Podcasts about proteinbiosynthese

HIER GEHT'S ZUM VIEDEO: https://youtu.be/Lm6wDqM_Z2wIm dritten Teil des Interviews besucht Christian seinen Namensvetter, Dr. Christian Burghardt, in den Räumlichkeiten von MitoCare in München. Gemeinsam beleuchten sie das Thema Langlebigkeit und erläutern die Zusammenhänge zwischen einer ausgewogenen Ernährung und unserer Gesundheit, insbesondere in Bezug auf Langlebigkeit.Sie diskutieren die richtige Zusammensetzung von Fettsäuren und erklären, warum hochwertige Öle wie Lein-, Oliven- und Algenöl essenziell für die Zellgesundheit sind. Zudem erfährst du, wie du deine Proteinbiosynthese optimieren kannst. Viele Menschen leiden unbewusst an einem Proteinmangel, der unbehandelt zu zahlreichen Beschwerden führen kann.Auch die Bedeutung von Präbiotika wie Tagatose wird thematisiert. Eine gesunde Darmflora ist entscheidend für dein Wohlbefinden. Erfahre, wie du die Bakterien in deinem Darm unterstützen kannst und somit zu deiner Gesundheit beiträgst.Inhaltsverzeichnis:00:30 - Einführung und Begrüßung02:45 - Wichtigkeit der Fettsäuren06:15 - Ernährung der Mikroorganismen09:40 - Gesunde Ernährung und Langlebigkeit12:30 - Bedeutung von Aminosäuren15:50 - Proteinmangel und seine Folgen19:00 - Aminosäuren für Veganer20:30 - Zusammenfassung und Ausblick22:00 - AbschlussLese dir diesen Artikel über die gesunden Zuckeralternativen durch: https://www.vegan-athletes.com/gesunder-zucker-tagatose-galactose/Hier geht es zur Webseite von Christian Burghardt: https://www.vegan-athletes.com/MITOcare-shop - sichere dir 5 % Rabatt mit dem Code: V60014https://www.instagram.com/chris_mito_/?hl=deOder buche direkt einen Termin:https://www.doctolib.de/internist/muenchen/christian-burghardtDu willst mehr erfahren? Schreibe eine E-Mail an: christian@christian-wenzel.comMehr mr.broccoli: Podcast auf Spotify Apple Podcast Mehr Podcast Abonniere meinen YouTube Kanal*Affiliate LinkAchtung betreffend Nahrung, Geräten und Supplements:Vorliegend habe ich meine eigene Erfahrung und die von Interviewpartnern genannt. Das sind die Effekte, die ich bei mir gespürt habe. Diese können bei jedem unterschiedlich ausfallen.Natürlich kann kein Lebensmittel, keine Nahrungsergänzung oder Superfoods sowie Inspirationen aus diesem Podcast alleine für sich eine Heilwirkung erzielen oder versprechen.Die beschriebenen Erfahrungen sind keine wissenschaftlichen Erkenntnisse und keine Tatsachenbehauptungen. Sämtliche Inhalte dieser Podcast Episoden sind keine Heilaussagen und ausschließlich informativ, sie dienen keinesfalls als Ersatz für eine ärztliche Behandlung.Die Aussagen der Interview Gäst:innen stehen für sich. Diese spiegeln nicht zwingend die Meinung des Herausgebers.

In dieser Podcastfolge spreche ich über eine interessante neue Studie zum Thema Proteinkonsum nach dem Training, bzw. wie viel Protein unser Körper nach dem Training aufnehmen kann und ob durch eine erhöhte Proteineinnahme auch immer weiter die Proteinbiosynthese erhöht wird! Vor diesem Hintergrund erkläre ich euch auch den Zusammenhang der Ergebnisse dieser Studie zu den bisherigen Studien zum Thema Mahlzeitenfrequenz bzw. Anzahl der Proteinmahlzeiten am Tag im Zusammenhang mit Muskelaufbau und Gewichtsreduktion und gebe euch direkt Tipps für die praktische Umsetzung mit, damit ihr das beste aus der Ernährung und Training für euch rausholen könnt! Teilt diese Folge gerne auf Instagram oder in deinem Netzwerk! Enjoy :) Supplements: ► Maximal mögliche Rabatte mit dem Code "SMARTFITNESS" auf alle Supplements von www.esn.com & www.morenutrition.de und Kleidung von www.oace.de! Vielen Dank für den Support :-) ► Suchst du einen erfahrenen Coach, der dir dabei hilft, deine gewünschten Ziele effektiv und mit Spaß zu erreichen? Dann schreib mir gerne eine Mail mit deiner Anfrage für ein unverbindliches Erstgespräch an info@smartfitnessandfood.de oder auf Instagram an "marc_drossel". Direkte Link zu meinen Social Media-Kanälen auf: ► Instagram  ► YouTube ► TikTok ► Facebook Wenn dir die Show gefällt, dann schreib mit doch bitte eine Bewertung auf iTunes und abonniere die Show :) Hast du Ideen, Fragen oder Anregungen? Dann schreib mir einfach an info@smartfitnessandfood.de

Wie regulieren Bakterien ihren Stoffwechsel- speziell: die Proteinbiosynthese von z.B. Enzymen? In dieser Folge lernst du dies am Beispiel von E. coli. Das ist ein Prokaryot, der je nach An-/Abwesenheit der Laktose (Substrat) die Produktion von Laktose-abbauendem Enzym induziert (Induktion) oder eben nicht. Viel Spaß! Link zum Skript (Staffel 3): https://lnk.bio/NS3w

