Podcasts about zelldichte

In Vibrio harveyi induzieren die drei Autoinduktoren (AIs) Z-3-Aminoundec-2-en-4-on CAI 1, N-(3-Hydroxybutyryl)-D-Homoserinlakton HAI 1 und der Furanosylboratdiester AI 2 die Quorum Sensing (QS) Regulationskaskade. So werden unter Anderem Biolumineszenz, Biofilmbildung und Exoproteaseaktivität beeinflusst. Um die Sensorik der QS Kaskade zu verstehen, wurde die Expression verschiedener QS-Zielgene im Wildtyp untersucht. Im Vergleich mit einer AI-negativen Mutante zeigte sich, dass nicht die Zelldichte sondern die Konzentration der verschiedenen AIs und deren Verhältnisse zueinander die QS-Signalkaskade steuern. Beides verändert sich in Abhängigkeit von der Medien-zusammensetzung und erlaubt so die Modulation z.B. der Biolumineszenz (Kapitel 2.1.). Die extrazelluläre AI-Konzentration im Medium hängt entscheidend von der Produktion sowie dem Transport ab. Während HAI-1 aufgrund seiner chemischen Eigenschaften frei aus der Zelle diffundiert, müssen CAI-1 und AI-2 aktiv über die Membran transportiert werden. In Escherichia coli beeinflusst die Deletion des möglichen Transporters YdgG die extrazelluläre AI-2 Konzentration. Im Rahmen dieser Arbeit konnte bioinformatisch mit YhhQ ein zusätzlicher potentieller Exporter identifiziert werden. Bindestudien an beiden Proteinen, zeigten eine mikromolare Affinität für YhhQ jedoch nicht für YdgG. Im Gegensatz dazu ist die extrazelluläre AI-2-Konzentration der ΔydgG/ΔyhhQ Doppelmutante im Vergleich zu den Einzeldeletionen um 4 µM reduziert. In vivo Parallelstudien am YhhQ Ortholog in V. harveyi allerdings, lassen redundante Transportmechanismen vermuten. In diesem Zusammenhang könnte z.B. auch eine durch Phagen vermittelte Zelllyse eine Rolle spielen (Kapitel 2.2.1.). Unabhängig von Produktion und Export kann die externe AI-Konzentration auch durch aktive Reduktion in Form von Import und intrazellulärem Abbau kontrolliert werden. In diesem Zusammenhang sagte die AG Bischofs einen AI-2-Importer vorher und dessen Vorhandensein wurde im Verlauf dieser Promotion experimentell validiert (Kapitel 2.2.2.). Eine weitere Möglichkeit des sogenannten Quorum Quenching ist der Abbau von Acylhomoserinlaktonen wie HAI-1 durch Acylasen und Laktonasen. Bioinformatische Analysen aus der AG Streit identifizierten die fünf potentiellen Laktonasen VIBHAR_02708, VIBHAR_03213, VIBHAR_06370, VIBHAR_06736 und VIBHAR_06900. Jedoch, liegt nach intensiven Untersuchungen am Wildtyp und den „Laktonase“-Mutanten der Schluss nahe, dass es in V. harveyi keinen aktiven HAI-1 Abbau gibt. Vielmehr handelt es sich bei VIBHAR_06370 um eine β-Laktamase, die eine natürliche Ampicillinresistenz vermittelt (Kapitel 2.3.). Im Gegensatz dazu, kodieren VIBHAR_02708 und VIBHAR_03213 die Typ II Glyoxalasen GloB und GloC und tragen damit zur Detoxifikation von Methylglyoxal nicht nur in V. harveyi sondern auch in E. coli bei (Kapitel 2.4.).

