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Die hyperakute Abstossung stellt die unmittelbarste Hürde für die Leber-Xenotransplantation dar. Das Ziel dieser Arbeit war es die Bedeutung verschiedener Zellpopulationen für die Bildung von freien Radikalen während der hyperakuten Abstossung der xenotransplantierten Leber zu untersuchen. Wir befassten uns mit der Frage ob es einen Zusammenhang zwischen der FR-Freisetzung und der hyperakuten Abstossung gibt und welche Zellpopulationen hauptverantwortlich für den oxidativen Schaden während der hyperakuten Abstossung sind. In einem etablierten Xenoperfusions-System wurden Rattenlebern mit Perfusaten bestehend aus gezielt-isolierten Zellgruppen reperfundiert. Hierbei evaluierten wir ein Leukozytenfiltersystem und wendeten zur Thrombozytengewinnung ein validiertes Separations/Zentrifugationsprotokoll an. Sowohl die physiologische Zusammensetzung der Perfusate, als auch die physiologische Funktion der Zellen konnten durch Coulter Counter, P-Selektin Flowzytometrie und histologische Untersuchungen gewährleistet werden. Zur Erfassung der FR-Produktion, wurden die Lipidperoxidation, NO Abbauprodukte anhand der Griess–Reaktion, Peroxynitrikonzentration und der antioxidative Status mittels Glutathionkonzentration analysiert. Durch die Verwendung dieser Messmethoden, ließen sich freie Radikale nicht direkt messen und mögliche Zwischenprodukte oder Reaktionsschritte nicht vollständig erfassen, aber die Bestimmung derer stabilen Endprodukte bot uns die Möglichkeit auch ohne Hinzufügen von Chemikalien in das Perfusionssystem ein umfassendes Bild des oxidativen Stresses zu erfassen. Die Organfunktion wurde mittels der Galleproduktion und der Freisetzung von Leberenzyme kontrolliert. Der Potaldruck war ein wichtiger Messparameter für die Makrohämodynamik. Nach Ende der Perfusion wurden Gewebeproben zur histologischen Aufarbeitung mit der HE-, Esterase- und Komplementfärbung zum Nachweis der hyperakuten Abstossungsreaktion entnommen. Folgende Ergebnisse konnten wir zusammenfassend aus unseren Daten gewinnen: In unserem Modell der perfundierten Rattenleber gab es einen signifikanten Unterschied bezüglich der Freisetzung von ROS/RNS zwischen der isogenen und xenogenen Reperfusion mit Vollblut. In den xenogen perfundierten Gruppen hatten wir trotz Zeichen einer Komplementaktivierung, d.h. einer hyperakuten Abstossung, in den Versuchsgruppen mit geringen FR-Konzentrationen eine Reduktion der Leberschäden beobachtet. Wir konnten daraus folgern, die ROS-Bildung im engen Zusammenhang mit der Leberfunktion, dem Zellschaden und der hyperakuten Abstoßungsreaktion stand. Wir konnten in unserem Modell nun erstmals zeigen, dass die Aktivierung des Komplementsystems nur bei gleichzeitiger Anwesenheit von Leukozyten zur Freisetzung von radikalen Stickstoff- und Sauerstoffspezies führt, die dann wiederum die Schädigung des Gewebes und die Dysfunktion des Transplantates verursachen. Es gab signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Zellpopulationen hinsichtlich der Freisetzung von FR in unserem Xenotransplantations-Modell. Unsere Daten weisen darauf hin, dass in der Frühphase der hyperakuten Abstossung weder Erythrozyten noch Thrombozyten oder Hepatozyten eine große Rolle in der Freisetzung von FR spielen. Es ließen sich in den Erythrozyten-und Thrombozytengruppen keine signifikanten Unterschiede zur isogen perfundierten Kontrollgruppe finden. Hauptsächlich für den oxidativen Schaden - also Freisetzung von ROS und RNS - verantwortlich waren in unserem Modell die Leukozyten und in einem geringeren Maße die Kupfferzellen, aber nur in Kombination mit den Leukozyten. Die Leukozytendepletion durch die Filtration wirkte am protektivsten auf die Organfunktion, wogegen die Depletion von KC, nur die ROS-Freisetzung reduzierte, aber keinen protektiven Einfluss auf den Grad der hyperakute Abstossung und Organschädigung hatte. Die Anwesenheit von KC dagegen scheinen NO abzufangen und wirken bezüglich RNS protektiv. Unsere Daten tragen zu dem Verständnis der frühen Vorgänge und insbesondere der Rolle der Freien Radikale während der hyperakuten Abstossung in der Xenotransplantation der Leber bei. Eine Inhibierung oder Modulation der ROS-Freisetzung könnte eine viel versprechende Basis für einen therapeutischen Ansatz der hyperakuten Abstossung darstellen. Inwieweit eine gezielte pharmakologische Hemmung der Leukozytenaktivität und der Einsatz von FR spezifischen Scavengern zu einer Verminderung der hyperakuten Abstoßung von Xenotransplantaten bewirken können, bleibt Inhalt künftiger Untersuchungen.

