Podcasts about Tubulin

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.06.28.546853v1?rss=1 Authors: Alvarez Viar, G., Klena, N., Martino, F., Nievergelt, A. P., Pigino, G. Abstract: Control of ciliary beating is crucial for motility and signaling in eukaryotic cells and requires spatially restricted interactions between axonemal proteins and specific protofilaments within the ciliary microtubules. How these interactions are regulated remains poorly understood, but increasing evidence indicates that tubulin post-translational modifications (tPTMs) are required for proper ciliary motility. The Tubulin Code refers to the concept that tPTMs can modulate the function of individual microtubules in cells. Here we use a combination of immuno-cryo-electron tomography, expansion microscopy and mutant analysis to show that, in motile cilia, tubulin glycylation and polyglutamylation form mutually exclusive protofilament-specific nano-patterns at sub-microtubular scale. We show that these two nano-patterns are consistent with the distributions of axonemal dyneins and nexin-dynein regulatory complexes, respectively, and are required for their regulation during ciliary beating. Our discovery of a tubulin nano-code in cilia highlights the need of higher-resolution studies also in other cellular compartments to understand the molecular role of tPTMs. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.04.25.538200v1?rss=1 Authors: Peng, Y., Zhang, Y., Fang, R., Jiang, H., Lan, G., Liu, Y., Nie, Z., Zhang, S.-D., Ma, Y., Yang, P., Wang, F., Ge, H.-H., Zhang, W.-D., Luo, C., Li, A., He, W. Abstract: Centromere protein A (CENP-A) is a centromere-specific protein that determines kinetochore positioning and the accuracy of chromosome segregation. Despite its recognized importance in maintaining mitotic fidelity, the molecular details of CENP-A regulation in mitosis are still obscure. We performed a structure-activity relationship (SAR) study of the cell cycle-arresting indole terpenoid mimic JP18 and identified two more potent analogues, (+)-6-Br-JP18 and (+)-6-Cl-JP18. Tubulin was identified as a potential protein target of these two halogenated analogues by using the drug affinity responsive target stability (DARTS) based method. X-ray crystallographic analysis determined that (+)-6-Br-JP18 and (+)-6-Cl-JP18 bind to the colchicine-binding site of beta-tubulin. We further found that treatment of cancer cells with microtubule-targeting agents (MTAs), including these two compounds, upregulated CENP-A by destabilizing Cdh1, an E3 ubiquitin ligase component. The mechanistic study revealed that Cdh1 mediates proteolysis of CENP-A in mitosis, specifying the role of Cdh1 in maintaining mitotic fidelity. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.03.15.532838v1?rss=1 Authors: Kumar, A., Larrea, D., Pero, M. E., Infante, P., Conenna, M., Shin, G. J.-e., Grueber, W. B., Di Marcotullio, L., Area-Gomez, E., Bartolini, F. Abstract: Acetylated microtubules play key roles in the regulation of mitochondria dynamics. It has however remained unknown if the machinery controlling mitochondria dynamics functionally interacts with the alpha-tubulin acetylation cycle. Mitofusin-2 (MFN2), a large GTPase residing in the mitochondrial outer membrane and mutated in Charcot-Marie-Tooth type 2 disease (CMT2A), is a regulator of mitochondrial fusion, transport and tethering with the endoplasmic reticulum. The role of MFN2 in regulating mitochondrial transport has however remained elusive. Here we show that mitochondrial contacts with microtubules are sites of alpha-tubulin acetylation, which occurs through the MFN2-mediated recruitment of alpha-tubulin acetyltransferase 1 (ATAT1). We discover that this activity is critical for MFN2-dependent regulation of mitochondria transport, and that axonal degeneration caused by CMT2A MFN2 associated mutations, R94W and T105M, may depend on the inability to release ATAT1 at sites of mitochondrial contacts with microtubules. Our findings reveal a function for mitochondria in regulating acetylated alpha-tubulin and suggest that disruption of the tubulin acetylation cycle play a pathogenic role in the onset of MFN2-dependent CMT2A. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.21.529351v1?rss=1 Authors: Vyslouzil, D., Bernatik, O., Renzova, T., Bino, L., Lacigova, A., Cajanek, L. Abstract: The initiation of assembly of primary cilia, organelles with crucial functions in development and disease, is under the control of Tau-Tubulin Kinase 2 (TTBK2). Recent work has implicated TTBK2 also in the regulation of primary cilia maintenance and function. However, the mechanisms underlying individual functions of TTBK2 in primary cilia are not fully understood. Here, to dissect the role of TTBK2 in primary cilia maintenance in human cells, we examined disease related TTBK2 truncations. We demonstrate that these truncated protein moieties show selective activity towards TTBK2 substrates. This creates a semi-permissive condition where partial TTBK2 activity suffices to support the initiation of ciliogenesis but fails to sustain primary cilia length. Subsequently, we show that the defects in primary cilia growth are linked to aberrant turnover of kinesin KIF2A at basal body. Furthermore, we demonstrate that TTBK2 regulates KIF2A by phosphorylation, which in turn restrains its levels at the ciliary base to promote primary cilia elongation and maintenance. Taken together, our data highlight the regulation of KIF2A by TTBK2 as an important mechanism governing primary cilia in human cells. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.14.528553v1?rss=1 Authors: Kubo, T., Tani, Y., Yanagisawa, H., Kikkawa, M., Oda, T. Abstract: - and {beta}-tubulin have an unstructured glutamate-rich region at their C-terminal tails (CTT). The function of this region in cilia/flagella is still unclear, except that glutamates in CTT act as the sites for posttranslational modifications that affect ciliary motility. A unicellular alga Chlamydomonas possesses only two -tubulin genes and two {beta}-tubulin genes, each pair encoding an identical protein. This simple gene organization may enable a complete replacement of the wild-type tubulin with its mutated version. Here, using CRISPR/Cas9, we generated mutants expressing tubulins with modified CTTs. We found that the mutant whose four glutamate residues in the -tubulin CTT have been replaced by alanine almost completely lacked polyglutamylated tubulin and displayed paralyzed cilia. In contrast, the mutant lacking the glutamate-rich region of the {beta}-tubulin CTT assembled short cilia without the central apparatus. This phenotype is similar to the mutants harboring a mutation in a subunit of katanin, whose function has been shown to depend on the {beta}-tubulin CTT. Therefore, our study reveals distinct and important roles of - and {beta}-tubulin CTT in the formation and function of cilia. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.07.527540v1?rss=1 Authors: Chew, Y. M., Cross, R. A. Abstract: Taxol is a critically important cancer drug that stabilises microtubules. We report that taxol acts differently on different metazoan tubulin isotypes. 50 nM taxol blocks catastrophe of human or zebrafish 1{beta}4 but has no effect on human 1{beta}3 microtubules. 