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Die Gruppe der degenerativen Myopathien mit Proteinaggregaten und myofibrillären Veränderungen ist eine genetisch und klinisch heterogene Gruppe der erblichen Muskelerkrankungen. In der folgenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf zwei spezielle Erkrankungen gelegt. Dabei handelte es sich um die IBMPFD (Inclusion body myopathy, Paget‘s disease of bone and frontotemporal dementia – Einschlusskörpermyopathie mit Morbus Paget und frontotemporaler Demenz) und eine Form der Gliedergürteldystrophie (LGMD1A-Limb Girdle Muscular Dystrophy 1A). Beides sind Erkrankungen des Erwachsenenalters und eher durch eine langsame Progredienz gekennzeichnet. Ziel der Arbeit war eine klinische Charakterisierung von betroffenen Patienten mit genauer molekulargenetischer Analyse der drei Kandidatengene VCP/p97 (VCP), Myotilin (MYOT) und Vimentin (VIM). Hierzu wurde bei der Verdachtsdiagnose einer degenerativen Myopthie oder Einschlusskörpermyopathie die Patienten-DNA auf mögliche krankheitsauslösende Mutationen untersucht. Des Weiteren folgten klinische Vergleiche des Phänotyps bestimmter Mutationen und spezifischere zellbiologische Untersuchungen zum besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die genomische DNA von insgesamt 42 Patienten molekulargenetisch untersucht. Bei zwei Patienten wurde dabei die seltene Mutation R159C im VCP-Gen identifiziert, die klinisch zum Phänotyp einer IBMPFD passte, welche weiters in funktionellen Analysen im Zellkulturmodell untersucht wurde. Hierbei zeigte sich eine Störung der Myofibrillenbildung und Zelldifferenzierung. Bei der dominanten Gliedergürteldystrophie LGMD1A konnte ein krankheitsassoziierter Basenaustausch im MYOT-Gen neu identifiziert werden, der mit der Erkrankung innerhalb der betroffenen Familie segregierte, In Kontrollpopulationen ohne neuromuskuläre Erkrankungen wurde diese Genvariante nicht nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Pathogenität der Mutation durch die phylogenetische Konservierung der entsprechenden Aminosäureposition und bioinformatische Vorhersage-Algorithmen gestützt. Zur Identifizierung weiterer genetischer Ursachen hereditärer Einschlusskörpermyopathien wurde das Kandidatengen Vimentin mittels direkter Sequenzierung bei einem Patientenkollektiv von 28 Patienten mit einer Aggregatmyopathie unklarer Genese untersucht. Das Protein Vimentin ist ein Typ-3-Intermediärfilament aus der Gruppe der Desmine. Sein Vorkommen in pathologischen Proteinablagerungen bei myofibrillären Myopathien legte einen Zusammenhang mit anderen Proteinaggregatmyopathien nahe, so dass es als interessantes neues Kandidatengen erschien. Hier fand sich jedoch kein Hinweis darauf, dass Mutationen im Vimentin-Gen eine häufige Ursache für Aggregatmyopathien in dem untersuchten Patientenkollektiv sind. Für Patienten mit einer erblichen Aggregatmyopathie ist eine genaue genetische Diagnostik eine wichtige Information, da sie bei der Klassifikation der Erkrankung hilfreich ist, Aussagen über die Prognose vereinfacht und auch weiterführende, interdisziplinäre Diagnostik begründet. Zusätzlich hat eine genetische Erkrankung auch Auswirkungen auf die Familienplanung, sodass der sorgfältigen Diagnosestellung eine professionelle humangenetische Beratung folgen sollte. Derzeit beschränkt sich die Therapie der in dieser Arbeit behandelten Erkrankungen überwiegend auf supportive Maßnahmen. In Zukunft sind aber auch spezifische Gentherapien vorstellbar, die eine präzise genetische Diagnostik als Basis benötigen. Bei einer Vielzahl von bisher unheilbaren, degenerativen neuromuskulären Erkrankungen bildet eine konsequente intensive Forschung auf molekular- und zellbiologischer Ebene die Grundlage neuer translationaler Forschungsansätze für künftige kausale Therapieoptionen.

