Podcasts about denaturierung

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Bis vor wenigen Jahren war es üblich, Gehirne von Rindern und Schweinen in Fleischerzeugnisse zu mischen. Erst nachdem die Bovine Spongiforme Enzephalopathie entdeckt worden war, wurde Rindergehirn zum Spezifizierten Risikomaterial deklariert, da bei einer Infektion vor allem in diesem Organ die pathogenen Prionen vorhanden sind. Daraufhin entwickelte Testsysteme zum Nachweis von ZNS in Fleischerzeugnissen ermöglichten keinen gezielten Nachweis von bovinem Nervengewebe. Dies führte im Falle eines Testsystems zu falschpositiven Ergebnissen bei Schweinefleisch und Geflügelfleisch, begleitet von wirtschaftlichen Folgen für die Hersteller von Fleischerzeugnissen. In dieser Arbeit wurde ein speziesspezifisches Nachweisverfahren für bovines Nervengewebe in Fleischerzeugnissen entwickelt. Dabei handelt es sich um einen indirekten ELISA, der auf der Detektion des Myelin Basic Protein (MBP) basiert. Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers wird ein kontinuierliches Epitop dieses Proteins nachgewiesen. Diese Epitop ist wahrscheinlich auch dafür verantwortlich, dass der Nachweis des MBP auch nach lang anhaltenden und hohen Temperaturen, die zur Denaturierung anderer Proteine führen würden, noch möglich ist. Die Nachweisgrenze konnte auf 0,1 % Rindergehirn in Brühwurst bzw. Fleischerzeugnissen mit einem Cut-off von 0.500 festgelegt werden. Damit stellt der etablierte MBP-ELISA ein sensitives Verfahren dar, welches den speziesspezifischen Nachweis von bovinem Nervengewebe in Fleischerzeugnissen ermöglicht. Für den Verbraucherschutz wird mit dem MBP-ELISA die Möglichkeit eröffnet, das Verwendungsverbot von Rindergehirn zu kontrollieren.

Untersuchung der Reaktionszyklen von Chaperoninen aus Escherichia coli und Thermoplasma acidophilum mit Hilfe der Neutronenkleinwinkelstreuung Am Thermosom wurden bisher noch keine Komplexe untersucht. Hier war von großem Vorteil, daß bei SANS kein Strahlenschaden auftritt und damit Proben modifiziert und anschließend noch einmal gemessen werden konnten. a) b) c) Abbildung 5.2: schematische Darstellung verschiedener Thermosom-Konformationen: a) offenen Konformation, b) geschlossene Konformation c) Bullet-Konformation Ergebnisse Ergebnisse zu GroE - Zum Verständnis der allosterischen Wechselwirkungen innerhalb von GroEL wurde die Lösungsstruktur einer „single-ring“-Mutante von GroEL untersucht. Die Strukturen von apo-single-ring-GroEL und ADP-Komplexen aus protoniertem singlering- GroEL und protoniertem GroES unterscheiden sich nicht oder nicht meßbar von den entsprechenden Strukturen im Kristall. Bei einer Messung mit ADP-Komplexen aus unsichtbarem single-ring-GroEL und sichtbarem GroES wurde dagegen in der Lösungsstruktur eine im Kristall nicht vorhandene Konformationsänderung von GroES beobachtet. Dies bestätigt frühere mit wild-type GroEL durchgeführte Versuche. - Symmetrische Komplexe aus GroEL und GroES, sogenannte Football-Komplexe, werden als wichtiger Zwischenschritt im GroE-Reaktionszyklus diskutiert. In Anwesenheit von AMP-PNP konnten Football-Komplexe aus protoniertem, gematchtem GroEL und deuteriertem GroES nachgewiesen werden. In der Neutronenstreuung zeigen diese Komplexe eine charakteristische Hantelstruktur. Die beiden GroES-Moleküle haben einen Abstand von ca. 200Å (siehe Pfeil in Abb. 5.1c). Mit einer Titratonsreihe konnten wir die Dissoziationskonstante des zweiten GroES-Heptamers in diesen Komplexen mit einem Wert von 2×10-7M bestimmen. - Der Phage T4 hat ein Gen für ein eigenes Co-Chaperonin, GP31, das eine starke Analogie zu GroES aufweist. Wir verglichen die beiden Co-Chaperonine, um zu verstehen, warum GP31 lebenswichtig für den Phagen ist. Aus GroEL und GP31 wurden dazu in Anwesenheit von AMP-PNP Football-Komplexe gebildet. Bei diesen Komplexen ist das Co-Chaperonin etwa 5Å weiter