500 nM taxol blocks catastrophe in both 1{beta}3 and 1{beta}4 microtubules but introduces kinks only into 1{beta}4 microtubules. Taxol washout relaxes the kinks, suggesting taxol expands 1{beta}4 but not 1{beta}3 lattices. Kinesin-driven microtubule gliding detects this conformational shift - 1{beta}4 microtubules glide at ~450 nm/sec in 400 nM taxol, but at ~750 nm/sec in 10 M taxol, whereas 1{beta}3 microtubules glide at ~450 nm/sec, even in 10 M taxol. Thus, taxol readily stabilises 1{beta}4 GDP-tubulin lattices and shifts them to a fast-gliding conformation, but stabilises 1{beta}3 lattices much less readily and without shifting their conformation. These isotype-specific actions of taxol may drive the switch to {beta}3 tubulin commonly seen in taxol-resistant tumours. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.29.522226v1?rss=1 Authors: Mazzetti, S., Giampietro, F., Isilgan, H. B., Calogero, A. M., Gagliardi, G., Rolando, C., Cantele, F. O., Ascagni, M., Bramerio, M. A., Giaccone, G., Isaias, I. U., Pezzoli, G., Cappelletti, G. Abstract: Highly specialized microtubules in neurons are crucial to the health and disease of the nervous system, and their properties are strictly regulated by different post-translational modifications, including -Tubulin acetylation. An imbalance in the levels of acetylated -Tubulin has been reported in experimental models of Parkinsons disease (PD) whereas pharmacological or genetic modulation that leads to increased acetylated -Tubulin successfully rescues axonal transport defects and inhibits -Synuclein aggregation. However, the role of acetylation of -Tubulin in the human nervous system is largely unknown as most studies are based on in vitro evidence. To capture the complexity of the pathological processes in vivo, we analysed post-mortem human brain of PD patients and control subjects. In the brain of PD patients at Braak stage 6, we found a redistribution of acetylated -Tubulin, which accumulates in the neuronal cell bodies in subcortical structures but not in the cerebral cortex, and decreases in the axonal compartment, both in the central and peripheral nervous system. High-resolution and 3D reconstruction analysis linked acetylated -Tubulin redistribution to -Synuclein oligomerization, leading us to propose a model for Lewy body (LB) morphogenesis. Finally, for the first time in post-mortem human brain, we observed threadlike structures, resembling tunnelling nanotubes that contain -Synuclein oligomers and are associated with acetylated -Tubulin enriched neurons. In conclusion, we disclose a novel aspect of LB morphogenesis, indicating the role of acetylated -Tubulin in PD, that may provide clues to design novel therapeutic interventions. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.23.521729v1?rss=1 Authors: Haruta, N., Sumiyoshi, E., Honda, Y., Terasawa, M., Uchiyama, C., Toya, M., Kubota, Y., Sugimoto, A. Abstract: The {gamma}-tubulin complex ({gamma}TuC) is a widely conserved microtubule nucleator, but some of its components GCP4-6. Here, we identified two {gamma}TuC-associated proteins in C. elegans, namely GTAP-1 and -2, for which apparent orthologs were detected only in the genus Caenorhabditis. Their centrosomal localization was interdependent. In early C. elegans embryos, whereas the conserved {gamma}TuC component MZT-1/MOZART1 was essential for the localization of centrosomal {gamma}-tubulin, depletion of GTAP-1 and/or -2 caused up to 50% reduction of centrosomal {gamma}-tubulin and precocious disassembly of spindle poles during mitotic telophase. In the adult germline, GTAP-1 and GTP-2 contributed to the efficient recruitment of {gamma}TuC to the plasma membrane. Depletion of GTAP-1, but not GTAP-2, severely disrupted both the microtubule array and the honeycomb-like structure in the adult germline. We propose that GTAP-1 and -2 are unconventional components of {gamma}TuC that contribute to the organization of both centrosomal and non-centrosomal microtubules by targeting the {gamma}TuC to specific subcellular sites in a tissue-specific manner. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.10.17.512471v1?rss=1 Authors: Godinho, S. A., Monteiro, P., Yeon, B., Wallis, S. S. Abstract: Intracellular organelle organisation is conserved in eukaryotic cells and is primarily achieved through active transport by motor proteins along the microtubule cytoskeleton. Microtubule posttranslational modifications (PTMs) contribute to microtubule diversity and differentially regulate motor-mediated transport. Here we show that centrosome amplification induces a global change in organelle positioning towards the cell periphery and facilitates nuclear migration through confined spaces. This reorganisation requires kinesin-1 and is analogous to loss of dynein. Cells with amplified centrosomes display increased levels of acetylated tubulin, a PTM known to enhance kinesin-1 mediated transport. Depletion of -tubulin acetyltransferase 1 (TAT1) to block tubulin acetylation, which has no impact on control cells, rescues the displacement of centrosomes, mitochondria and vimentin, but not Golgi or endosomes. Analyses of the distribution of acetylated microtubules indicates that the polarisation of modified microtubules, rather than levels alone, plays an important role in organelle positioning. We propose that tubulin acetylation differentially impacts kinesin-1-mediated organelle displacement, suggesting that each organelle must have its own sensing and response mechanisms to ensure fine-tuning of its distribution in cells. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.09.07.506915v1?rss=1 Authors: Puri, D., Samaddar, S., Banerjee, S., Ghosh-Roy, A. Abstract: Regulation of microtubule cytoskeleton is fundamental for the development and maintenance of neuronal architecture. Recent studies have shown that regulated RNA processing is also critical for the establishment and maintenance of neural circuits. In a genetic screen using mechanosensory neurons of C. elegans, we identified a mutation in muscleblind-1 as a suppressor of loss of kinesin-13 family microtubule destabilizing factor klp-7. Muscleblind-1(MBL-1) is an RNA-binding protein that regulates the splicing, localization, and stability of RNA. We found that mbl-1 is required cell-autonomously for axon growth and synapse formation in the posterior lateral microtubule (PLM) neuron. Loss of mbl-1 affects stability and plus-end-out organization of microtubules in the anterior process of PLM. These defects are also accompanied by abnormal axonal transport of the synaptic protein RAB-3 and loss of gentle touch sensation in mbl-1 mutant. Our data showed that mbl-1 is genetically epistatic to mec-7 ({beta}-tubulin) and mec-12 (-tubulin) for axon growth. The immunoprecipitation of MBL-1 pulls down the mec-7, mec-12, and sad-1 mRNAs. Additionally, the mbl-1 mutants show a reduction in the level and stability of mec-7 and mec-12 transcripts. Independently, mbl-1 is epistatic to sad-1 for synapse formation. Our work elucidated a previously unknown link between RNA binding protein and cytoskeletal machinery for the development and maintenance of the nervous system. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by PaperPlayer