Die kongenitalen myasthenen Syndrome (CMS) stellen eine Gruppe seltener hereditärer Erkrankungen dar, die auf einer Störung im Nerv-Muskel-Signalübertragungsweg beruhen. Hinsichtlich Pathogenese, Molekulargenetik und klinischer Symptomatik zeichnen sich diese Syndrome durch eine starke Heterogenität aus, die eine Einteilung in CMS-Unterformen erforderlich macht. Die bislang bekannt gewordenen krankheitsursächlichen CMS-Gene kodieren in vielen Fällen für Synapsen-assoziierte Proteine. Um so überaschender war die kürzliche Entdeckung, dass Mutationen im Gen GFPT1, kodierend für das Schlüsselenzym des Hexosamin-Stoffwechselwegs, und zwar der Glutamin-Fruktose-6-Phosphat-Amidotransferase 1 (GFAT1), krankheitsauslösend für ein CMS mit Gliedergürtelbetonung sind. Dies ließ vermuten, dass ein neuer Pathomechanismus – nämlich Glykosylierungsstörungen – dieser CMS-Untergruppe zugrunde liegen könnte. Damit rückten weitere Gene für Enzyme des Hexosamin-Stoffwechselweges als Kandidatengene für CMS in den Fokus. Hauptschwerpunkt dieser Promotionsarbeit war deshalb, eine Kohorte von CMS-Patienten auf krankheitsrelevante Mutationen in den Hexosamin-Biosynthese-Genen GNPNAT1, PGM3, UAP1 und OGT zu untersuchen. Die Kohorte bestand aus insgesamt 44 CMS-Patienten, größtenteils solchen mit dem besonderen Phänotyp der Gliedergürtelbeteiligung (38 Patienten), zum kleineren Teil solchen mit bisher ungeklärter genetischer Ursache (6 Patienten). Jedoch konnte in keinem dieser Fälle eine mutmaßlich pathogene Sequenzveränderung in den genannten vier Kandidatengenen detektiert werden. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag darin, die vorgestellte Gliedergürtel-Kohorte auf bereits bekannte, jedoch nur äußerst selten nachgewiesene, CMS-verursachende Mutationen zu analysieren. Hierzu zählen vor allem Mutationen in MUSK, einem essentiellen Gen für eine an der neuromuskulären Synapsenbildung beteiligten Kinase. Weltweit sind hier überhaupt nur 5 Fälle/Familien in der Literatur beschrieben. Erstmals konnten im Rahmen dieser Arbeit bei einem Patienten die Sequenzvariante MUSK p.Asp38Glu und eine größere Deletion im MUSK-Gen nachgewiesen werden. Funktionelle Studien auf Ebene der MUSK-mRNA-Transkripte im Patientenmuskel, bioinformatische Daten und die Segregationsanalyse in der Familie lassen den Schluss zu, dass diese beiden Mutationen sehr wahrscheinlich als pathogen einzustufen sind. Klinisch fiel ein ausgezeichnetes Ansprechen auf Salbutamol auf, welches bei MUSK-CMS-Patienten bisher noch nicht beschrieben war. Die Analyse weiterer bekannter CMS-Gene in Patienten beider Kohorten führte zum Nachweis bereits beschriebener Frameshift-Mutationen in CHRNE, die bekanntermaßen zu einer verminderten Expression des Acetylcholinrezeptors an der Oberfläche von Muskelzellen führen. Neben den häufigen Mutationen c.1327delG in homozygoter Form und c.1353dupG in homozygoter und compound heterozygoter Form - beides Founder-Mutationen in der Population