Das Skript findest du hier! Wie wird die mRNA eigentlich übersetzt? Bzw. translatiert? Gemeinsam mit Fiona (Specialguest! Juhu!!) besprechen wir: 1) Welche Eigenschaften hat der genetische Code? 2) Wie liest man die Codesonne? 3) Was passiert bei den Schritten der Translation? (Inititiation, Elongation, Termination) Viel Freude beim Lernen! #proteinbiosynthese #translation #biolernen #initiation #elongation #termination #ribosom #mRNA #proteine #genetischercode #biostudium #abi2022 #abi2023 #biologieunterricht

Kleine Lerneinheit oder Wiederholungssession für dich:) Auch HIER zum Mitdenken klicken! Warum überhaupt Proteinbiosynthese? Welche Schritte umfasst die Transkription? Was passiert dabei genau? Welche Proteine sind am Start? Wie ist das mit der Lese- und Synthese-Richtung? Wärmste Empfehlung! Im Skript kannst du nachlesen und findest Übungsaufgaben:) #proteinbiosynthese #biologielernen #biounterricht #schuleneudenken #lernentogo #schülerpodcast #biologiestudium #biologielernen #genetik #transkription #ribosom #mRNA #codogenerstrang #codierenderstrang #proteine #matrize

Eine weitere Grundwissen-Folge erwartet dich hier. Schau gerne im Skript nach: HIER. Abonniere @biologopodcast auf Instagram - hier findest du ebenfalls die entsprechenden Links. Bewerte den Podcast auf applepodcast oder iTunes. Wichtige Fachbegriffe: Doppelhelix, komplementär, antiparallel, Proteinbiosynthese, 3' und 5'-Ende, Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil, RNA, mRNA, tRNA, rRNA, Ribosom, ...

Viel hilft nicht immer viel. Dieses Motto gilt auch im Fitnesstraining. Doch woran kann ich mich jetzt eigentlich orientieren, wenn ich wissen möchte, wie häufig ich in der Woche mein Training absolvieren soll? In dieser Podcast-Folge setzt sich Moderator Niklas Brose mit den Themen Trainingsfrequenz, Superkompensation, Proteinbiosynthese und Regeneration auseinander. Web: otl.gmbh Instagram: www.instagram.com/onlinetrainerlizenz Facebook: www.facebook.com/onlinetrainerlizenz Blog: OTL-Blog

Mit Kirsten Brüning - Ernährungsberaterin zum Thema Eiweiß Mein heutiger Gast ist die Frankfurter Ernährungsberaterin Kirsten Brüning. Kirsten Brüning ist unter anderem seit 2002 als Ernährungsberaterin beim Olympiastützpunkt Hessen in Frankfurt am Main und seit 2003 beim Olympiastützpunkt Rhein-Neckar in Heidelberg für die Beratung von Leistungssportlerinnen und Sportlern zuständig. Wer den MainAthlet Podcast schon etwas länger verfolgt, weiß das Kirsten bereits in zwei früheren Folgen zu Gast war. Folge 1 Folge 2 Und nach knapp zwei Jahren wurde es einfach Zeit für ein weiteres Interview. In dieser Folge dreht sich alles rund um das Thema Eiweiß in der Ernährung. Dabei wollte ich wissen, welche Quellen es gibt, wie wichtig das Timing ist, ob ich nach einer Muskelverletzung mehr Eiweiß zu mir nehmen sollte und ich habe natürlich auch nach ein paar einfachen und schnellen Rezepten gefragt. Wenn ihr Fragen an Kirsten habt könnt ihr eine Mail an bruening@essentiell.biz schreiben. Und hier gibt es die Rezepte aus der Sendung: Linsenbolognese mit Tagliatelle Vegane Overnight-Oats Salat aus Buchweizen, Roter Bete und Orangen Tofu-Gemüse-Curry mit Reis und Nüssen Auszug aus dem Interview: Kirsten "Vielseitigkeit spielt eine große Rolle ganz genau. Wenn man's genauer betrachtet, ist es sogar sehr wertvoll, wenn man so ein bisschen diesen Trend der veganen Ernährung mit aufnimmt und sagt, ja, wenn ich jetzt natürlich auch mal vegane Eiweißquellen dazunehme, ich denke jetzt mal an Erbsen, Bohnen, Linsen. Da habe ich ja gleichzeitig auch viele Vitamine, Mineralstoffe, sekundäre Pflanzenstoffe mit dabei. Das kann ich als Athlet ja auch äh im Prinzip ganz weit nach vorne bringen, weil ich dann auch weniger Entzündungsfaktoren möglicherweise zu mir nehme..." Benjamin „Du hast jetzt auch eben Verletzungen angesprochen. Also so was spielt dann auch rein? Angenommen, ich habe einen Muskelfaserriss. Da muss ja dann auch Muskulatur neu geschaffen werden oder neu aufgebaut werden. Auch in solchen Phasen, in denen man ja eigentlich dann jetzt nicht das schwere Krafttraining macht, weil man ja verletzt ist, müsste man dann aber grundsätzlich auch so ein Stück weit mit der Eiweißzufuhr hochgehen?“ Kirsten „Also in der Reha-Phase sozusagen in der ersten Phase, bevor ich wieder die volle Belastung im Prinzip habe. Ist es tatsächlich interessant, dass man dann wirklich tatsächlich kleine Portionen an Eiweiß über den Tag verteilt zu sich nimmt, allein schon durch die Aufnahme von kleinen Mengen an Eiweiß wird quasi die Proteinbiosynthese in der Muskulatur schon angeregt...“ Unterstütze den Podcast über Steady https://steadyhq.com/de/mainathlet/about Hier gibts den Mainathlet Hoodie https://www.mainathlet.de/der-mainathlet-shop/ Schicke mir eine Sprachnachricht über WhatsApp https://api.whatsapp.com/message/UAJEVOFYOFSGK1 Melde Dich jetzt für den kostenlosen Mainathlet Newsletter an https://subscribe.newsletter2go.com/?n2g=a27dxmpz-8xsa5idv-9qn&_ga=2.198404652.2063471050.1568406075-1073508235.1567932383 Weitere Infos zum Mainathlet Leichtathletik Podcast findest Du ebenfalls auf Instagram und natürlich auch auf der Website.