In episode 14 of the Quantum Consciousness series, Justin Riddle spells out the orchestrated objective reduction theory of consciousness by Stuart Hameroff and Roger Penrose. Biology requires a central processing unit to integrated information across the cell. While quantum computation offers unique solutions to biology's problems, the warm wet noisy environment of the brain does not lend itself easily to stable quantum superpositions. Penrose & Hameroff propose that nonpolar pockets with limited environmental influence creates the conditions for delocalized clouds of electrons that enter superposition. Benzene rings and aromatic rings provide a geometric means of building superposed electron channels. At the core of each protein, nonpolar channels of electrons create a macroscopic functional unit to guide protein function. Tubulin extend this principle by aligning with their neighbors in a cyclical pattern to create topological pathways. The topological qubits in microtubules extend to their neighbors via microtubules associated proteins (MAPs). Quantum computers require a digital interface phase and a non-local quantum computation phase. Actin microfilaments dynamically isolate and expose the microtubules to the environment through phase transition from a liquid-state (digital) to a gel-state (quantum). As the microtubules are isolated, the superposition grows in complexity until it reaches an objective threshold and self-collapses. This collapse rate is hypothesized to be the equivalent of a single moment of conscious experience. As these moments are strung together, a conscious experience is created. Anesthetics and psychedelics are theorized to bind to tubulin proteins and either silence the electron channels or to enhance their resonance, thereby modifying conscious experience.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.21.392803v1?rss=1 Authors: Brilot, A. F., Lyon, A., Zelter, A., Viswanath, S., Maxwell, A., MacCoss, M. J., Muller, E. G., Sali, A., Davis, T. N., Agard, D. A. Abstract: Microtubule (MT) nucleation is regulated by the {gamma}-tubulin ring complex ({gamma}TuRC), conserved from yeast to humans. In Saccharomyces cerevisiae, {gamma}TuRC is composed of seven identical {gamma}-tubulin small complex ({gamma}TuSC) sub-assemblies which associate helically to template microtubule growth. {gamma}TuRC assembly provides a key point of regulation for the MT cytoskeleton. Here we combine cross-linking mass spectrometry (XL-MS), X-ray crystallography and cryo-EM structures of monomeric and dimeric {gamma}TuSC and open and closed helical {gamma}TuRC assemblies in complex with Spc110p to elucidate the mechanisms of {gamma}TuRC assembly. {gamma}TuRC assembly is substantially aided by the evolutionarily conserved CM1 motif in Spc110p spanning a pair of adjacent {gamma}TuSCs. By providing the highest resolution and most complete views of any {gamma}TuSC assembly, our structures allow phosphorylation sites to be mapped, suggesting their role in regulating spindle pole body attachment and ring assembly. We further identify a structurally analogous CM1 binding site in the human {gamma}TuRC structure at the interface between GCP2 and GCP6, which allows for the interpretation of significant structural changes arising from CM1 helix binding to metazoan {gamma}TuRC. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.21.349365v1?rss=1 Authors: Kearns, S., Mason, F. M., Rathmell, W. K., Park, I. Y., Walker, C., Verhey, K. A., Cianfrocco, M. A. Abstract: Post-translational modifications to tubulin are important for many microtubule-based functions inside cells. A recently identified tubulin modification, methylation, occurs on mitotic spindle microtubules during cell division, and is enzymatically added to tubulin by the histone methyltransferase SETD2. We used a truncated version of human SETD2 (tSETD2) containing the catalytic SET and C-terminal Set2 Rpb1 interacting (SRI) domains to investigate the biochemical mechanism of tubulin methylation. We found that recombinant tSETD2 has a higher activity towards tubulin dimers than polymerized microtubules. Using recombinant single-isotype tubulin, we demonstrate that methylation is restricted to lysine 40 (K40) of -tubulin. We then introduced pathogenic mutations into tSETD2 to probe the recognition of histone and tubulin substrates. A mutation in the catalytic domain, R1625C, bound to tubulin but could not methylate it whereas a mutation in the SRI domain, R2510H, caused loss of both tubulin binding and methylation. We thus further probed a role for the SRI domain in substrate binding and found that mutations within this region had differential effects on the ability of tSETD2 to bind to tubulin versus RNA Polymerase II substrates, suggesting distinct mechanisms for tubulin and histone methylation by SETD2. Lastly, we found that substrate recognition also requires the negatively-charged C-terminal tail of -tubulin. Together, this work provides a framework for understanding how SETD2 serves as a dual methyltransferase for histone and tubulin methylation. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.09.08.288019v1?rss=1 Authors: Paydar, M., Kwok, B. H. Abstract: Microtubules, protein polymers of /{beta}-tubulin dimers, form the structural framework for many essential cellular processes including cell shape formation, intracellular transport, and segregation of chromosomes during cell division. It is known that tubulin-GTP hydrolysis is closely associated with microtubule polymerization dynamics. However, the precise roles of GTP hydrolysis in tubulin polymerization and microtubule depolymerization, and how it is initiated are still not clearly defined. We report here that tubulin-GTP hydrolysis can be triggered by conformational change induced by the depolymerizing kinesin-13 proteins or by the stabilizing chemical agent paclitaxel. We provide biochemical evidence that conformational change precedes tubulin-GTP hydrolysis, confirming this process is mechanically driven and structurally directional. Furthermore, we quantitatively measure the average size of the presumptive stabilizing "GTP cap" at growing microtubule ends. Together, our findings provide the molecular basis for tubulin-GTP hydrolysis and its role in microtubule polymerization and depolymerization. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