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten analysiert. Durch die Kombination verschiedener gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die N-Termini von NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n) Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste massenspektrometrische Charakterisierung des NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden. Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen, niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13 niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen, membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen Charakterisierung mittels offline ESI-MS.

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Die vorliegende Dissertation widmet sich der Aufklärung der Absolutkonfiguration von neuartigen Pilzinhaltsstoffen aus bitter schmeckenden Röhrlingen der Gattung Boletus. Dazu werden stereo-selektive Synthesen von trisubstituierten δ -Lactonen durchgeführt. •(Z)-Selektive Darstellung des Lactons 22 Der ungesättigte Ester 42 mit (Z)-konfigurierter Doppelbindung kann selektiv durch Reaktion des von Ando entwickelten Horner-Emmons-Reagens 38 mit dem Aldehyd 41 hergestellt werden [(Z):(E) = 23:1]. Die Cyclisierung zum Lacton 22 gelingt in einer Ausbeute von 50% unter gleichzeitiger Abspaltung der Schutzgruppe. 1,4-Additionen metallorganischer Nucleophile an die ungesättigten22 42 Verknüpfung von Lacton und Arylring Durch Reaktion von Weinreb-Amid 50 und 2-Brompropen wird das α ,β -ungesättigte Keton 55 dargestellt, das in einer Sequenz aus Epoxidierung, regioselektiver radikalischer Oxiran-Öffnung und Veresterung in das Phosphonat 68 überführt wird. Eine intramolekulare Horner-Emmons-Reaktion unter sehr milden Bedingungen führt zum ungesättigten Lacton 63. Durch hoch diastereoselektive Epoxidierung erhält man 70, das als Racemat in einer achtstufigen Synthese mit 41% Gesamtausbeute ausgehend von 2,3-Dimethoxybenzoesäure zugänglich ist. Die hydrogenolytische Epoxid-Öffnung ergibt ein Gemisch der epimeren Modellverbindungen 71 und 72.OR Umsetzung des lithiierten MOM-geschützten Methylcatechols 53 mit dem literaturbekannten Weinreb-Amid (R)-52 und anschließende Veresterung liefert das Phosphonat 83. Dieses entspricht dem Intermediat 68 aus der Modellsynthese, trägt aber bereits den vollständig substituierten Aromaten und besitzt die stereochemische Information des Edukts (R)-39 (chiral pool). Die Reaktionsbedingung- en für die intramolekulare Horner-Emmons-Reaktion zum zentralen Zwischenprodukt 84 sowie die diastereoselektive Darstellung des Epoxids 85 können von der Modellstudie direkt übertragen werden. Abspaltung der MOM-Schutzgruppen in 84 ergibt Anhydrocalopin (93), das ausgehend von 3-Methyl- catechol in einer Gesamtausbeute von 14% über fünf Stufen dargestellt werden kann.Zusammenfassung 3 Umlagerung des Epoxids 85 bei gleichzeitiger Entschützung führt zu Dehydrocalopin (91), das als Enol vorliegt. Die Synthese von Dehydrocalopin (91) gelingt über sechs Stufen in einer Ausbeute von 13%. Nach Öffnung des Epoxids 85 in Benzylposition wird der Naturstoff 1 im Gemisch mit seinem β -Epimeren 89 erhalten. Calopin (1) kann massenspektroskopisch sowie durch Vergleich der 1 