der Roma bzw. der nordafrikanischen Bevölkerung - wurde die Mutation c.70insG in compound heterozygoter Form gefunden. Interessanterweise lag bei zwei der hier beschriebenen vier CHRNE-Patienten ein Phänotyp mit prominenter Gliedergürtelschwäche vor, was für CHRNE-CMS-Patienten mit typischerweise im Vordergrund stehender okulärer Beteiligung ungewöhnlich ist. Zusammengefasst zeigen die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten Patienten mit CHRNE-Mutationen klinisch eine unerwartet große Heterogenität. Ein Patient mit distal betonter Muskelschwäche aus der Kohorte mit ungewöhnlichen Phänotypen wies die Sequenzvariante c.866C>A/p.Ser289Tyr in CHRND in heterozygoter Form auf. Diese bisher nicht funktionell untersuchte Variante stellt eine autosomal dominant vererbte Slow-Channel-Mutation dar und führt möglicherweise wie die an gleicher Position lokalisierte, jedoch schon funktionell charakterisierte Mutation p.Ser289Phe zu einer verlängerten Kanalöffnungszeit des Acetylcholinrezeptors. Im Unterschied zu anderen CHRND-Patienten war phänotypisch jedoch keine respiratorische Beteiligung erkennbar. Bei einem weiteren Patienten mit Gliedergürtelphänotyp konnten zwei Sequenzvarianten nachgewiesen werden, deren pathogenes Potential aufgrund der Ergebnisse der in silico- und Segregationsanalyse, wenn überhaupt, als sehr gering einzustufen ist. Zum einen fand sich in CHRNB1 die Sequenzveränderung p.Val113Met heterozygot. Daneben war der Patient Träger der Sequenzvariante c.1137-3del in OGT, die abschließend auf Grund der Ergebnisse der in silico- und Segregationsanalyse ebenfalls als nicht krankheitsverursachend einzuschätzen ist. Zusammenfassend konnte im untersuchten Patientenkollektiv zwar keine krankheitsursächliche Mutation der Kandidatengenene des Hexosamin-Biosynthesewegs, i.e. GNPNAT1, PGM3, UAP1 und OGT, nachgewiesen werden. Die grundsätzliche pathogene Relevanz von Genen, die eine Rolle bei Glykosylierungsvorgängen spielen, wurde jedoch zwischenzeitlich durch Identifikation von Mutationen in den Genen DPAGT1, ALG2 und ALG14 bei CMS gezeigt. Eine vergleichende Gegenüberstellung der Phänotypen der im Rahmen der Arbeit genetisch aufgeklärten CMS-Patienten bestätigte die große klinische Heterogenität innerhalb der Krankheitsgruppe und zum Teil auch unter Patienten mit identischen Genotypen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ermöglichen eine Erweiterung des Phänotyps sowohl für häufig als auch für seltener ursächliche CMS-Gene und machen deutlich, welche klinische Relevanz die Analyse von seltenen CMS-Genen wie MUSK haben kann. Im Hinblick auf Salbutamol als eine Therapieoption bei MUSK-CMS wird ein neuartiger medikamentöser Behandlungsansatz aufgezeigt. Neben einem besseren Verständnis für die genetischen Hintergünde der Erkrankung leisten die Ergebnisse somit auch einen Beitrag für eine bessere Versorgung bzgl. Diagnostik und Therapie von Patienten mit dieser seltenen neuromuskulären Erkrankung.

