Podcasts about azobenzol

In lebenden Organismen spielen Proteine eine wichtige Rolle bei Stoffwechselvorgängen. Für ihre Funktion ist die dreidimensionale Anordnung der Aminosäurekette von entscheidender Bedeutung. Um die frühen Faltungsprozesse von bestimmten Sekundärstrukturelementen zu analysieren, ist die Verwendung von Modellpeptiden nötig, da hier die Bildung solcher Strukturelemente getrennt beobachtet werden kann. Der Einbau eines optischen Schalters wie Azobenzol in Modellpeptide ermöglicht durch dessen lichtgetriebene cis/trans Isomerisierung eine Auslösung der Faltungsprozesse auf ultrakurzer Zeitskala (< 10 ps). Ein wesentliches Merkmal der Kombination dieses Photoschalters mit der in dieser Arbeit verwendeten Methode der UV-Anreg-Infrarot-Abtast-Spektroskopie ist die Möglichkeit, Zwischenzustände, sogenannte Intermediate, zeitlich einordnen und mittels ihrer Infrarotspektren Aussagen über ihre Struktur treffen zu können. Als Modell für das Sekundärstrukturelement des beta-Faltblatts dient eine beta-Hairpin Struktur. Diese Struktur besteht aus zwei anti-parallelen Aminosäuresträngen, welche durch Wasserstoffbrückenbindungen verbunden sind. Eine Kehre aus vier Aminosäuren schließt die Stränge auf einer Seite ab. Als photoschaltbares beta-Hairpin Modellpeptid wurde im Rahmen dieser Arbeit das AzoTrpZip2 mit der Sequenz H-Ser-Trp-Thr-Trp-Glu-AMPP-Lys-Trp-Thr-Trp-Lys-NH2 eingesetzt, wobei AMPP eine auf Azobenzol basierende pseudo-Aminosäure bezeichnet. Das Peptid AzoTrpZip2 bildet als cis-Isomer zu 45 % im Lösungsmittel Methanol-d4 eine beta-Hairpin Struktur aus. Das cis-Isomer des AMPPs ersetzt dabei zwei Aminos¨auren der Kehre. Das Ensemble an trans-Isomeren des AzoTrpZip2 hingegen besitzt eine deutlich weniger definierte Struktur. Ausgelöst durch die Isomerisierung des Schalters AMPP beginnt die Entfaltung der beta-Hairpin Struktur des AzoTrpZip2 mit einem reißverschlussartig sich fortsetzenden Bruch der schalternahen Wasserstoffbrückenbindungen und der Bildung eines desolvatisierten Zustandes mit einer Zeitkonstante von 4,1 ps. Mit 26 ps entsteht ein weiteres Intermediat, das mit einer Zeitkonstante von 630 ps in einer Klappbewegung mit den Strangmitten als Scharnier in einen Zustand übergeht, der dem Endzustand des trans- Ensemble ähnlich ist. Die Entfaltung ist nach 3 ns also weitgehend abgeschlossen. Auch bei der Faltungsreaktion erfolgt die Isomerisierung des Photoschalters auf der Pikosekundenzeitskala. Somit ist die zentrale Kehre der beta-Hairpin Struktur bereits innerhalb weniger Pikosekunden ausgebildet. Ähnlich wie bei der Entfaltung wird mit einer Zeitkonstante von 4,8 ps ein desolvatisierter Zustand erreicht, der mit einer Zeitkonstante von 64 ps in ein Faltungsintermediat übergeht. Daraus wird mit der Faltungszeitkonstante von 30 µs die beta-Hairpin Struktur gebildet. Die in der Literatur kontrovers diskutierte Frage nach dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt konnte für dieses Modellpeptid geklärt werden: Es ist die korrekte Anordnung der Wasserstoffverbrückung der Stränge und nicht die Ausbildung der Schleife.

