Podcasts about sequenzhomologien

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

Die Familie der Geruchsrezeptoren ist zwar ein zentrales Forschungsgebiet, dennoch ist wenig über sie bekannt. Im Folgenden wird dargestellt, worin die beiden Hauptursachen für die Problematik der Analyse von Geruchsrezeptoren bestehen und welche Strategien in dieser Arbeit gewählt wurden, um einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung von Geruchsrezeptoren zu finden: 1. Erst wenigen Geruchsrezeptoren konnten Liganden zugeordnet werden . Da noch keine Struktur eines Geruchsrezeptors bekannt ist, können bislang Modellvorstellungen nur über Sequenzhomologien innerhalb der Rezeptorgruppe oder anhand verwandter Rezeptoren, z. B. dem Rinderopsin, erstellt werden. Offensichtlich reichen diese Modelle jedoch nicht aus, um effektiv Liganden zuzuordnen oder Struktur-Funktion-Zusammenhänge zu erkennen. Das HEK-293-Zellsystem erwies sich zwar als das bisher effektivste heterologe Expressionssystem für diese Art von Rezeptoren, doch auch hier ist die Zahl beschriebener, funktionell exprimierter ORs begrenzt . Es gibt also nur wenige Möglichkeiten, Geruchsrezeptoren funktionell zu exprimieren, und daher besteht ein Bedarf an weiteren Expressionssystemen, um diese Rezeptoren in vivo untersuchen zu können. 2. Neben der Problematik einer funktionellen Expression gibt es bislang kein Expressionssystem, welches die Herstellung geeigneter Mengen für eine Strukturaufklärung dieser Rezeptoren ermöglicht. Die Menge der synthetisierten Rezeptoren ist in der Regel zu gering oder die Zielproteinspezies liegt in Einschlusskörpern vor. Zu 1) Die funktionelle Expression mit korrekter Translokation des Membranproteins sollte in Kombination mit einer Semliki Forest Virus-basierten Infektion in Säugetier P19-Zellen durchgeführt werden. Ausgewählt wurde diese Zelllinie aufgrund folgender Tatsachen: es handelt sich bei der P19-Zelllinie um Teratokarzinom-Zellen, welche ursprünglich aus embryonalen Stammzellen, implantiert in Hodengewebe, generiert wurden. Einem Gewebe also, in dem in vivo eine Geruchsrezeptor-Expression nachgewiesen wurde . Ein weiterer vielversprechender Umstand war die Differenzierbarkeit dieser Fibroblasten-ähnlichen Zellen in neuronale Zellen, dem Zelltyp, der auch in vivo für olfaktorische Neuronen vorliegt. Dementsprechend lautet die Annahme, dass es sich um eine optimale Zelllinie für die Expression rekombinanter ORs handeln kann, die zur zeitgerechten Expression aller für die olfaktorische Signalkaskade notwendigen Bestandteile befähigt ist. Die Zelllinie sollte bezüglich ihrer Eignung als Expressionsplattform für Geruchsrezeptoren charakterisiert und Expressionsstudien am Beispiel des Rezeptors OR5 durchgeführt werden. Zu 2) Die Überexpression des Membranproteins zur quantitativen Isolierung erfolgte in Hefe. Gegenüber E. coli ist der Hefeorganismus zur Durchführung posttranslationaler Modifikationen fähig. Ein Vorteil im Vergleich zu Säugerzellen sind die hohen erreichbaren Zelldichten. Primärgewebe kam für diese Fragestellung nicht in Frage: eine Isolierung wäre mit sehr geringen Ausbeuten verbunden, eine Problematik, die durch die Verwendung von heterologen Expressionssystemen umgangen werden kann. Es wurde eine „unfolded protein response“ (UPR)-kontrollierte Expression in Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, um zu gewährleisten, dass überwiegend korrekt gefaltetes Rezeptorprotein gebildet wird. Mit dieser Arbeit sollten erstmals durch eine optimierte Expression, Produktion und Isolierung ausreichende Proteinmengen des Geruchsrezeptors OR5 (aus R. norvegicus) mit einer Homogenität von >90% zur Verfügung gestellt werden, um biochemische und strukturelle Charakterisierungen durchzuführen. Zusätzlich sollten monoklonale OR5-Antikörper generiert werden, um eine spezifische Detektion und Immunopräzipitation des Geruchsrezeptors OR5 zu ermöglichen. Zusammengefasst tragen die etablierten Systeme dazu bei, die genaue Rolle der ORs in der Geruchswahrnehmung in Zukunft entschlüsseln zu können. Mit Hilfe der P19-Zelllinie wird die OR-Charakterisierung in einem heterologen System ermöglicht, und durch den Gebrauch des Hefeexpressionsystem und die optimierte Isolierungs-Strategie kann das Material für eine Strukturaufklärung bereitgestellt werden.

Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die zwei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung eine kompetitive Hybridisierung möglich, so daß die behandelte Probe und die zugehörige Kontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen Bedingungen untersucht werden können. Der noch größere Vorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Expression mehrerer tausend Gene gleichzeitig untersuchen zu können. In diesem Kapitel wurde der Einfluß verschiedener Strahlenarten (UV-C, γ-, Protonen- und C6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet. In einem ersten Schritt wurden für die verschiedenen Noxen die äquitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten miteinander vergleichen zu können. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den verwendeten Strahlenarten der Einfluß der alkylierenden Chemikalie MMS auf die Expression untersucht. Hierzu liegt bereits eine publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die hier erzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. Fünf der zehn am stärksten induzierten Gene wurden bereits von Jelinsky und Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die Diskrepanz bei den fünf restlichen Genen könnte trotz weitgehender Adaption des „Jelinsky“- Protokolls durch die Verwendung eines anderen Stammes oder durch die unterschiedliche Microarray Technik (hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays) erklärbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, daß die Expressionsunterschiede von den zehn am stärksten induzierten Genen im ersten Experiment im Wiederholungsexperiment in neun Fällen bestätigt werden konnten. Interessanterweise ließen sich sieben dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die räumlich auf dem Chromosom direkt benachbart angeordnet sind und vermutlich koreguliert werden. Während bei MMS-behandelten Zellen die stärksten Expressionsunterschiede beobachtet wurden, zeigten sämtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen Effekt auf das Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein intermediäres Expressionsmuster bezüglich der Transkriptmengen - es waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den ionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur MMS-Behandlung signifikant weniger Expressionsveränderungen festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark veränderten Transkriptmengen ergab, daß viele Gene, deren Induktion nach Bestrahlung bereits früher publiziert worden ist, hier nicht als induzierbar gefunden wurden. Mehrere Faktoren könnten dafür verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der DNAReparaturgene sind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen anderen Methoden der Expressionsmessung schwer detektierbar. Zudem können geringe Expressionsunterschiede (kleiner Faktor zwei) bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des zeitlichen Rahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle Hybridisierungen nur einmal (bei γ-Strahlung zweimal) wiederholt werden, wodurch eine statistisch verläßliche Aussage im Fall von geringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in diesem Kapitel nur Expressionsunterschiede von mindestens Faktor zwei berücksichtigt. Trotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige Indizien, die für eine biologische Relevanz der gezeigten Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren Fällen Genpaare (bzw. -gruppen) identifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung ähnlich stark verändert vorlagen und die bereits früher aufgrund funktioneller Ähnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst wurden (z.B. wurden fünf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erhöhter Transkriptmenge nach UV-Bestrahlung gefunden). Außerdem wurden die RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar eingestuft, was aus früheren Expressionsmessungen bereits bekannt ist (Endo-Ichikawa, et al., 1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen - Bestrahlung konnten zudem mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig ist, beteiligt sind. Schließlich zeigte auch die stichprobenartige Überprüfung der mit Microarrays erzielten Expressionsdaten durch Northern-Hybridisierungen eine gute Übereinstimmung. So konnten die in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen Transkriptionsveränderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit MMS verifiziert werden. Neben den Genen mit bekannter Funktion in der DNA-Schadensprozessierung wurden einige Gene identifiziert, die bislang nicht in Verbindung mit DNA-Schädigung gebracht worden sind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten Strahlenarten (auch MMS) eine deutliche Verringerung der Transkriptmenge des EGT2-Gens, für das eine Rolle in der Zellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine erhöhte Transkriptmenge wurde für den Leserahmen YLL030C nach UV-,C6+- und γ-Bestrahlung gefunden. Bei sämtlichen verwendeten Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erhöhte Transkriptmenge für den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von Sequenzhomologien als möglicher Transkriptionsfaktor diskutiert wird (Bohm, et al., 1997). Inwieweit Gene, die lediglich bei einer Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen, tatsächlich strahlenspezifisch reguliert sind, muß erst durch weitergehende Analysen geklärt werden.