Hereditäre Myopathien, insbesondere Gliedergürteldystrophien, sind häufig mit einer begleitenden Kardiomyopathie assoziiert. Bei 15 der 27 bisher bekannten und molekulargenetisch analysierten Gliedergürteldystrophien konnte eine begleitende kardiale Komponente in unterschiedlicher Ausprägung gefunden werden. Dagegen wurde bislang nur unzureichend untersucht, wie häufig Patienten, die primär an einer hereditären Kardiomyopathie leiden, auch eine Skelettmuskelbeteiligung aufweisen, beispielsweise wie oft Patienten mit einer hypertrophen bzw. obstruktiven Kardiomyopathie (HCM oder HOCM) auch eine Gliedergürtelschwäche zeigen. Bei einer Familie mit einer bekannten familiären Kardiomyopathie konnte eine autosomal-dominante Mutation im MYBPC3-Gen gesichert werden. Mutationen in diesem Gen gehören zu den häufigsten genetischen Ursachen einer HCM. Einige schwerer betroffene Familienmitglieder litten zusätzlich an einer Gliedergürteldystrophie. Eine Gesamtexom-Analyse mittels Next-Generation-Sequencing lieferte Hinweise auf Varianten in möglichen weiteren Kandidatengenen, die die Schwere des Phänotyps erklären könnte. Alternativ wurde die Hypothese überprüft, ob Mutationen im MYBPC3-Gen neben ihrer bekannten Rolle als Ursache von Kardiomyopathien auch an der Entstehung von Gliedergürtelmuskelschwäche beteiligt sein könnten. Ein repräsentatives Patientenkollektiv wurde sowohl von neurologischer als auch von kardiologischer Seite ausgewählt, um eine klinische Kombination der Erkrankungen teilweise bestätigt zu finden. In einem kleinen Kollektiv von sieben Patienten mit einer hereditären hypertrophen (obstruktiven) Kardiomyopathie und verschiedenen Mutation im MYBPC3-Gen wurde bei drei Patienten eine bisher nicht diagnostizierte leichtgradige Muskelschwäche bestätigt, was die Möglichkeit einer Assoziation eines Gliedergürtelphänotyps und einer hereditären hypertrophen (obstruktiven) Kardiomyopathie mit Mutationen im MYBPC3-Gen nahelegte. Um zu überprüfen, ob MYBPC3-Genvarianten eine bisher übersehene Ursache erblicher Skelettmuskelerkrankungen sind, wurde ein Kollektiv von 59 Patienten mit dem klinischen Phänotyp einer Gliedergürteldystrophie, einem dystrophen Bild in der Muskelhistologie und positiver Familienanamnese ausgewählt, mit bislang aber negativer genetischer Testung in einer Reihe von bekannten LGMD-Genen. Eine molekulargenetische Analyse aller kodierenden Exons des MYBPC3-Gens lieferte jedoch keine pathogene Sequenzvariante. Auch bei einer anderen erblichen Myopathie, die als GNE-Myopathie oder hereditäre Einschlusskörpermyopathie bezeichnet wird, da sie durch Mutationen im GNE-Gen bedingt ist und muskelbioptisch charakteristische Einschlusskörper aufweist, ist neben der Skelettmuskelerkrankung auch eine kardiale Beteiligung beschrieben worden, die zwar selten auftritt, aber zu infausten Prognosen führen kann. Die GNE-Myopathie wird autosomal-rezessiv vererbt und präsentiert sich klinisch mit einer distal betonten und im weiteren Verlauf nach proximal fortschreitender Muskelschwäche, die eine typische Aussparung des M. quadriceps femoris zeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde das GNE-Gen bei 20 klinisch ausführlich charakterisierten Patienten molekulargenetisch analysiert, mit dem Ziel, das bisher beschriebene Spektrum an bekannten Mutationen zu erweitern. Bei zwei Patienten konnten bereits publizierte Mutationen gefunden werden, wovon eine auch mit einem kardialen Phänotyp assoziiert wird. Die zusätzlich durchgeführte Proteinexpressions- und Lokalisationsdiagnostik von GNE in der Zelle mittels Western-Blot und Immunfluoreszenzmikroskopie sollte Aufschluss über die genaue Lokalisation und Funktion von GNE erbringen, um die Pathogenesemechanismen genauer zu verstehen und dadurch zielgerichtet therapeutische Strategien entwickeln zu können. Eine Einschlusskörpermyopathie findet sich ebenfalls bei der sehr seltenen hereditären IBMPFD, bei der es sich um einen Symptomenkomplex aus Einschlusskörpermyopathie (inclusion body myopathy, IBM), frontotemporaler Demenz und M. Paget des Knochens handelt, der durch Mutationen im VCP-Gen bedingt ist. Bei der IBMPFD wurden bislang weltweit 19 verschiedene Mutationen in 38 Familien gefunden. Die Erkrankung kann sich häufig auch klinisch oligosymptomatisch manifestieren, d. h. nur mit einer Myopathie. In einem Patientenkollektiv mit passendem Phänotyp ohne Nachweis einer Mutation im VCP-Gen, wurde die Analyse eines neuen, vielversprechenden Kandidatengens etabliert. Das HDAC6-Gen kodiert für ein gleichnamiges Protein, das durch die Interaktion mit VCP beim Abbau fehlgefalteter Proteine identifiziert wurde und an der Aggresombildung beteiligt ist. Somit wurden Patienten mit einem IBM- oder IBMPFD-Phänotyp und negativer genetischer Testung im VCP-Gen einer HDAC6-Genanalyse unterzogen. Eine pathogene Sequenzvariante ließ sich dabei jedoch nicht detektieren. Künftig werden neue Technologien wie die Gesamtexom-Sequenzierung die aufwändige Kandidatengenanalyse ablösen, um bei neuromuskulären Erkrankungen Mutationen in neuen oder bekannten Genen zu identifizieren, die wesentliche Erkenntnisse zur Genotyp-Phänotyp-Korrelation liefern.