Biologische molekulare Maschinen erfüllen in der Natur zentrale Aufgaben und erstrecken sich über alle Bereiche des Lebens. Ihren Aufbau und ihre Funktionsweise im Detail zu untersuchen und zu verstehen, ist ein großes Feld der aktuellen Forschung. Inspiriert durch die biologischen molekularen Maschinen wurde in den letzten Jahren versucht, künstliche molekulare Maschinen aufzubauen. Einer dieser Ansätze verwendet ein photoaktives Polymer, das durch das Bestrahlen mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge kontrahiert oder relaxiert werden kann. Wird dieses photoaktive Polymer an ein Kraftspektroskop gekoppelt und über Totale Interne Reflexion (TIR) angeregt, so lässt sich damit eine künstliche molekulare Maschine realisieren, die aus einem einzelnen Polymer besteht. Bestandteil dieses photoaktiven Polymers sind Azobenzoleinheiten, die reversibel zwischen der cis- und der trans-Konformation geschaltet werden können. Dadurch wird das Polymer (Azobenzolpolypeptid) kontrahiert oder relaxiert und kann Arbeit an der Cantileverspitze des Kraftspektroskops verrichten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein detailliertes Verständnis dieser künstlichen molekularen Maschine zu erlangen. Dazu wurde zuerst das Schalten der Azobenzoleinheiten im Polymer bei niedriger Kraft demonstriert. Anschließend wurde eine externe Kraft angelegt und beobachtet, dass sich das Schaltverhalten erst bei sehr hohen Kräften verändert. Das zweite Ziel war die Entwicklung eines theoretischen Modells, zur Beschreibung der Kraft-Abstandskurve des Azobenzolpolypeptid über den gesamten Kraftbereich. Dazu wurden ab-initio quantenmechanische Rechnungen für das Azobenzol durchgeführt und mit dem Modell der „Frei-Rotierenden-Kette“ kombiniert. Dieses Modell hat den Vorteil, dass es mit der Segmentlänge und der Anzahl der Monomere als Fittparameter auskommt. Es ist nun möglich die Kraft-Abstandskurven des Azobenzolpolypeptid direkt durch die Anzahl der Azobenzoleinheiten in der trans- und in der cis-Konformation über den ganzen Kraftbereich (0 bis 1000pN) zu beschreiben. Das Schaltverhalten des Polymers wird damit durch das Verhältnis der Anteile im cis- bzw. trans-Zustand ausgedrückt. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung eines Rezeptor-Ligand-Systems. Am Beispiel des anti-Digoxigenin Antikörpers gegen Digoxigenin wurden Experimente über einen großen Bereich von Kraftladungsraten durchgeführt. Dadurch zeigte sich, dass die bisherige Analysemethode nur grobe Einblicke in die Energielandschaft der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zulässt. Es konnte beispielsweise eine natürliche Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 aus den kraftspektroskopischen Experimenten bestimmt werden, die mit Messungen an Fv-Fragmenten am Ensemble gut übereinstimmen (koff=0.023s-1). Aussagen bezüglich der Energielandschaft gestalteten sich schwieriger. Zuerst wurde das Maximum der Krafthistogramme als Funktion der Maxima der Ladungsratenhistogramme in einem Diagramm dargestellt. Dieses Diagramm wurde nach der Methode von Evans ausgewertet. Daraus ergab sich für den niedrigen Ladungsratenbereich die obige Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 und eine Potentialweite von Dx=1.15nm. Für den hohen Ladungsratenbereich ergab sich eine Dissoziationsrate von koff=4.56s-1 und eine Potentialweite von Dx=0.35nm. Mit diesen Werten wurde nun versucht, die einzelnen Krafthistogramme für alle Ladungsraten zu fitten. Es hatte sich gezeigt, dass es bei niedrigen und bei hohen Ladungsraten eine Übereinstimmung zwischen dem gemessenen Krafthistogramm und der berechneten Wahrscheinlichkeitsverteilung gab. Allerdings konnte bei sehr hohen Ladungsraten und in dem Übergansbereich zwischen den beiden Bereichen keine Übereinstimmung erzielt werden. Daher sind Aussagen über die Energielandschaft nur beschränkt möglich. Um eine vollständige Auswertung der experimentellen Daten zu erreichen, werden weitere Entwicklungen bezüglich des theoretischen Modells nötig sein. Ein Ansatz besteht darin, ein mögliches Potential anzunehmen und darauf die Theorie von Kramers anwenden. Das Ergebnis wäre dann eine kraftabhängige Dissoziationskonstante koff für ein spezielles Potential. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Mehrkanal-Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR)-Spektrometer aufgebaut und charakterisiert.

