies ist durch die Befestigung einer Zelle am Kraftsensor eines Kraftspektroskopes geglückt und es gelang damit erstmals die Adhäsionskraft eines einzelnen Adhäsionsmoleküls in einer lebenden Zelle zu messen. So einfach diese Methode beschrieben ist, so viele Unwägbarkeiten treten dabei durch die hohe Komplexität der Zelle und der Zelloberfläche im Besonderen auf. Daher wird einleitend eine grobe Einführung in die Funktionen und den Aufbau einer Zelle und die üblichen Meßmethoden im Bereich der Zelladhäsionsmessung vorgestellt. Die Beschreibung der Meßmethode und der Umrüstung des Kraftmikroskopes zum Zelladhäsionskraftspektroskop sind durch technische Details im Anhang vervollständigt. Etwas aufwendig ist die Zusammenstellung der Daten, Theorien und Annahmen zum Aufbau eines semi-empirischen Modells zur Beschreibung der Adhäsionskraftmeßkurven beim Trennen adhärierender Zellen, auf der Basis vieler unabhängiger Einzelmolekülbindungen. Mit dem Zelladhäsionkraftspektroskop wurden dafür die Youngs-Moduli und die viskoelastischen Kelvin-Modell-Parameter verschiedener Zellen in dem eigens entwickelten „visko-elastic-response-mode“ vermessen. Ebenso wurden die Einflüsse der Zellkontaktkraft und der Kontaktzeit, sowie der Zuggeschwindigkeit auf die Zelladhäsionsantwort studiert und in Formeln gefaßt. Das Modell simuliert diese Meßdaten in guter Übereinstimmung und gibt dadurch einen Einblick in die physikalischen Randbedingungen für das einzelne Adhäsionsmolekül während solcher Experimente unter Berücksichtigung des zelltypischen Phänomens der Tetherbildung. Insbesondere kann damit die Bindungsdichte bei Adhäsionen auf verschiedenen Oberflächen berechnet werden. Demnach schließt eine Epithelzelle etwa vier Bindungen pro Quadratmikrometer mit einer Glasoberfläche, zwei mit einer anderen Epithelzelle und nur 0,8 mit einer passivierten Oberfläche. Mit kraftspektroskopischen Messungen der Adhäsionskräfte bei der Einnistung eines Trophoblasten in die Gebärmutter an einem naturnahen Laborsystem kann eine andersartige - mit dem Modell unabhängiger Bindungen nicht beschreibbare - Wechselwirkung identifiziert werden. Die Meßergebnisse deuten auf einen kooperativen Prozeß der molekularen Adhäsionsinselbildung hin. Kontrollmessungen an funktionalisierten Oberflächen erhärten diese Hypothese. Mit ersten Ergebnissen von Adhäsionsmessungen zwischen Knochenzellen und potentiellen Implantatoberflächen wird neben dem Einfluß der Oberflächenbeschaffenheit auch der des Meßmediums nachweisbar, wodurch die Generalität dieser Methode verdeutlicht wird. Im letzten Kapitel über die Interaktionen einzelner Zellen wird anhand der induzierten Lektinwechselwirkung zwischen roten Blutkörperchen die prinzipielle Möglichkeit der Zelladhäsionskraftspektroskopie Einzelmolekülereignisse zu vermessen nachgewiesen. Die dafür nötigen geringsten Kontaktkräfte von unter 40 pN, konnten durch extrem weiche Kraftsensoren (