Die Dysferlinopathie ist eine Erkrankung aus dem Formenkreis der Gliedergürtel-Muskel-dystrophien. Sie wird verursacht durch autosomal-rezessiv vererbte Mutationen, die drei klinisch heterogene Phänotypen verursachen können: Die Gliedergürtel-Muskeldystrophie Typ 2B (LGMD2B), die Miyoshi Myopathie (MM) und die distale anteriotibiale Myopathie (DMAT). Betroffen sind initial dementsprechend unterschiedliche Muskelgruppen. Um ein zuverlässiges Diagnosesystem zu etablieren und einen Beitrag zur klinischen und therapeutischen Bedeutung der molekularen Diagnostik sowie zum Verständnis der Pathophysiologie der Erkrankung zu leisten, wurden 17 Patienten untersucht. Bei sechs Patienten wurden bei der molekulargenetischen Diagnostik Mutationen des Dysferlin-Gens gefunden. Diese Ergebnisse wurden mit den Befunden von klinischen und technischen Untersuchungen sowie der Proteindiagnostik von Dysferlin und den möglichen Interaktionspartnern Caveolin-3 und Calpain-3 korreliert. Bei fünf dieser sechs Patienten konnte die Diagnose einer Dysferlinopathie gestellt werden, bei zehn Patienten wurde die Erkrankung ausgeschlossen, in zwei Fällen gelang weder der sichere Ausschluss noch der Nachweis einer Dysferlinopathie. Hinsichtlich der Proteininteraktionen des Dysferlin konnte im Rahmen der durchgeführten Proteindiagnostik ein deutlicher Hinweis für eine Interaktion mit den Proteinen Caveolin-3 und Calpain-3 erbracht werden. Welchen genauen Charakter die Interaktion zwischen Dysferlin und Caveolin-3 und Calpain-3 hat, muss noch weiter erforscht werden, denn feste "regelhafte" Auswirkungen der hier gefundenen Dysferlin-Mutationen z.B. auf den Phänotyp der Erkrankung konnten in dieser Arbeit nicht festgestellt werden. In diesem Kontext muss auch die Rolle von Mutationen noch weiter aufgeklärt werden, die in den C2-Domänen zu liegen kommen. Diesbezüglich können die hier dargestellten Ergebnisse zusammen mit den Daten zukünftiger Studien zur pathogenetischen Klärung beitragen. Es konnte die diagnostische Eignung der hier beschriebenen molekulargenetischen Untersuchung bei dieser heterogenen Erkrankung gesichert und darüber hinaus ein Beitrag zum pathophysiologischen Verständnis der Erkrankung hinsichtlich der Bedeutung der C2-Domänen des Dysferlins und der Proteininteraktionen geleistet werden. Die Ergebnisse bieten, neben der Bedeutung für den einzelnen Patienten, eine Grundlage für die weitere Erforschung der Dysferlinopathie.

Thu, 12 May 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3762/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3762/1/Petersen_Jens_A.pdf Petersen, Jens A. ddc:610, d