Zusammenfassung Molekulargenetik

Volle Unterhaltung - Folge 027: Zwei Wochen Schule sind nun mal zwei zu viel. Noel und Linus würden lieber zurück in die Grundschule um ihrem wahren Talenten nachzugehen... Mülleimerdurchsuchen anstatt Proteinbiosynthese und Bragg-Reflektion lernen.

In dieser Episode des „The Age Of Iron Podcast” hatte ich die Ehre, meinen Kollegen Alexander Krump aka Coach Alexander Krump in der Show begrüßen zu dürfen. Bereits 2017 hatte ich das Vergnügen, gegen Alex auf der Bühne stehen zu dürfen. Seitdem sind wir immer wieder im Austausch. Daher weiß ich sehr gut, über welches Wissen Alex verfügt und dachte mir bereits im Voraus, dass die Folge sehr gut werden wird. In dieser Folge besprechen wir das Thema „Anpassungen der Ernährung an ein Kaloriendefizit“. Dabei gehen wir auf verschiedene Punkte wie Mahlzeitenfrequenz, Pre-, Intra- und Postworkoutnutrition, aber auch bspw. „Clean- vs. Dirty Meals“, „IIFYM“ und vieles mehr ein. Die Folge war eine Mischung zwischen Fakten und Erfahrung, die wir im Rahmen der letzten Jahre an uns selbst sowie unseren Klienten gemacht haben. Ich bin der festen Überzeugung, dass egal in welchem Fortschrittsgrad du aktuell bist, durch diese Folge etwas mitnehmen kannst.

In der heutigen Podcastfolge sprechen wir über die Schule, weil die Kinder dort heutzutage nicht das lernen, was sie im Leben brauchen.  Wie zum Beispiel die Steuererklärung, die Lohnabrechnung, die man bekommt wenn man ins Berufsleben einsteigt, wie das Banking abläuft online und offline, all die Dinge, die sie im Leben nach der Schule begleiten werden. Diese Dinge werden in der Schule nicht gelernt, aber Themen wie Mathe, das Thema Binominalverteilung, Opernanalyse im Musikunterricht, Proteinbiosynthese und DNA-Sequenzierung.  Hole dir jetzt auch gleich den spannenden Erfolgs-Newsletter von Monika Hermann. So viel wertvoller Input wartet wöchentlich auf dich: http://bit.ly/erfolgs-newsletter    "Der Unterschied zwischen Erfolg und Misserfolg in der Selbständigkeit!" Für Erfolg muss man regelmäßig etwas tun und wenn du ein System besitzt und konsequent bist, dann lässt sich der Erfolg nicht verhindern. Als Multiunternehmerin stelle ich immer wieder fest, dass viele Menschen blockiert sind, ob in der persönlichen Freiheit,  in ihrer Selbstständigkeit oder im Unternehmertum. Mein Name ist Monika Herrmann und meine persönliche Passion ist es Menschen zu helfen, genau diese Blockade zu durchbrechen. Und endlich die eigene Genialität voll und ganz zu leben!!! Wenn auch Du die Geheimnisse der Erfolgswelt kennen lernen möchtest, dann melde Dich JETZT gleich an: 

Reupload unserer beliebten Folge Alkohol und Sport. Wir besprechen die Folgen davon, die ein Vollrausch auf unseren Körper hat. Außerdem erläutern wir die Auswirkung von Alkohol auf unsere Regeneration und Proteinbiosynthese. Besucht unsere Website unter www.ppf-germany.com

Folge 041 - Ablauf der Translation (Biologie) | Genetik Teil 13 Show Notes: Bitte unterstützt den Biologie Passion Podcast finanziell ➤ paypal.me/biologiepassionpdcst Hier gehts zum zugehörigen Blogartikel auf meiner Webseite. Wenn dir die Podcastfolge gefallen hat, würde mich eine kurze Bewertung auf iTunes freuen. Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst. Vielen Dank fürs Zuhören!

Folge 039 - Proteinbiosynthese bei Prokaryoten und Eukaryoten | Genetik Teil 11 Show Notes: Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst! 

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Folge 038 - Genexpression (Proteinbiosynthese) | Genetik Teil 10 Show Notes: Bitte unterstützt den Biologie Passion Podcast finanziell ➤ paypal.me/biologiepassionpdcst Hier gehts zum zugehörigen Blogartikel auf meiner Webseite. Wenn dir die Podcastfolge gefallen hat, würde mich eine kurze Bewertung auf iTunes freuen. Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst. Vielen Dank fürs Zuhören!

Folge 038 - Genexpression (Proteinbiosynthese) | Genetik Teil 10 Show Notes: Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst! 