anchor.fm/SacredNatureRadio patreon.com/SacredNatureRadio I value your ideas and feedback. Send me a message via email at SacredNatureRadio@gmail.com or encrypted at DeepEntropy@protonmail.com *Rate and review this show on your podcast platforms of choice, so that our community can grow! Join our Noetic Politi and contribute to the discussions on social media: facebook.com/SacredNatureRadio instagram.com/SacredNatureRadio twitter.com/SacredNatureRad References: QuantumGravityResearch.org Rupert Sheldrake on The Science Delusion at TEDx: https://youtu.be/hO4p3xeTtUA PBS Space Time on the Quantum Eraser: https://youtu.be/8ORLN_KwAgs PBS Space Time - Does Consciousness Influence Quantum Mechanics: https://youtu.be/CT7SiRiqK-Q Clarifying the Tubulin bit/qubit - Defending the Penrose-Hameroff Orch OR Model: https://youtu.be/LXFFbxoHp3s Prof. Fritz-Albert Popp: https://www.biontologyarizona.com/dr-fritz-albert-popp/ From Magic to Religion to Science: What's Next? Dean Radin: https://youtu.be/u-DOXie3FmI Cave paintings were an ancient zodiac mapping the skies, say experts: https://www.telegraph.co.uk/science/2018/11/27/cave-paintings-ancient-zodiac-mapping-skies-say-experts/ Courage, Synchronicity, and the Technology of Magic by Tony Vigorito: https://realitysandwich.com/18642/courage_synchronicity_and_technology_magic/ Phenomenology: https://plato.stanford.edu/entries/phenomenology/ Jung's Studies in Astrology by Liz Greene: https://www.astro.com/astrology/in_rev_jungastro_e.htm Consciousness and its Place in Nature by David J. Chalmers: http://www.consc.net/papers/nature.pdf Cosmos and Psyche Intimations of a New World View by Richard Tarnas: https://cosmosandpsyche.com Music: Equinox by Purrple Cat | https://purrplecat.com Music promoted by https://www.free-stock-music.com Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en_US Wishing Well by Purrple Cat | https://purrplecat.com Music promoted by https://www.free-stock-music.com Creative Commons Attribution-ShareAlike 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/deed.en_US

Professor Eva Nogales started her career in a time where barely any women were seen in science departments. In college, she skipped biology to focus on physics, relying on her high-school knowledge of the former to shape her career as a biophysicist. Now, she’s using her understanding of the microtubules in our cells for improving disease management, including slowing the uncontrollable growth of cancer. This niche understanding of our cell behaviour at the molecular level is already improving the lives of humans everywhere, and the technique used by Professor Nogales called “cryo-EM” is taking the world of structural biology by storm. She recently visited the University of Melbourne to receive the 2019 Grimwade Medal, and to deliver the oration titled: Visualising the molecular dance at the heart of human gene expression. Episode recorded: February 14, 2019.Interviewer: Steve Grimwade.Producer and editor: Chris Hatzis.Co-production: Silvi Vann-Wall and Dr Andi Horvath.Banner: Berkeley Lab.

Vincent visits the laboratories of Kit and Joseph Pogliano on the campus of the University of California, San Diego, where he learns about their work on the bacterial cytoskeleton, sporulation, and the effects of antibiotics on bacterial cells. Visit microbeworld.org/mwv for complete shownotes including links mentioned in this episode.

Vincent visits the laboratories of Kit and Joseph Pogliano on the campus of the University of California, San Diego, where he learns about their work on the bacterial cytoskeleton, sporulation, and the effects of antibiotics on bacterial cells. Visit microbeworld.org/mwv for complete shownotes including links mentioned in this episode.

Vincent visits the laboratories of Kit and Joseph Pogliano on the campus of the University of California, San Diego, where he learns about their work on the bacterial cytoskeleton, sporulation, and the effects of antibiotics on bacterial cells. Visit microbeworld.org/twim for complete shownotes including the special video version of this episode. Thanks for listening and watching!

Pushing the envelope on spindle assembly During mitosis, numerous proteins accumulate around the mitotic spindle to help it assemble and segregate sister chromatids correctly. Schweizer et al. reveal that a membranous spindle envelope facilitates the accumulation of these proteins by excluding large organelles from the spindle region. This biosights episode presents the paper by Schweizer et al. from the August 31st, 2015, issue of The Journal of Cell Biology and includes an interview with the paper's senior author, Helder Maiato (University of Porto, Porto, Portugal). Produced by Caitlin Sedwick and Ben Short. See the associated paper in JCB for details on the funding provided to support this original research. Subscribe to biosights via iTunes or RSS View biosights archive The Rockefeller University Press biosights@rockefeller.edu

Tubulin transport pumps up cilia The assembly of cilia and flagella requires the delivery of large amounts of tubulin to the growing ends of the organelles' microtubules. Craft et al. reveal that tubulin loading onto intraflagellar transport particles is specifically upregulated in growing cilia. This biosights episode presents the paper by Craft et al. from the January 19, 2015, issue of The Journal of Cell Biology and includes an interview with the paper's senior author, Karl Lechtreck (University of Georgia, Athens, GA). Produced by Caitlin Sedwick and Ben Short. See the associated paper in JCB for details on the funding provided to support this original research. Subscribe to biosights via iTunes or RSS View biosights archive The Rockefeller University Press biosights@rockefeller.edu