vom Zentrum des Gesamtkomplexes entfernt, als im Fall der GroEL-GroES-Komplexe. Dieses Ergebnis unterstützt die These, GP31 sei nötig, um für die Faltung des Phagenproteins GP23 einen größeren Anfinsen-Cage zu schaffen. GP31 scheint unter vergleichbaren Bedingungen stärker zur Bildung von Football-Komplexen zu neigen als GroES. Bei der Bindung an GroEL ändern GP31 und GroES ihre Konformation. - In Verdrängungsversuchen wurde das Bindungsverhalten von GroES und GP31 an GroEL untersucht. Hierzu wurden mit Hilfe von ADP-Komplexen aus sichtbarem GroEL mit sichtbarem Co-Chaperonin vorgeformt. Das sichtbare Co-Chaperonin wurde dann mit unsichtbarem GroES verdrängt, so daß in den neugebildeten Komplexen nur noch GroEL ein Streusignal gab. Die beobachteten Zerfallsreaktionen mit Halbwertszeiten in der Größenordnung von Stunden lassen sich mit zwei Exponentialfunktionen beschreiben. Dies ist ein Indiz für das Auftreten von verschiedenen Populationen an GroEL-Co-Chaperonin-Komplexen. In allen Fällen waren die Dissoziationsraten bei den GroEL-GP31-Komplexe geringer als bei GroEL-GroES-Komplexen. Komplexe von GroEL mit GP31 sind also stabiler als solche mit GroES. - Bei einer Reihe von Versuchen mit GroEL und Substratprotein (MPB-Y283D) konnten unter anderem 1:2 Komplexe aus GroEL und Substrat und Trans-Komplexe aus GroEL, GroES und Substrat nachgewiesen werden. Diese Experimente zeigten übereinstimmend einen Abstand von 60Å des MPB zum Zentrum von GroEL. Wegen der notwendigen Denaturierung von MBP und anderen Substratproteinen wurden jedoch die Streukurven sehr häufig von Aggregaten gestört. SANS-Experimente mit Substratprotein sind daher wesentlich schwieriger als Versuche mit GroES oder GP31. Ergebnisse zum Thermosom - Die geschlossene Konformation von Thermosom in der Kristallstruktur rührt nicht von der Bindung von Mg-ADP-AIF3 her, sondern vom für die Kristallisation verwendeten Ammoniumsulfat . In Anwesenheit von ADP mit 2M Phosphat, schließt sich das Thermosom auch in physiologischem Puffer. Durch die hohe Phosphat- Konzentration ist davon auszugehen, daß sich in den Nukleotidbindungstaschen des Proteins neben ADP freie Phosphat-Ionen befinden. Die Konformation entspricht also dem Zustand unmittelbar nach der ATP-Spaltung. Wird die Probe auf 50°, die physiologische Temperatur von T. acidophilum, erwärmt, schließt sich das Thermosom in Anwesenheit von ATP. In Kombination mit den Messungen an anderen Thermosom-Nukleotid-Komplexen konnten damit Zwischenzustände im strukturellen Reaktionszyklus des Chaperonins charakterisiert werden. - Bei einer Reihe von Pufferbedingungen wurde die Bildung von Komplexen höherer Ordnung beobachtet. Von anderen Autoren war aufgrund von EM-Arbeiten vorgeschlagen worden, daß Thermosom kein Chaperonin, sondern ein Baustein des Cytoskeletts ist (Trent et al., 1997, 1998). Für die von uns gefundenen Strukturen sind Thermosom-Filamente jedoch keine befriedigenden Modelle. Da sich diese Komplexe höherer Ordnung in der Lösung außerdem bei einer Annäherung an physiologische Bedingungen auflösen, kann davon ausgegangen werden, daß sie in vivo nicht relevant sind. methodische Ergebnisse - Es wurde gezeigt, daß GroEL und GroES einen sehr homogenen Deuterierungsgrad haben, wenn die Bakterien vor der Reinigung unter gut kontrollierten Wachstumsbedingungen im Fermenter gezogenen werden. Das Protein erscheint dann in Kontrastausgleichsexperimenten im geeigneten Puffer, in unserem Fall nahe 99% D2O, als unsichtbar. - In einer Reihe von „stopped-flow“-Messungen wurde gezeigt, daß mit SANS (bei einer Aufsummierung von Daten mehrerer Messungen) grundsätzlich eine Zeitauflösung bis in den Sekundenbereich bei Experimenten an GroEL oder vergleichbar großen Molekülen möglich ist. Um biologisch relevante Ergebnisse erreichen zu können, ist jedoch weitere Arbeit an der Instrumentierung, speziell der Mischapparatur nötig.