In dieser Folge meiner Schulreihe im Fach Biologie geht es um die Proteinbiosynthese. Was sind Proteine? Wie entstehen sie und woher kommen Sie? All das sowie die Fachbegriffe Translation und Transkription wird euch in diesem Podcast erklärt. Viel Spaß beim hören und lernen

Mit dem was wir essen haben wir einen direkten Einfluss wie wir uns entwickeln, fühlen und wie es uns geht. Jedes Tier weiß was es essen soll. Legt man einem Löwen einen Salatkopf hin, wird er ihn nicht anrühren. Jedes Tier ernährt sich seiner Art entsprechend, ohne einen Experten zu fragen. Nur wir Menschen stellen uns Fragen wie: Was ist gesund? Was soll ich essen? Genau diese Fragen hat Arthur Urich sich vor mehr als 7 Jahren auch gestellt und festgestellt, dass es sehr viele unterschiedliche Ratschläge zum Thema Ernährung gibt. Seitdem brennt er für das Thema Gesundheit und beschäftigt sich täglich mich den Themen gesunde Ernährung, Fitness und einem gesunden Lebensstil. 2017 hat Arthur sein Hobby zum Beruf gemacht: seit diesem Jahr arbeitet er im Gesundheitsbereich und zeigt Leuten auf, wie Sie Ihre Ernährung gesund gestalten können und sich dadurch vitaler und fitter fühlen. Mein Pitch: Gesundheit kann nicht kompliziert sein! Was bedeutet gesunde Ernährung für dich? Gesunde Ernährung bedeutet für mich, dass die Ernährung dazu dient Langfristig gesund zu bleiben (nicht krank zu werden) langfristig physisch und psychisch leistungsfähig zu bleiben die Immunfunktion und Wundheilung zu optimieren genügend Nährstoffe, Baustoffe und Mikronährstoffe sowie Energie für den Muskelaufbau und körperliche Höchstleistung bereit zu stellen. Gesundheit und Leistungsfähigkeit gehören zusammen. Ein kranker Körper ist nicht zu Höchstleistungen fähig. Auch sind ständige Verletzungen nicht gesund und verhindern Leistungsfähigkeit. Gesunde Ernährung ALLEINE macht jedoch keinen Sinn. Es geht darum einen gesunden Lebensstil zu führen: Besonders wichtig dabei sind Schlaf, Bewegung und Stressbewältigung. Und warum ist dir gesunde Ernährung so wichtig? Ich erkläre das mal anhand eines Beispiels: Wenn eine Biene Honig isst, dann wird sie zur Arbeiterbiene. Bekommt dieselbe Biene jedoch Gelee Royale zu essen, wird sie zur Bienenkönigin. Das bedeutet die Biene hat durch ihre Nahrung Ihren Phenotyp geändert (=äußere Erscheinung). Dasselbe passiert auch bei uns Menschen. Unsere Ernährung kann wie bei den Bienen bestimmte Gene an- und ausschalten. Das bedeutet wir haben mit dem WAS wir essen einen direkten Einfluss darauf wie wir uns entwickeln. Was möchtest du erreichen? Ich möchte Menschen bewusst machen, welchen Einfluss ihre Ernährung auf die Gesundheit hat. Das Thema Ernährung wird heute viel zu kompliziert gemacht. Jeder hat eine andere Empfehlung: da gibt es Low Carb, Low Fat, Vegane Ernährung, Rohkost usw. Ich möchte, dass jeder versteht worauf es ankommt und das die Leute zu einer natürlichen, artgerechten Ernährung zurückkehren. Worauf sollten Sportler bei ihrer Ernährung achten? Ich möchte zunächst einmal die Bedeutung der einzelnen Makronährstoffe erklären. Makronährstoffe sind Proteine, Fette und Kohlenhydrate Proteine  Proteine bestehen aus einer "Kette" von Aminosäuren. Diese Kette muss, wenn mit der Nahrung aufgenommen, erst mal in seine einzelnen Bestandteile, den Aminosäuren, zerlegt werden. Daher dauert es länger, bis sie aufgenommen werden. Es gibt 20 verschiedenen Aminosäuren. Davon sind 8 essentiell, d. h. diese müssen unserem Körper von außen zugeführt werden. Auch unser Immunsystem wird aus Proteinen gebildet. Für ein potentes Immunsystem benötigt unser Körper 1,5 g Protein pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. Unter 1,5 g Protein pro kg/KG ist z. B. die Wundheilung gestört. Unser Darm nimmt in der Regel nur einzelne Aminosäuren auf. Den größten Effekt auf den Proteinstoffwechsel haben tatsächlich die essentiellen Aminosäuren und allen voran Leucin. Leucin ist die anabolste Aminosäure (d. h. die Aminosäure, welche am meisten muskelfördernd ist). Hering, Makrele, Leber, Käse aber auch Linsen und weiße Bohnen haben einen hohen Gehalt an Leucin. (am besten nimmt man 3g Leucin nach dem Training zu sich. Dieses leitet die Proteinbiosynthese ein) Gesunde Quellen für Proteine sind, angefangen mit den Nährstoffreichsten: Meeresfrüchte wie Austern, Krabben, Shrimps Kaltwasserfische wie Makrele, Hering, Wildlachs und Sardinen Organfleisch: D. h. Leber, Herz usw. von Tieren aus artgerechter Haltung wie Rind, Lamm und Schwein Eier aus Freilandhaltung Milchprodukte von Kühen aus Weidehaltung Nüsse und Samen ab und zu Hühnerfleisch Was sollte ich für eine optimale Leistungsfähigkeit essen? Sport verbraucht unsere Glykogenspeicher, das bedeutet diese sollten nach dem Training wieder aufgefüllt werden. Am besten in Form von Traubenzucker und Stärke. Wie sieht es mit Protein aus? Vor, während oder nach dem Training? Es gibt ja viele verschiedene Empfehlungen… Die schnellere Verdauung von freien Aminosäuren verschafft ihnen einen Vorteil in der Zeit rund ums Training und in Hinsicht auf das Hormonmileau und die Muskelproteinsynthese. Auch wenn die Untersuchungen inkonsistent sind, würde ich "sicherheitshalber" Protein rund um ein Training empfehlen. Als Beispiel, eine Untersuchung aus dem Jahre 2006: Bei Patienten mit Kreuzbandverletzungen führte eine Proteingabe direkt nach dem Rehatraining zu besseren Ergebnissen hinsichtlich Muskelaufbau und Wundheilung als die Gabe eines Placebos. (Holm L und Kollegen 2006). Sicherheitshalber sollte man 15 g Protein vor dem Training und 20 – 30 g Protein nach dem Training zu sich nehmen. Ob in Form von Nahrung, Proteinpulver oder essentiellen Aminosäuren ist weniger wichtig für unseren Körper als überhaupt etwas davon aufzunehmen. Wheyprotein als Beispiel ist ein sehr hochwertiges und vollständiges Protein mit positiven Wirkungen auf Wundheilung und Immunsystem und daher auch sehr interessant für Sportler. Wie hast du es geschafft deine Leidenschaft zu finden?          Vor knapp 7 Jahren habe ich mir beim Fußball das vordere Kreuzband gerissen und seitdem kann ich leider kein Fußball mehr spielen. Da ich fit bleiben wollte begann ich mit dem Fitnesstraining und begann von da an mich zum ersten Mal mit dem Thema Gesundheit zu beschäftigen.  Mein bester Ratschlag den ich je erhalten habe: Man bereut nicht die Dinge, die man getan hat - sondern die Dinge, die man nicht getan hat! Buchempfehlung:  Die Paläo-Therapie von Sarah Ballantyne Kontaktdaten:  Arthur Urich www.gesunddurchdentag.de https://www.facebook.com/arthur.ich.5 https://www.instagram.com/arthur_urich/ Links zu eigenen Produkten: www.gesunddurchdentag.de Viel Freude guten Appetit beim Ausprobieren. Ich freu mich auf deinen Kommentar, wie gesunde Ernährung deine Sportergebnisse verändern. Alles Liebe Peggy PS: Bleib informiert & abonniere meinen Podcast unter freigeist_gedankenurlaub/itunes PPS: Stell uns deine Fragen! Hinterlass uns dazu deinen Kommentar oder schreib eine Email an p.seegy@icloud.com.