Meine Arbeit befasst sich mit der histologischen, histochemischen und elektronenmikroskopischen Analyse des Eileiters des Straußes (Struthio camelus). Als Untersuchungsmaterial dienten die Eileiter von acht geschlechtsreifen und zwei nicht geschlechtsreifen Blauhals-Schwarzhals-Hybriden aus der Straußenfarm Donaumoos in Leipheim. Die Histomorphologie wurde mittels konventioneller Färbungen (H.E.-Färbung, van Gieson-Resorcinfuchsin-Färbung, Trichromfärbung nach Masson und Goldner, Alcianblau 8GX-Färbung, Perjodsäure-Schiff-Reaktion) dargestellt. Glykohistochemisch wurden durch den Einsatz von Lektinen die Kohlenhydratstrukturen untersucht. Mittels immunhistochemischer Techniken wurde das Zytoskelett sowie die Verteilung von Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Straußeneileiter studiert. Unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops konnte die Ultrastruktur ermittelt werden. Der Eileiter kann in die fünf Abschnitte Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und Vagina unterteilt werden. Das Epithel der untersuchten Tiere war im gesamten Eileiter ein mehrreihiges, hochprismatisches Epithel, welches sich aus Zilienzellen und sekretorischen Zellen zusammensetzt. In der Lamina propria mucosae finden sich charakteristische Drüsen im kaudalen Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und im uterovaginalen Übergangsbereich. Die Alcianblau-Färbung zeigt sich für pH 2,5 und pH 1,0 positiv im Oberflächenepithel des Infundibulums und Magnums der geschlechtsreifen Strauße und im Oberflächenepithel von Uterus und Vagina sowohl der adulten als auch der juvenilen Tiere. In der Vagina sind es vorrangig die Epithelzellen am Boden von Schleimhauteinstülpungen, die Alcianblau-positiv erscheinen. Die PAS-Reaktion fällt bei den adulten Straußen im Epithel des Infundibulums, und in Epithel und Drüsen sowohl des Magnums als auch des Isthmus positiv aus. Geschlechtsreife und nicht geschlechtsreife Laufvögel weisen eine positive PAS-Reaktion im Oberflächenepithel von Uterus und Vagina auf. Durch die Trichromfärbung konnten Mukosubstanzen zum einen im Epithel des tubulären Infundibulums und des Uterus, zum anderen in den Magnum- und Isthmusdrüsen der adulten Tiere festgestellt werden. Das Vaginalepithel zeigt sich bei geschlechtsreifen und nicht geschlechtsreifen Tieren positiv für Mukosubstanzen. Mittels glykohistochemischer Untersuchungen wurden die Zuckerstrukturen auf den Zellen des Eileiters nachgewiesen. Es wurden sowohl FITC-konjugierte als auch biotinylierte Lektine verwendet. Für die Durchführung der Analysen mit FITC-konjugierten Lektinen kamen Canavalia ensiformis Agglutinin (ConA), Pisum sativum Agglutinin (PSA), Lens culinaris Agglutinin (LCA), Ricinus communis Agglutinin (RCA), Peanut Agglutinin (PNA), Griffonia simplicifolia Lektin I (GSL-I), Dolichos biflorus Agglutinin (DBA), Soybean Agglutinin (SBA), Wheat germ Agglutinin (WGA), succinyliertes Wheat germ Agglutinin (WGAs), Ulex europaeus Agglutinin I (UEA-I), Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (PHA-E) und Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (PHA-L) zum Einsatz. Als biotinylierte Lektine wurden Viscum album Agglutinin (VAA), Sophora japonica Agglutinin (SJA), Sambucus nigra Agglutinin (SNA), und Maackia amurensis Agglutinin I (MAA-I) verwendet. Im Eileiter des Straußes konnte die Bindung von ConA, LCA, PSA, VAA, SJA, SNA, WGA, WGAs, MAA-I, PHA-E und PHA-L festgestellt werden. Lediglich schwach binden RCA und DBA. Keine Bindung konnte für die Lektine PNA, GSL-I, SBA und UEA-I ermittelt werden. Anhand immunhistochemischer Methoden wurden zytoskelettale Elemente sowie Hormonrezeptoren im Eileiter des Straußes untersucht. Hierbei wurde mittels spezifischer Antikörper die Lokalisation von Tubulin, Vimentin, Panzytokeratin, Zytokeratin (CK) 5, CK 14, CK 18, CK 19, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), non-muscle myosin (NMM), Östrogenrezeptor alpha (ER-α) und Progesteronrezeptor (PR) bestimmt. CK 19 konnte hierbei lediglich im Vaginalepithel festgestellt werden. ER-α zeigt sich ausschließlich in den Uterindrüsen der geschlechtsreifen Strauße immunpositiv. Für CK 7 und CK 8 konnten keine immunpositiven Strukturen im Eileiter ermittelt werden.

Hosts: Vincent Racaniello, Rich Condit, Alan Dove, and Kathy Spindler The TWiV four discuss an mRNA-based influenza vaccine, and a phage tubulin that forms a filamentous array in the host cell that is needed for positioning viral DNA. Links for this episode: mRNA vaccine against influenza (Nat Biotech) Phage tubulin assembles dynamic filaments (Cell) Viral skeleton (The Scientist) Not unorganized bags of enzymes (TWiM 28) Bacterial cytoskeleton (FEMS Micro Rev) Triangulation number (jpg) Letters read on TWiV 211 Weekly Science Picks Rich - Ocean Global Shark TrackerAlan - The Field Book ProjectKathy - How to manipulate an army of zombiesVincent - Science sculpture Listener Pick of the Week Stephen - WEHI.TV Send your virology questions and comments (email or mp3 file) to twiv@twiv.tv

Thu, 25 Oct 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14986/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14986/1/Rath_Sebastian.pdf Rath, Sebastian