Die zeitaufgel"oste Fluoreszenzspektroskopie stellt einen Zugang zur Dynamik von Molek"ulen dar. Da schnelle molekulare Vorg"ange, wie z.B. Isomerisierungen, innerhalb weniger 100 fs oder sogar darunter ablaufen k"onnen, erfordert ihre Untersuchung Techniken, die Zeitaufl"osungen in diesem Bereich erlauben. Elektronische Me"sverfahren erreichen derartige Zeitaufl"osungen jedoch nicht. Daher wird bei zeitaufgel"osten Fluoreszenzmessungen auf optische Methoden zur"uckgegriffen. In dieser Arbeit wird der Aufbau und die Weiterentwicklung eines Me"ssystems f"ur die zeitaufgel"oste Beobachtung von Fluoreszenzspektren molekularer Proben auf der Basis des Kerr-Effekts vorgestellt. Nach Anregung der Proben mit Laserimpulsen im ultravioletten oder sichtbaren Spektralbereich kann bei einer Zeitaufl"osung von ca. 100 fs gleichzeitig eine Messung "uber einen sehr breiten Spektralbereich vom nahen Ultravioletten bis ins nahe Infrarote durchgef"uhrt werden. Auf dieser Grundlage wird die Fluoreszenz einer Reihe von Proben untersucht, die nach optischer Anregung isomerisieren. Es handelt sich hierbei um die Molek"ule 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol, Bakteriorhodopsin und Proteorhodopsin. Das Push-Pull substituierte Azobenzolderivat 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol (NA) isomerisiert nach Photoanregung ebenso wie das unsubstituierte Azobenzol. Trotz stark unterschiedlicher elektronischer Struktur offenbart sich eine erstaunliche "Ahnlichkeit in der Dynamik beider Molek"ule. Beide Systeme besitzen in der Emission ein "ahnliches biphasisches Verhalten. F"ur NA wurden Zeitkonstanten von 0.08 ps und 0.8 ps und ein verz"ogerter Anstieg der Fluoreszenz im langwelligen Teil der Spektren bestimmt. Ein Unterschied zu unsubstituiertem Azobenzol besteht in den um etwa den Faktor drei k"urzeren Zeitkonstanten von NA. Der prim"are Schritt im Photozyklus von Bakteriorhodopsin (BR) besteht in der Isomerisierung des Retinalmolek"uls, welches als Chromophor dient. W"ahrend die Zeitskalen dieser Isomerisierung aus transienten Absorptionsexperimenten bereits bekannt sind, unterliegen die damit assoziierten molekularen Prozesse weiterhin einer kontroversen Diskussion. In den hier durchgef"uhrten Emissionsmessungen wurde neben den bereits bekannten Zeitkonstanten von < 0.15 ps und 0.45 ps f"ur den Fall niedriger Anregungsdichten das erste Mal ein dynamischer Stokes-Shift auf der Zeitskala von 0.2 ps entdeckt. Im Falle hoher Anregungsdichten k"onnen die deutlichen "Anderungen der zeitaufgel"osten Spektren Mehrphotonenabsorptionen zugeordnet werden. Erst vor kurzer Zeit wurde das Proteorhodopsin (PR) als neues Mitglied der Familie der rhodopsinartigen Proteine entdeckt. Ebenso wie bei BR ist der prim"are Schritt des Photozyklus die Isomerisierung seines Retinalmolek"uls. Hier wurden zum ersten Mal zeitaufgel"oste Fluoreszenzmessungen an PR durchgef"uhrt. Es wurde, wie auch bei BR, ein dynamischer Stokes-Shift gefunden. Im Gegensatz zu BR besitzt PR in der Emission jedoch drei Zeitkonstanten von < 0.15 ps, 0.45 ps und 4 ps. Die dritte Zeitkonstante kann mit einem spektral dunklen Zwischenzustand assoziiert werden.

Die Arbeit liefert neue Beiträge zu zwei wichtigen biophysikalischen Fragestellungen der Peptid-/Proteinfaltung: 1. Welchen Einfluss hat das Lösungsmittel auf die initiale Konformationsdynamik? Das Molekül Azobenzol dient dazu, gezielt in einem ringförmigen Oktapeptid getriebene Konformationsänderungen auszulösen. Azobenzol isomerisiert nach Lichtanregung innerhalb weniger Pikosekunden. Es werden neue Ergebnisse zum Isomerisierungsmechanismus präsentiert, die wichtige Hintergrundinformationen zum Verständnis der Moleküldynamik liefern. Durch die Isomerisation ändert sich die Länge des Azobenzols um fast den Faktor zwei, wodurch in den Azobenzol-Peptiden konformationelle Umorganisationen ausgelöst werden. Bereits früher durchgeführte Messungen an DMSO-löslichen Azobenzol-Peptiden zeigten, dass kinetische Prozesse, die mit Zeitkonstanten von ~10ps und ~100ps ablaufen, der Bewegung des Peptid-Teils zugeordnet werden können. Die hier präsentierten Ergebnisse an Azobenzol-Peptiden, die in Wasser löslich sind zeigen, dass Prozesse auf Zeitskalen >5 ps in Wasser um den Faktor 1.5-2 beschleunigt ablaufen. Man sieht in diesen ultraschnellen Kinetiken echte Umorganisationen des Peptid-Rückgrats, deren Geschwindigkeit durch die Viskositat des Lösungsmittels bestimmt sind 2. Wie schnell ist die Kontaktbildung in Peptiden? Fur ein Verständnis der Proteinfaltung ist wichtig zu wissen, wie lange es dauert, bis zwei (räumlich entfernte) Aminosäuren innerhalb eines Peptids einen Kontakt ausbilden. Zur Bestimmung dieser Kontaktbildungsrate werden Experimente an Xanthon-Peptiden präsentiert, die zwei Marker-Moleküle enthalten. Messungen ergeben, dass der durch einen kurzen Lichtimpuls angeregte Donor Xanthon innerhalb weniger Pikosekunden einen langlebigen Triplett-Zustand besetzt. Weiterhin wird gezeigt, dass bei direktem Kontakt zum Akzeptor Naphthalin ein Triplett-Triplett Energietransfer innerhalb