Vor Beginn dieser Arbeit war ein A. fumigatus-Protein (Chp: CipC homologes Protein) mit unbekannter Funktion und hoher Homologie zum CipC-Protein aus A. nidulans als prominentes hyphenspezifisches Protein identifiziert worden (Schwienbacher, 2005). Weiterhin gab es zu diesem Zeitpunkt Hinweise, dass ein zu CipC homologes Protein in C. neoformans eine wichtige Rolle während der Virulenz spielt (Steen et al., 2003). In dieser Arbeit sollte die biologische Funktion des pilzspezifischen Proteins genauer untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen Chp, mehrere Reporterstämme sowie eine Deletionsmutante hergestellt. Die erhobenen Daten zeigen, dass Chp als Monomer im Cytosol der Hyphen vorliegt. Dabei zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung eines GFP-Fusionsproteins innerhalb der Hyphen; nur die Vakuolen schienen ausgespart. Die Identifikation des Proteins auf der Sporenoberfläche von A. fumigatus (Asif et al., 2006) wurde wiederlegt und die differentielle Expression des Proteins bestätigt. Anders als in A. nidulans (Melin et al., 2002) wirkt das Antibiotikum Concanamycin A auf die Bildung von Chp in A. fumigatus nicht induzierend. Da diese Tatsache sowohl für die Na-mensgebung von CipC, als auch für die Namensgebung von Chp verantwortlich war, sollte das A. fumigatus-Protein umbenannt werden. Die Wahl des Namens fiel auf NrpA (Nitrogen regulated protein A), da die Bildung des Proteins von der N-Quelle abhängig ist. Die N-abhängige Regulation war für ein homologes F. fujikuroi Gen auf RNA-Ebene bereits bekannt (Teichert et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte sie in A. fumigatus und erstmals auf Proteinebene bestätigt werden. Desweiteren wurden auch neue N-Quellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass NrpA in Anwesenheit der N-Quellen Glutamat, Nitrat oder Harnstoff nicht gebildet wird, wohin-gegen Komplexmedien sowie die N-Quellen Ammonium, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Valin und Tryptophan zur Bildung des Proteins führen. In Kombination einer induzierenden und einer unterdrückenden N-Quelle dominiert stets die induzierende. In Reporterstämmen (gfp; lacZ) fand diese negative Regulation der Bildung von NrpA nicht statt. Das Protein wurde sowohl in Anwesenheit einer normalerweise unterdrückenden N-Quelle, als auch in den Sporen gebildet. Weiterhin nimmt die gebildete Menge von NrpA sowohl bei längeren Inkubationszeiten, als auch bei Verwendung höherer Animpfdichten zu. Wird der Pilz zunächst mit einer die NrpA-Bildung unterdrückenden N-Quelle angezogen und dann in Medium mit einer induzierenden N-Quelle umgesetzt, dauert es 6 h bis eine Bildung von NrpA verzeichnet werden kann. Diese Zeitspanne blieb auch in einem inversen Experiment gleich. Als nächstes wurde untersucht, ob NrpA in A. fumigatus unter Stressbedingungen von Bedeutung ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl osmotischer Stress, als auch oxidativer Stress, der durch Menadion verursacht wird, kei-ne Auswirkung auf die gebildete NrpA-Menge hat. Dagegen führt durch H2O2 verursachter Stress zu einem veränderten Laufverhalten von NrpA in SDS-Gelen. Das Protein scheint unter diesen Umständen ein höheres Molekulargewicht zu haben. Mithilfe eines A. fumigatus-Reporterstammes, der ein NrpA-GFP-Fusionsprotein bildet, konnte gezeigt werden, dass H2O2 auch zu einer veränderten Lokalisation von NrpA führt. Das sonst gleichmäßig in den Hyphen verteilte Protein formierte sich in punktförmigen Strukturen. Auch unter Mangelbedingungen spielt NrpA keine wichtige Rolle, denn weder ein C- noch ein N-Mangel verändert die gebildete Menge des Proteins. Dient die normalerweise die NrpA-Bildung induzierende N-Quelle Glutamin als C- und N-Quelle wird NrpA nicht gebildet. Ebenso wie in F. fujikuroi (Teichert et al., 2002) wird die Bildung des NrpA-Proteins durch MSX, einem Inhibitor der Glutaminsynthetase, fast