Die Signaltransduktionskaskade des komplexen Quorum sensing-Systems in Vibrio harveyi umfasst die drei Hybridsensorkinasen LuxN, LuxQ und CqsS, das Histidinphosphotransferprotein LuxU und den Antwortregulator LuxO. Bei niedriger Zelldichte funktionieren die Hybridsensorkinasen als Autokinasen. Die Phosphorylgruppe wird zunächst intramolekular übertragen und anschließend auf LuxU und LuxO weitergeleitet. Phosphoryliertes LuxO aktiviert die Expression von fünf regulatorischen RNAs, die im Zusammenspiel mit dem RNA-Chaperon Hfq die Translation der mRNA des Masterregulators LuxR inhibieren. Bei hoher Zelldichte wird die Kinaseaktivität der Hybridsensorkinasen durch die jeweiligen Autoinduktoren (LuxN: HAI-1, LuxQ: AI-2, CqsS: CAI-1) inhibiert, sodass es zum Abschalten der Phosphorylierungskaskade und zur Anreicherung von LuxR kommt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Proteine LuxN und LuxO biochemisch näher charakterisiert. Mit Hilfe diverser Methoden konnte die Topologie des Membranproteins LuxN, zusammen mit der Lage des N-Terminus, gelöst werden: das Protein besteht aus neun Transmembrandomänen mit einem periplasmatisch lokalisierten N-Terminus. Im Zuge der biochemischen Charakterisierung von LuxN wurden zwei an der Bindung des Autoinduktors HAI-1 beteiligte Aminosäuren identifiziert. Das Membranprotein LuxN wurde erfolgreich gereinigt und in Escherichia coli- und V. harveyi-basierten Proteoliposomen rekonstituiert. Ebenso wurde der in Form von Inclusion Bodies heterolog in E. coli überproduzierte Antwortregulator LuxO gereinigt und renaturiert. Das renaturierte Protein konnte erstmalig mit dem niedermolekularen Phosphodonor [γ-32P]-Acetylphosphat markiert werden und eine Bindung an die DNA in phosphorylierter und nicht-phosphorylierter Form im Bereich der hypothetischen σ54- und LuxO-Bindestelle gezeigt werden.

Apoptose glatter Gefäßmuskelzellen spielt eine wichtige Rolle sowohl im Rahmen der Pathogenese der Atherosklerose als auch der Restenose nach Ballonangioplastie. Zu Beginn der Arbeit war bekannt, dass glatte Gefäßmuskelzellen in Abhängigkeit von der Zelldichte auf bestimmte Substanzen wie z.B. PDTC oder Lovastatin mit Apoptose reagieren. Bei hoher Zelldichte konnte keine Apoptose induziert werden. Ziel der Arbeit war es, die apoptoseinduzierenden Substanzen PDTC und Lovastatin zu charakterisieren und verantwortliche Mechanismen der Apoptoseprotektion zu identifizieren. Dazu wurden glatte Gefäßmusklezellen in hoher Dichte kultiviert und konditioniertes Medium gewonnen. Dieses konditionierte Medium induzierte Proliferation in glatten Gefäßmuskelzellen und vermittelte einen Schutz vor Apoptose. Durch Immunpräzipitation und Western Blot konnte eindeutig gezeigt werden, dass die verminderte Apoptoseempfindlichkeit glatter Gefäßmuskelzellen in hoher Dichte durch eine autokrine Produktion von FGF-2 vermittlelt wird.

Maligne Tumorzellen besitzen die Fähigkeit, sich vom Primärtumor zu lösen und Metastasen zu bilden. Ein Verlust oder Mutationen im Kalzium-abhängigen, homophilen Zell-Adhäsionsmolekül E-Cadherin korrelieren häufig mit der Metastasierung epithelialer Tumore. Vorarbeiten haben gezeigt, dass in humanen E-Cadherin negativen MDA-MB-435S Zellen die Transfektion von bestimmten mutierten E-Cadherin Genen zu einer reduzierten Adhäsion, erhöhten Motilität und veränderten Zellmorphologie führt. Basierend auf diesen Vorarbeiten war das Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welchen Einfluß mutierte E-Cadherine und der Zellkontakt auf das Genexpressionsprofil haben. Das Genexpressionsprofil wurde mittels eines im Rahmen dieser Arbeit etablierten 1259 Sonden (~899 Gene) umfassenden cDNA Mikroarrays bestimmt. Es konnten 88 Prozent der mittels des cDNA Mikroarrays gefundenen Genexpressionsunterschiede durch die Validierung mit Northern Blot Analyse und 94 Prozent durch quantitative realtime RT PCR im Bezug auf die Richtung der Genexpressionsveränderung bestätigt werden. Mit Hilfe des cDNA Mikroarrays wurde der Einfluß von E-Cadherin auf den WNT-Signalweg untersucht. Die in dieser Arbeit durchgeführten Gen- und Proteinexpressionsuntersuchungen zeigten, dass der E-Cadherin Status die Expression der im WNT-Signalweg involvierten Gene DKK1, SFRP1, SFRP3, CTNNAL1 und FZD7 so beeinflusst, dass die beta-Catenin Menge in der Zelle stabil gehalten wird. Diese Ergebnisse wurden bereits in Laboratory Investigation (Laux et al., 