H-NMR-Spektren nachgewiesen werden. •Synthese von (+)-9-Desmethyl-7,8-didesoxycalopin (114) In einem neuen, vollständig veränderten Syntheseweg wird die Stereochemie des substituierten Lactons nicht in Bezug zur γ -Methylgruppe erstellt, sondern im Zuge einer auxiliargesteuerten En-Reaktion bei der Knüpfung der Bindung zwischen C α und C β aufgebaut. Diese Strategie führt zur erwünschten Relativkonfiguration des δ -Lactons. Die Reaktion von Phenylmenthylglyoxylat 96 mit dem Styrolderivat 99 liefert selektiv den α -Hydroxyester 101, dessen absolute Konfiguration durch eine Röntgenstrukturanalyse nachgewiesen wird. Nach Hydroborierung des Homoallylalkohols 101 und Cyclisierung wird ausschließlich das unerwünschte all-cis-Lacton 103 in einer Gesamtausbeute von 51% über drei Syntheseschritte erhalten. Die Konfiguration wird durch eine Röntgenstrukturanalyse zweifelsfrei bestimmt.sämtlicher Korrekturversuche bei der Hydroborierung macht eine Epimerisierung in γ -Position nach Oxidation des primären Alkohols 109 zum Aldehyd notwendig. Bei der anschließenden Reduktion des Epimerengemisches mit Natriumborhydrid cyclisiert das gewünschte Epimer sofort, während der diastereomere Alkohol zurückgewonnen werden kann. Abspaltung des Silylethers liefert (+)-9-Des-methyl- 7,8-didesoxycalopin (114). Die Gesamtausbeute an 114 beläuft sich auf 11% über neun Stufen ausgehend von Glyoxylat 96 und Styrol 99. •Darstellung des vollständig substituierten α -Hydroxyesters 138 als Schlüssel-Intermediat der Calopin-Synthese sowie des all-cis-Lactons 140 Nach der Darstellung der wichtigen Modellverbindung 114 wird eine Methode zur Einführung des vollständigen aromatischen Substitutionsmusters von Calopin ausgearbeitet. Die Grundlage hierfür bietet die ortho-Lithierung des MOM-geschützten Methylcatechols 53. Formylierung mit DMF gefolgt von einer Wittig-Reaktion führt zum Styrolderivat 127, das nach einem Wechsel der Catechol-Schutzgruppen für die En-Reaktion zur Verfügung steht. Innerhalb einer Versuchsreihe weisen sowohl der ortho-Nitrobenzylether 132 als auch der 3,4-Di-chlorbenzylether 133 die geforderte Stabilität zur Durchführung der En-Reaktion auf. 133 sollte im Unterschied zur Nitroverbindung 132 bei den nachfolgenden Schritten aber zu weniger Nebenreak-tionen neigen und bietet zudem die Möglichkeit, am Ende der Synthese unter milden Bedingungen abgespalten werden zu können. Der α -Hydroxyester 138 kann ausgehend von 3-Methylcatechol (79) in einer Ausbeute von 30% über sechs Reaktionsschritte hergestellt werden (analog 136 in 33%). Die Hydroborierung von 136, gefolgt von einer Cyclisierung, führt zum all-cis-Lacton 140. Aufklärung der Absolutkonfiguration der Calopine Mit dem Modell (2S,3R,4S)-114 als Vergleichsverbindung bekannter Konfiguration ermöglicht die Hochfeld-FT-NMR-Variante der Mosher-Methode die Aufklärung der Absolutkonfiguration von Calopin (1). Hierfür werden aus 114 die diastereomeren MTPA-Ester 145 und 146 hergestellt und die 1 H-NMR-spektroskopisch bestimmten Differenzen der chemischen Verschiebungen (∆δ -Werte) mit denen der entsprechenden Calopin-Derivate verglichen. Eine gute Übereinstimmung der ∆δ -Werte bestätigt die (2S,3R,4S)-Konfiguration der Calopine und Cyclocalopine.