vollständig inhibiert. Anders als in F. fujikuroi (Teichert et al., 2006) verursachte die Inhibierung der TOR-Kinase durch Rapamycin keinen Effekt auf die Bildung von NrpA. Auch durch eine her-gestellte Deletionsmutante konnte die biologische Funktion von NrpA nicht geklärt werden. In zahlreichen vergleichenden Untersuchungen verhielt sich die Mutante ebenso wie der Wildtyp. Der einzige dokumentierte Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp ist eine verstärkte Bil-dung der Katalase 1 in der Deletionsmutante. Anders als angenommen spielt NrpA während der Virulenz von A. fumigatus keine Rolle. In einem Virulenzmodell in embryonierten Hühnereiern verhielten sich Deletionsmutante und Wildtyp gleich. Auch in murinen Makrophagen führten die Deletionsmutante und der Wildtyp etwa zu vergleichbaren Mengen an ausgeschüttetem IL-10 und TNFα. Ein potentieller Nutzen von NrpA bei der Diagnose der allergischen bronchoalveolaren Aspergillose (ABPA) konnte ebenso ausgeschlossen werden. Neben NrpA waren im Vergleich der Proteinmuster der verschiedenen A. fumigatus-Morphotypen auch weitere differentiell exprimierte Proteine aufgefallen. Eines davon war eine MnSOD (Aspf6), die bis dahin auch als mitochondriale MnSOD bezeichnet wurde (Rementeria et al., 2007). Da im Genom von A. fumigatus aber eine weitere MnSOD kodiert ist, die über eine putative Mitochondriensignalsequenz verfügt, sollte in einem zweiten Teil der Arbeit die tat-sächliche Lokalisation dieses Proteins gezeigt werden. Dafür wurden zunächst monoklonale Antikörper gegen das Protein hergestellt. Eine mitochondriale Lokalisation der MnSOD mit puta-tiver Signalsequenz konnte gezeigt werden. Dabei wurden sowohl Western-Blots als auch ein A. fumigatus-GFP-Reporterstamm verwendet. Weiterhin konnte das Protein genauer charakteri-siert werden. Im Gegensatz zu Aspf6, das nur in den Hyphen des Pilzes zu finden ist, wurde die mitochondriale MnSOD sowohl in den Sporen, als auch in den Hyphen nachgewiesen. Die gebil-dete Menge des Proteins verändert sich im Zeitverlauf nicht. Lediglich zu sehr späten Wachs-tumszeitpunkten in der späten stationären Phase war ein leichter Anstieg zu beobachten. Die gebildete Menge des Proteins hing auch nicht von der Animpfdichte der Kultur ab. Anders als Aspf6, das bekannterweise ein Homotetramer bildet (Flückiger et al., 2002), scheint die mitochondriale MnSOD als Dimer vorzuliegen. Auch in Antwort auf oxidativen Stress verhielten sich die beiden MnSODs unterschiedlich. Menadion, das innerhalb der Zelle die Bildung von Su-peroxidanionen bewirkt, führte zu einem leichten Anstieg der Proteinmenge der mitochondrialen MnSOD, während Aspf6 unverändert blieb. Als Folge von oxidativem Stress, der durch H2O2 verursacht wird, zeigte Aspf6 eine leichte Verringerung, während die mitochondriale MnSOD schnell abgebaut wird. In einem dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der Atmung während der Auskeimung von A. fumigatus genauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteinbiosynthese für den Auskeimungsprozess unbedingt notwendig ist. Desweiteren wurde mit Hilfe unterschiedli-cher Methoden eine sehr frühe Aktivierung der Atmungskette während des Auskeimungspro-zesses nachgewiesen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sauerstoff für das Wachstum von A. fumigatus unbedingt erforderlich ist. Im anaeroben Milieu konnten die Konidien weder anschwellen noch auskeimen. Auch bereits vorhandene Hyphen konnten unter Abwesenheit von Sauerstoff nicht weiterwachsen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass A. fu-migatus anders als A. nidulans (Takasaki et al., 2004) nicht über die Fähigkeit verfügt, im Anae-roben durch eine Fermentation von Ammonium zu überleben. In dieser Arbeit wurde ebenso wie in anderen aktuellen Arbeiten (Williger et al., 2008) die Fähigkeit von A. fumigatus, in hypoxischen Umgebungen zu wachsen, nachgewiesen.