Formine spielen eine wichtige Bedeutung bei der Regulierung polarisierter Aktin-gesteuerter Prozesse. Dies betrifft beispielsweise die Zellmigration, den Vesikeltransport, die Morphogenese und die Zytokinese (Faix und Grosse 2006). In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass das Protein Formin-like 1 (FMNL1) in Zellen von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL), anderen Leukämien und Lymphomen und in Zelllinien, die von soliden Tumoren stammen, überexprimiert wird. Im gesunden Gewebe wird es fast ausschließlich in hämatopoetischen Zellen exprimiert. Diese selektive Expression macht FMNL1 zu einem attraktiven Ziel für neuartige Immuntherapien bei malignen und entzündlichen Erkrankungen (Krackhardt, Witzens et al. 2002; Schuster, Busch et al. 2007). In Vorarbeiten der Gruppe wurde ein allorestringierter T-Zellklon mit einem definierten T-Zellrezeptor identifiziert, der ein Peptid von FMNL1 erkennt und eine starke Antitumor-Aktivität gegen Lymphom- und Nierenzellkarzinom-Zelllinien, Epstein-Barr-Virus (EBV)-transformierte B-Zellen und von CLL-Zellen zeigt (Schuster, Busch et al. 2007). Allerdings sind die Funktion und Regulation von FMNL1 – beide wichtig für die Validierung dieses Proteins als Antigen – noch nicht gut untersucht. Frühere Arbeiten haben eine Beteiligung von FMNL1 bei der Neuausrichtung des MTOC (Mikrotubulin-organisierendes Zentrum) in Richtung der immunologischen Synapse und zusätzlich bei der Zytotoxizität von T-Zellen beschrieben (Gomez, Kumar et al gezeigt. 2007). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das murine FRL, das zu 85% homolog zum menschlichen FMNL1 ist, an der Zelladhäsion und Motilität von Makrophagen sowie an der Fc-Rezeptor-vermittelten Phagozytose beteiligt ist (Yayoshi-Yamamoto, et al Taniuchi hat. 2000; Seth, Otomo et al. 2006). Das Ziel dieses Projekts war es, die Funktion von FMNL1 für die weitere Validierung dieses Proteins als mögliche Zielscheibe für neue Anti-Tumor-Therapien zu untersuchen. Wir haben eine neue Spleißvariante (FMNL1) identifiziert, die am C-terminalen Ende ein residuelles Intron aufweist, welches einen Einfluss auf die Diaphanous-autoinhibierende-Domäne (DAD) hat. Im Gegensatz zu anderen FMNL1-Spleißvarianten, die eine zytoplasmatischen Lokalisierung aufweisen, zeigt diese Speißvariante eine kortikale und membranständige Lokalisation in verschiedenen Zelllinien. Eine FMNL1 Mutante, bei der die DAD-Domäne fehlt (FMNL1ΔDAD), weist eine ähnliche Lokalisierung auf. Das weist darauf hin, dass es bei FMNL1 zu einer Deregulierung der Autoinhibition kommt, die zu einer konstitutiv aktiven Form von FMNL1 führt, die möglicherweise bei der zellulären Transformation eine Rolle spielen könnte. FMNL1 und FMNL1ΔDAD können eine polarisierte, nicht mit einer Apoptose-assoziierten Blasenbildung an der Membran hervorrufen, die von Myosin, Aktin undTubulin abhängig ist, aber unabhängig von Src und ROCK zu sein scheint. Wir haben außerdem nachgewiesen, dass FMNL1 als myristoyliertes Protein vorliegt und konnten zeigen, dass die N-terminale Myristoylierung wichtig für die Regulierung der Funktion von FMNL1 ist, indem sie eine schnelle und reversible Membran-Lokalisierung ermöglicht. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass FMNL1, das auch am kontraktilen Ring und Kortex von FMNL1-transfizierten mitotischen Zellen lokalsiert ist, die Zellproliferation moderat verstärkt. Eine gemeinsame Lokalisierung von menschlichem endogenem FMNL1 und -Tubulin am Kortex und den mitotischenden Spindeln von sich teilenden T-Zellen weist ebenfalls auf eine Rolle von FMNL1 in der Mitose und dem Zellwachstum hin. Überexpression von FMNL1 konnte eine höhere Konzentration von intrazellulärem freiem Calcium nach Zell-Stimulation induzieren, was auf eine Beteiligung von FMNL1 am Calcium-Signalweg deutet. Unsere Ergebnisse eröffnen neue Einblicke in die Regulation und Funktion von FMNL1 und zeigen dessen Beteiligung an unterschiedlichen Polarisierungsprozessen. Die Identifizierung von Interaktionspartnern von FMNL1 in verschiedenen hämatopoetischen Zellen sowie die weitere funktionelle Charakterisierung der Spleißvarianten wird von besonderer Bedeutung sein, und möglicherweise zur Entwicklung einer spezifischen therapeutischen Beinflussung maligner und entzündlicher Erkrankungen beitragen.