2004) publiziert. Die Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen den Zell-zu-Zellkontakt verloren haben, zeigten eine differentielle Expression von Genen, die in der Angiogenese, Proliferation, Matrix Degradierung und Motilität involviert sind. Viele dieser Gene spielen in der Metastasierung als auch in der Wundheilung eine wichtige Rolle. Die Zelllinie mit WT E-Cadherin Status hat einen engen Zell-zu-Zellkontakt und zeigte eine erhöhte Expression von E-Cadherin Repressoren im Vergleich zu den E-Cadherin negativen oder mutierten Zelllinien. Bei einer hohen Zelldichte konnte ebenfalls eine erhöhte Genexpression der E-Cadherin Repressoren detektiert werden. Die Zelllinien erkennen sensitiv den Zell-zu-Zellkontakt Status und regulieren daraufhin autokrin den E-Cadherin Status über eine veränderte Expression der E-Cadherin Repressoren. Eine Regulation des E-Cadherin Status war bei den hier verwendeten Zelllinien aber aufgrund eines artfremden beta-Aktin Promotors vor den E-Cadherin Konstrukten nicht möglich. Um festzustellen, inwieweit der Zell-zu-Zellkontakt für die E-Cadherin abhängige differentielle Expressionen verantwortlich ist, wurde dessen Einfluß auf das Genexpressionsprofil mittels Zelldichteversuche untersucht. Bei einer geringen Zelldichte, bei der die Zellen wenig Kontakt zueinander haben, korrelieren die Genexpressionsver-änderungen mit denen der Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen keinen Zell-zu-Zellkontakt haben. Die vorliegende Arbeit hat zur Identifikation von Genen, welche eine wichtige Rolle in der durch mutiertes E-Cadherin vermittelten Invasion spielen (z.B. MMP1, MMP3, VEGFC, SPARC, ITGA3, CYR61, TIMP3, PRKCD, MXI1, PRLR, PLAUR und LASP1), beigetragen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass der Zellkontakt maßgeblich an der differentiellen Expression deren Gene beteiligt ist. Weiterführende Studien können nun die gefundenen Kandidatengene bezüglich Diagnose und Therapie von malignen Tumoren mit E-Cadherin Mutationen genauer charakterisieren. Die Inhibition einiger dieser Proteine stellt einen viel versprechenden Therapieansatz zur Behandlung dieser Tumoren dar.

Die minderwertige Qualität des Ersatzsknorpels führte zu den Versuchen Gelenkknorpel in vitro zu kultivieren. Ziel der Untersuchungen war es, den Einfluß mechanischer Faktoren wie den alternierenden mechanischen Druck auf Chondrozyten und humane Knochenmarkstammzellen im zeitlichen Verlauf in der Phase des Wachstums und der Organisation zu einem Implantat in einer Langzeitperfusionskultur zu evaluieren. Die Kulturen wurden über zwölf Wochen mit einem Druck von 0,5 MPa bei einer Frequenz von 0,5 Hz, 0,1 Hz, 0,01 Hz und ohne Druck belastet. Als Trägermedien verwendeten wir Spongiosazylinder und zwei resorbierbare Vliese (Etisorb-Vlies und Polylaktid-Vlies), die sich in der Abbauzeit unterschieden haben. Die Auswertung der Präparate erfolgte mit der Histologie, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie. Die beste Ergebnisse bezüglich Kollagen II : Kollagen I - Verteilung und Zellmorphologie zeigte die schnellste Frequenz (0,5 Hz). Die bessere Zelldichte wurde mit den langsameren Frequenzen (0,1 und 0,01 Hz) erreicht. In der Kontrollgruppe (ohne Belastung) wurde zwar Kollagen I, II und III gebildet, aber eher in einer ungünstigen Verteilung. Im zeitlichen Verlauf konnte bereit nach 2 Wochen Kollagen II bei kaum Kollagen I nachgewiesen werden, nach 6 Wochen war war die Zelldichte der Präparate maximal, die Kollagen II : I – Verteilung zeigte das beste Ergebnis, im REM war nahezu glatte Oberfläche zu sehen. Nach 12 Wochen war der Nachweis der kollagenen Differenzierung jetzt deutlich schlechter, es konnte verstärkt Kollagen III nachgewiesen werden. Die humane Knochenmarkstammzellen zeigten nach 12 Wochen bei der höchsten Frequenz (0,5 Hz) die ersten Anzeichen einer Matrixbildung durch Nachweis von Keratansulphat. Spongiosazylinder haben den Zellen keine Kraftübertragung erlaubt, und waren deshalb als ungeeignetes Trägersystem zu werten. Ethisorb-Vlies war für Chondrozyten gut geeignet, verlor aber nach bereits 6 Wochen seine stützende Funktion. Polylaktidvlies erwies sich als ungeeignet, da die lange Abbauzeit das Zellwachstum und Matrixproduktion verhinderte. Eine mechanische Belastung der Zellen mit einer schnellen Frequenz (0,5 Hz) trägt sicherlich zu einer Kollagen II-Produktion und erwies sich deshalb als sehr günstig.