Innerhalb des letzten Jahrhunderts intensiver Gedächtnisforschung ist es noch nicht gelungen, ein vollständiges und allgemein gültiges Modell für die Bildung von Langzeitgedächtnis zu entwickeln. Einige neuronale Moleküle, insbesondere Proteinkinasen und Transkriptionsfaktoren, scheinen hierbei in bestimmten Hirnregionen, deren Einbeziehung vom Lerntest abhängig ist, eine essentielle Bedeutung zu haben. Welche Rolle die lerninduzierte Neu-Expression von Genen (Transkription bzw. Translation) einnimmt, die als Teilprozesse der Konsolidierung postuliert werden, ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Die Bedeutung dieser Teilprozesse wurde in dieser Arbeit bei Mäusen unter Verwendung von zwei hippokampusabhängigen Lerntests (auditorische trace-Konditionierung und kontextuelle Konditionierung) näher untersucht. Die drei hierbei im Vordergrund stehenden Aspekte waren die pharmakologische Validierung der Lerntests, der regionenspezifische Nachweis neuronaler Aktivierung und Untersuchungen zur Expression lernspezifischer Gene. Die pharmakologische Validierung der beiden Tests zeigte, dass durch lokale Gabe der translationshemmenden Substanz Anisomycin in den dorsalen Hippokampus zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach dem Lernereignis das Gedächtnis beeinträchtigt ist. Die proteinsyntheseabhängige Phase ist bei der kontextuellen Konditionierung spätestens nach einer Stunde abgeschlossen. Demgegenüber hatte die Hemmung der Transkription mit Amanitin auf keinen der beiden Tests Einfluss auf die Gedächtnisbildung. Die neuronale Aktivierung, die anhand der Induktion ausgewählter Immediate early genes (IEGs) im Hippokampus untersucht wurde, sollte indirekt Hinweise auf Genexpression liefern. Die IEGs waren im Gegensatz zur Literatur bei trace-Konditionierung schwach induziert (zif268 mRNA in CA1 und CA3) bzw. bei kontextueller Konditionierung nicht nachweisbar (c-Fos Protein in CA1). Um alternativ dazu die neuronale Aktivierung bezüglich einer erhöhten Proteinbiosyntheserate zu untersuchen, wurde eine Methode etabliert und validiert, die den Einbau der [35S]-markierten Aminosäuren Methionin und Cystein in neu synthetisierte Proteine regionenspezifisch darstellt (funktionelle Proteinbiosynthese). Hierbei zeigte sich in der Subregion CA1 des dorsalen Hippokampus eine erhöhte Proteinbiosyntheseaktivität nach kontextueller Konditionierung. Ein besonderer Vorteil der Methode besteht darin, dass mit Hilfe der Autoradiogramme funktionelle Netzwerke aufgezeigt werden können, indem Korrelationen in der Proteinbiosyntheseaktivität zwischen verschiedenen Hirnregionen auf deren funktionelle Einheit im Zusammenhang mit dem Lerntest verweisen. Unserer Erkenntnis nach ist das einer der ersten Befunde, womit bei Mäusen erfolgreich lernbedingte Veränderungen der Proteinbiosynthese unter Wahrung neuroanatomischer Auflösung dargestellt werden konnten. Die Untersuchungen zur lerninduzierten Expression spezifischer Gene erfolgten auf Ebene der Proteine, da bei der pharmakologischen Validierung der Lerntests nicht gezeigt werden konnte, dass Transkriptionsprozesse für die Gedächtnisbildung essentiell sind. Ausgehend von einem Standardprotokoll der zweidimensionalen Gelelektrophorese wurden unter Verwendung der radioaktiven Markierung von Proteinen mit [35S]-Methionin/Cystein Verbesserungen dieses Verfahrens hinsichtlich Sensitivität und signal-to-noise ratio erzielt. Mit dem verbesserten Verfahren konnte ein Protein gefunden werden, das nach kontextueller Konditionierung im Vergleich zu unbehandelten Tieren eine Veränderung der Nettoladung (Verschiebung des isoelektrischen Punktes) aufweist, was auf einen Unterschied in der posttranslationalen Modifikation schließen lässt. Quantitative Unterschiede wurden nicht gefunden. Dies ließe sich damit erklären, dass die Verfahren zu Proteinextraktion vor allem zytosolische Proteine berücksichtigen, membranständige Proteine jedoch weitgehend vernachlässigen. Zusammengefasst wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Algorithmus etabliert, der sich auf vielfältige Art und Weise für Fragestellungen zur Charakterisierung lern- bzw. stressinduzierter Proteine unter Berücksichtigung neuroanatomischer Aspekte anwenden lässt. Berücksichtigt man, dass Anisomycin neben der Proteinsynthesehemmung auch andere zelluläre Prozesse beeinflusst, so fällt die vorliegende Arbeit kein abschließendes Urteil über die Rolle der Proteinbiosynthese bei hippokampusabhängigen Lernprozessen. Dies kann zu einem erheblichen Teil an der nichttopographischen Anatomie des Hippokampus liegen, so dass zukünftige Studien sich auf eng umrissene Hirnareale konzentrieren sollten.

Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern. So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt. Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing"). Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden. Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.

Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte. Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden, die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu 32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären Transformanten. Es war damit erstmals mit der Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC (S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich das Verhältnis von AEC → Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3 selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen „Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen universellen Selektionsmarker zu etablieren.

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom.

Das von (Licitra and Liu, 1996) entwickelte Hefe-3-Hybrid-System ermöglicht die in vivo Identifikation von Ligand-Rezeptor-Interaktionen. Es ist eine Weiterentwicklung des klassischen Hefe-2-Hybrid-Systems und beinhaltet den Einsatz eines synthetischen Hybridmoleküls. Der feste Bestandteil dieses Hybridmoleküls ist das Hormon Dexamethason, das über die Hormon-bindende Domäne des Glukokorticoidrezeptors in der Hefezelle verankert wird und kovalent mit einem Molekül verbunden ist, für das der Interaktionspartner gesucht wird. Ziel dieser Arbeit war es, das Hefe-3-Hybrid-System im Labor zu etablieren und das System zur Identifikation neuer Interaktionspartner für das Immunsuppressivum FK506 einzusetzen. Um das Hefe-3-Hybrid-System sensitiver zu gestalten, wurde zunächst der ABC-Transporter PDR5 deletiert, der an dem Export von Steroidhormonen beteiligt ist. Dabei wurde gezeigt, daß der Pdr5-Transporter auch chemisch modifizierte Steroidhormone wie beispielsweise Dexamethason-Linker transportiert. Darüberhinaus wurden zwei Aminosäurepositionen innerhalb der Hormon-bindenden Domäne des Glukokorticoidrezeptors identifiziert, die entscheidend zur die Aktivierbarkeit des Rezeptors beitragen. Im Rahmen des durchgeführten 3-Hybrid-Screens wurde zusätzlich zu dem bekannten FK506- Bindeprotein, FKBP12, eine unbekannte, C-terminal verkürzte Spleißvariante von Antizym- Inhibitor als neuer Interaktor für FK506 identifiziert. Die Interaktion war FK506-spezifisch, da keine Interaktion mit anderen an Dexamethason gekoppelten Liganden nachzuweisen war. Die im 3-Hybrid-Screen isolierte Spleißvariante wurde zusätzlich über RT-PCR amplifiziert, wobei noch eine weitere Spleißform von Antizym-Inhibitor identifiziert werden konnte. Es wurde gezeigt, daß beide Formen ubiquitär exprimiert werden und Homologe in der Maus existieren. Antizym-Inhibitor ist an der Regulation der Polyaminbiosynthese beteiligt. Polyamine spielen für das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Proteinbiosynthese eine essentielle Rolle. Die Aktivität von Antizym-Inhibitor wird anhand seiner Fähigkeit bestimmt, Ornithin- Decarboxylase (ODC, EC 4.1.1.17) aus dem inhibitorischen Komplex mit Antizym freizusetzen. Die freigesetzte ODC-Aktivität gibt somit Auskunft über die Antizym-Inhibitor- Aktivität. Bei den Antizymen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die aus vier Mitgliedern besteht, deren Interaktion mit Antizym-Inhibitor bislang nur für Antizym 1 beschrieben ist. Für die Charakterisierung der Antizym-Inhibitor-Spleißvarianten, wurde ein nichtradioaktiver Aktivitätsassay entwickelt, der auf der funktionellen Expression von humaner ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beruht. Dabei wurde gezeigt, daß humane ODC die Deletion der Hefe-ODC (∆spe1) komplementiert und so das Hefezellwachstum auf Polyamin-freiem Medium ermöglicht. Dieser Assay erwies sich auch als geeignet für ein Hochdurchsatzverfahren (HTS) zur Identifikation von ODCInhibitoren. Die Koexpression von Antizym führte zu einer Wachstumshemmung, die auf einem Polyaminmangel beruht und durch Zugabe von Putrescin, oder durch die zusätzliche Koexpression von Antizym-Inhibitor wieder aufgehoben werden konnte. Darüber hinaus wurde ein 3-Hybrid-Assay für den Proteinkomplex aus ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor entwickelt. Hiermit wurde untersucht, inwieweit Antizym-Inhibitor die Heterodimerisierung zwischen ODC und Antizym unterbindet. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte erstmals gezeigt werden, daß Antizym-Inhibitor in der Lage ist, an alle Proteine der Antizym-Familie zu binden und ODC aus dem Komplex mit Antizym 1, 2, 3 und 4 verdrängt. Bislang war dies nur für Antizym 1 beschrieben. Desweiteren wurde für das noch nicht charakterisierte Mitglied der Antizym-Familie, Antizym 4, gezeigt, daß auch dieses an ODC bindet und die Aktivität der ODC hemmt. Die C-terminal verkürzte Spleißvariante konnte zwar an die Antizyme 1, 2 und 3 binden, war jedoch nicht der Lage, ODC aus dem Komplex freizusetzen. Um die Antizym-Bindungsdomäne von Antizym-Inhibitor weiter zu charakterisieren, wurden Fragmente hergestellt mit deren Hilfe die Antizym-Bindungsdomäne auf einen Bereich von Leucin45 bis Serin300 eingegrenzt werden konnte. Die Antizym-Bindungsdomäne überlappt dabei mit der FK506-Bindungsdomäne, die vollständige Form von Antizym-Inhibitor bindet interessanterweise nicht an FK506. Zusammengefaßt zeigt dies, daß der C-Terminus von Antizym-Inhibitor von großer Bedeutung für die Konformation des Proteins ist und einen wichtigen Beitrag zur Stabilisierung der Antizym / Antizym-Inhibitor-Interaktion leistet. Die Relevanz der in der Hefe gewonnenen Daten wurde abschließend mit HEK 293-Zellextrakten überprüft. Die Komplexbildung der transient exprimierten Proteine ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor konnte durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Damit wurde gezeigt, daß die Hefe-Daten auf höhere Organismen übertragen werden können.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.