Eine große Gruppe genetisch vererbter Erblindungskrankheiten steht im Zusammenhang mit Mutation in Genen, die in Photorezeptoren exprimiert sind. Diese Mutationen führen nicht nur zu einer Beeinträchtigung des mutierten Proteins selbst, sondern auch zu einer Störung von funktionell nachgeschalteten Proteinnetzwerken. In der Folge ändern sich die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen sowie die Proteinlokalisation, was schwerwiegende physiologische Konsequenzen nach sich zieht. Alleine im lichtwahrnehmenden Molekül Rhodopsin sind mehr als hundert unterschiedliche Mutationen beschrieben worden, die vermutlich im Zusammenhang mit Retinitis pigmentosa, einer degenerativen Erkrankung der Retina, stehen (http://www.sph.uth.tmc.edu/RetNet/). In Saccharose-Dichte Gadienten Experimenten von Dr. Magdalena Swiatek-deLange, die dieser Studie vorangegangen sind, wurde Rhodopsin als Teil eines potentiellen Rhodopsin/Ras Homolog Gene Family, Member A (RhoA)/Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1)/RhoKinase II (Rock II)/ Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) Signal-Multiproteinkomplexes in Außensegmenten von Stäbchen Photorezeptoren (ROS) identifiziert, welcher im Zuge dieser Studie bestätigt und eingehender untersucht wurde. Ein Zusammenhang zwischen einer Rhodopsin-vermittelten Degeneration von Photorezeptoren und der Regulation des Cytoskeletts durch die kleine GTPase Rac1, wurde von Chang und Kollegen (Chang and Ready, 2000) hergestellt. Sie haben gezeigt, dass die Expression von dominant-aktivem Rac1 in Rhodopsin-Null Mutanten von Drosophila die Rhabdomer Morphogenese erhalten kann. In Zellen fungiert Rac1 durch den Wechsel zwischen einem inaktiven, vorwiegend cytosolischen und einem aktiven, überwiegend membranassoziierten Zustand, als molekularer Schalter in der Signaltransduktion und vermittelt Signale von Membranrezeptoren an das Cytoskelett. Obwohl die Rolle von Rac1 bereits in einer großen Zahl unteerschiedlicher Zellen untersucht worden ist, ist seine Funktion in Photorezeptoren noch immer weitgehend ungeklärt. Die wenigen vorhanden Studien, in denen beispielsweise gezeigt wurde, dass Rac1 an der Fusion von Rhodpsintransportcarriern in Rana barlandieri (Deretic et al., 2004) oder auch an der lichtinduzierten Degeneration von murinen Photorezeptoren beteiligt ist (Belmonte et al., 2006), machen aber deutlich, dass Rac1 ein für die Funktion und Regulation von Photorezeptoren wichtiges Molekül ist. In dieser Studie wurde daher die Rolle von Rac1 in Photorezeptoren eingehender untersucht und ein Rac1-Interaktom in ROS, bestehend aus 22 Interaktoren, identifiziert. Von diesen 22 identifizierten Interaktoren sind fünf bereits als Interaktoren von Rac1 beschrieben worden, darunter CRMP2, einer der Hauptregulatoren von Polarität in neuronalen Zellen, sowie die cytoskelettalen Proteine Aktin ( and  und Tubulin ( and Unter den 17 neuen potentiellen Rac1 Interaktoren befindet sich das Aryl Hydrocarbon Receptor-Interacting Protein Like 1 (AIPL1), das im Zusammenhang mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) sowie mit retinalem Proteintransport steht (Sohocki et al., 2000), sowie eine Reihe von Proteinen, die Teil der Phototransduktionskaskade sind, wie die Untereinheit der 3´, 5´-cyclic-GMP Phosphodiesterase 6, Recoverin, Arrestin sowie die ,  und  Untereinheiten von Transducin. Rac1 verbindet damit die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit einer Regulation des Cytoskeletts und legt damit eine Interdependenz von Lichtwahrnehmung mit einer korrekten zellulären und funktionalen Struktur von Photorezeptoren nahe. In dieser Studie wurde nicht nur die Existenz des potentiellen Rhodopsin/RhoA/Rac1/Rock II/CRMP2 Multiproteinkomplexes in ROS bestätigt, sonder auch eine lichtabhängige Dynamik und Interaktion der einzelnen Komplexbestandteile beschrieben. In Übereinstimmung mit Daten aus verschiedenen Organismen ((Wieland et al., 1990), (Petrov et al., 1994), (Balasubramanian and Slepak, 2003)) konnte eine lichtabhängige Aktivierung von Rac1 in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Während lichtaktiviertes, GTP-gebundenes Rac1 überwiegend membranassoziiert vorliegt, konnte in dunkeladaptierten ROS insgesamt nur eine sehr geringe Menge an aktivem Rac1 detektiert werden. Des Weiteren wurden in dieser Studie auch deutliche Hinweise geliefert, die auf eine CRMP2 vermittelte Verbindung von Rac1 und RhoA assoziierten Signalwegen hinweisen, wohingegen die Kinase Rock II nur Teil des RhoA assoziierten Signalkomplexes zu sein scheint. Als Funktion von CRMP2 liegt daher eine Rolle als physiologischer Schalter nahe, der die Balance zwischen Rac1 und RhoA vermittelter Signaltransduktion koordiniert. Eine solche Funktion für CRMP2 wurde von Ariumura und Kollegen bereits für die Signaltransduktion in Neuronen vorgeschlagen (Arimura et al., 2000). Um die Signaltransduktion von CRMP2 in ROS eingehender untersuchen zu können, sind CRMP2 Antikörper unabdingbar, welche aber zu Beginn dieser Arbeit kommerziell nicht erhältlich waren. Daher war die Produktion und Charakterisierung von monoklonlalen CRMP2 spezifischen Antikörpern ein wichtiger Teil dieser Studie. Von den vier erhaltenen stabilen Linien monoklonaler, CRMP2 spezifischer Antikörper waren alle für den Einsatz im Western Blot sowie in der Immunohistochemie geeignet, aber nur ein Antikörper erwies sich auch als geeignet für die Immunopräzipitation von nativem CRMP2 aus primärem retinalen Gewebe. Dieser Antikörper stellt damit ein exzellentes Werkzeug für die weitere Charakterisierung der Funktion von CRMP2 in ROS dar. Drei Klassen von Proteinen regulieren die Aktivität von Rac1. Sie alle haben einen Einfluss auf den GTP/GDP-Austausch. Einer dieser Regulatoren ist der Rho GDP Dissociation Inhibitor (RhoGDI). Er kontrolliert die Interaktion von Rac1 mit weiteren regulatorischen Proteinen und Effektoren, sowie durch Interaktion mit dem Prenylrest von Rac1 das Pendeln zwischen Cytosol und Membran. Da aber der RhoGDI nicht in ROS nachgewiesen werden konnte (Balasubramanian and Slepak, 2003), legt dies den Schluss nahe, dass ein anderes Protein diese Funktion in ROS übernimmt. Das 17-kDa große Protein PDEdas lange Zeit als Untereinheit der retinalen cGMP Phosphodiesterase 6 aus Stäbchen galt, weist starke strukturelle Homologien zu RhoGDI auf. Es interagiert mit einer ganzen Reihe von prenylierten und unprenylierten Proteinen. Seine Fähigkeit, prenylierte Proteine von Zellmembranen zu lösen, erinnert stark an die Funktion, welche RhoGDI auf GTPasen der Rho Familie hat. Es wurde daher im Zuge dieser Studie untersucht, ob PDE in ROS GDI Funktion auf Rac1 ausübt. In dieser Arbeit konnte eine lichtabhängige Interaktion von Rac1 mit PDE in ROS von Schweinen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass aufgereinigtes PDE Rac1 von isolierten ROS Membranen lösen kann, eine Eigenschaft, die deutlich auf eine GDI-Funktion von PDE für Rac1 hinweist. Zudem wurde gezeigt, dass die Interaktion von Rac1 mit PDE mit einer lichtabhängigen Carboxylmethylierung von Rac1 in ROS korreliert, was ein Hinweis darauf sein kann, dass die die GDI Funktion von PDE durch die Methylierung von Rac1 reguliert wird. Alles in Allem zeigen diese Daten, das PDE für Rac1 in ROS die Funktion eines GDIs ausübt. In dieser Studie geben die identifizierten und mit Rac1 assoziierten Multiproteinkomplexe sowie deren lichtregulierte Dynamik einen deutlichen Hinweis darauf, dass Rac1 die Lichtwahrnehmung durch Rhodopsin mit Signalnetzwerken verbindet, die eine Rolle bei der strukturellen Integrität und Polarität von Photorezeptoren spielen. Dies deutet auf eine Abhängigkeit von Lichtwahrnehmung und funktioneller zellulärer Struktur hin. Mit der Bereitstellung von qualitativ sehr hochwertigen CRMP2 spezifischen Antikörpern liefert diese Studie zudem eine gute Basis für weiterführende Studien in diesem Forschungsfeld. Neben Rhodopsin assoziierten Komplexen stehen auch eine ganze Reihe von ciliären Komplexen in Zusammenhang mit degenerativen Erkrankungen der Retina. Im kürzlich entdeckten ciliären Protein Lebercilin (den Hollander et al., 2007) wurden Mutationen mit Leberscher kongenitaler Amaurose (LCA) in Verbindung gebracht, einer sehr schweren Form einer erblichen retinalen Dystrophie ((Kaplan et al., 1990), (Perrault et al., 1999)). Mit Hilfe von SF-TAP und LC/MS/MS Analysen konnten 24 Lebercilin Interaktoren in HEK Zellen identifiziert werden (den Hollander et al., 2007). Hier in dieser Studie wurden schließlich diese potentiellen Lebercilin Interaktoren auch in Photorezeptoren von Schweinen bestätigt (veröffentlicht in (den Hollander et al., 2007). Die identifizierten Interaktoren stellen mögliche Kandidaten für Gene für LCA und andere Ciliopathien dar und weisen Lebercilin als ein ciliär und mikrotubulär assoziiertes Protein in der Retina aus. Dies betont den Stellenwert, welche gestörte ciliäre Prozesse in der molekularen Pathogenese von LCA besitzen.

The objective of this work was to examine follicular and oocyte growth in canine ovaries with light and electron microscopic techniques and to characterize canine oocytes during in vitro maturation. Ovaries of healthy bitches of different ages (4 months to 12.5 years)and breeds were used, which had undergone elective ovariohysterectomy at local veterinary clinics. The ovaries of 15 bitches were fixed in Bouin`s solution or paraformaldehyde (4%) for immunohistochemical studies and of three bitches in Karnovsky`s solution for electron microscopic evaluation. COCs and oocytes were recovered from 61 other bitches by slicing the ovaries. They were then examined before and after in vitro maturation (24 to 72 hours) in modified TCM-199 either by native evaluation or after fixation in paraformaldehyde (4%) and nuclear staining (propidium iodide/Hoechst 33342), immunofluorescence or glycohistochemistry. The evaluation of the fluorescence microscopic staining was performed by confocal laser scanning microscopy. Oocytes and COCs after 0, 24, 72 and 90 hours of in vitro maturation were also subjected to electron microscopic examination. The morphology of the canine ovary in light and electron microscopic aspects is comparable to that of other domestic animals. Primordial, primary, secondary and tertiary follicles were regularly seen. The diameter of the oocytes and of the germinal vesicle, as well as the thickness of the zona pellucida, clearly increases during oocyte development. Growing canine oocytes are characterized ultrastructurally by rapid growth in the number of cellular organelles, particularly mitochondria, smooth endoplasmatic reticulum and lipid droplets. Mitotic division starting at the primary follicle stage can be regularly observed by immunostaining with the proliferation marker Ki-67. Further immunohistochemical studies on ovaries indicate that estrogen receptors alpha and beta, as well as MMP-1, -2, -14 and TIMP-2 show a specific distribution in bitches. Canine oocytes could easily be isolated by slicing the ovaries. The number of recovered oocytes was clearly influenced by the age of the donor bitch but not by the breed, the reproductive status or the transportation time between time of surgery in the veterinary clinic and the recovery of the oocytes in the laboratory. 48% of all isolated oocytes had a dark homogenous ooplasm and multiple dense layers of cumulus cells. After in vitro maturation, morphological changes like the formation of vesicles and the loss of cumulus cells could be observed in most of the COCs. Immediately after recovery, the nuclei of all oocytes were at the germinal vesicle stage, although the chromatin showed different degrees of condensation. While first signs of the resumption of meiosis were seen after 24 hours of culture, only one oocyte in metaphase II could be seen after 72 hours. Nuclear and cytoplasmatic maturation could be detected by electron microscopy for up to 24 hours of in vitro culture, as well as signs of degeneration, which were even more prominent after longer culture periods. The immunoreaction of ZP3beta, alpha-Tubulin and Connexin 43 and the binding sites of the lectins WGA and SBA showed characteristic changes in canine oocytes and COCs before and after in vitro maturation.

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

An expressed beta-tubulin gene (TUBB) has previously been localized to chromosome region 6pter-p21 in man. By using a panel of deletion mutant cell lines and radiation-reduced hybrids containing fragments of chromosome 6, the TUBB locus could be mapped to the HLA class I region at 6p21.3. A long range restriction map including TUBB and several HLA class I genes was then generated by rotating field gel electrophoresis. The results show that TUBB maps to a segment 170-370 kb telomeric of HLA-C. This location suggests that a mutation at the TUBB locus could be the cause for certain forms of HLAlinked microtubule dysfunction, including immotile cilia syndrome.

Thu, 1 Jan 1987 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8669/1/nucleotide_sequence_and_expression_of_two_beta-tubulin_genes_in_stylonychia_lemnae_8669.pdf Helftenbein, E.; Conzelmann, Karl-Klaus dd

Thu, 1 Jan 1987 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/8668/1/8668.pdf Conzelmann, Karl-Klaus; Helftenbein, E.