Die Rekonstruktion des rupturierten vorderen Kreuzbandes ist eine der häufigsten Knieoperationen. Viele Operationsmethoden und verschiedenste Implantatmaterialien wurden beschrieben und dennoch gibt es in der medizinischen Fachwelt keine Einigkeit über ein Operationsverfahren. Aufgrund der komplexen Anatomie konnte bis heute noch kein gleichwertiger Kreuzbandersatz gefunden werden. Eine Methode der Rekonstruktion stellen die autologen Sehnentransplantate dar, unter denen das Patellarsehnentransplantat als Goldstandard zählt. Jedoch birgt diese Methode Nachteile wie Verlust der sensomo torischen Funktion, Nachdehnung des Transplantates und reduzierte Reißfestigkeit. Die alleinige Primärnaht wird aufgrund unbefriedigender Ergebnisse nicht mehr empfohlen. Dies führte zur Verwendung von Augmentationen, die das heilende Ligament vor mechanis cher Überlastung schützen sollen. Unter den vielen Augmentationsmaterialien haben sich resorbierbare Kordeln durchgesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neu entwickelte resorbierbare Augmentationskordel für die temporäre Verstärkung einer Kreuzbandnaht im Tiermodell Schaf untersucht. Die Untersuchung sollte Aufschluss über die klinische Anwendbarkeit dieser langsam resorbierenden Augmentation aus Polylactid geben. Das Ziel war festzustellen, ob ihre Verwendung zu einer höheren Kniegelenkstabilität und damit zu einem besseren Operationsergebnis führt als die Implantation der bisher erhältlichen, schneller resorbierenden Kordel aus Polydioxanon. Im experimentellen Teil der Studie wurden insgesamt 32 Schafe in drei Gruppen eingeteilt. Bei den Gruppen I und II wurde das VKB an seinem femoralen Ursprung durchtrennt, um einen proximalen Riß zu simulieren. Anschließend wurde es mit transkondylären Nähten reinseriert. Gruppe I erhielt die neue PLA-Kordel als Augmentation. Gruppe II erhielt die bereits in der Klinik verwendete PDS-Kordel als Augmentation und diente als Vergleichsgruppe zu Gruppe I. Bei den Tieren der Gruppe III wurde eine Totalresektion des VKB vorgenommen und ein autologes Patellarsehnentransplantat eingesetzt. Diese Gruppe diente als Kontrollgruppe zu den Gruppen I und II. Die Standzeiten betrugen sechs Monate für die Gruppen I und II und zwölf Monate für die Gruppe III. Die makroskopische Untersuchung ergab, dass die operierten Kniegelenke aller Gruppen im Vergleich zur nicht operierten Kontrollseite vermehrt Knorpelschäden höheren Grades zeigten. Beim Gruppenvergleich hatte die PDS-Gruppe mehr Knorpelschäden als die PLAGruppe, die wenigsten Schäden traten bei der PT-Gruppe auf. Zusammenfassung 73 Die Schwerpunkte der biomechanischen und histologischen Untersuchungen waren Einfluss von mechanischem Schutz auf die Heilung und Reißfestigkeit des genähten VKB, Heilungsrate und Belastbarkeit der primären Kreuzbandnaht, In-vivo-Degradation der Augmentation und funktionelle Rekonstruktion des Kniegelenkes. Schubladentest und Reißtest ergaben, dass die Sehnentransplantate die besten Ergebnisse erzielten. Die Schubladen der Kniegelenke der PLA-augmentierten Gruppe waren größer als die der PDS-augmentierten Gruppe. Die vorderen Kreuzbänder der PLA-Gruppe zeigten eine geringfügig höhere Reißfestigkeit als die der PDS-Gruppe, erreichten aber nur 44 % der Reißkraft der Sehnentransplanate und nur 17 % der Reißkraft der nicht operierten Kontrollbänder. Keine der angewandten Operationsmethoden konnte eine Kniegelenkstabilität erreichen, die der Stabilität der nicht operierten kontralateralen Kniegelenke nahe kam. Die PLA-Kordel selbst hatte in neun von elf Fällen eine Teil- oder Totalruptur erfahren. Dies wurde auf die hohe mechanische Belastung an den Bohrkanaleingängen zurückgeführt, die durch Abrieb, Reibung und Biegung entsteht. Histologisch zeigte die PLA-Augmentation eine gute Gewebeverträglichkeit, gute Knochenintegration in den Bohrkanälen und eine langsame Resorption. Die Organisationsstruktur der reinserierten Kreuzbänder war nicht mehr vorhanden. Sie zeigten eine höhere Zelldichte und mehr Blutgefäße als die nicht operierten Kontrollen. Die Studie hat gezeigt, dass eine weitere Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der PLA-Kordel notwendig ist, um ihr frühzeitiges Reißen zu vermeiden. Erst dann ist es möglich, eine Aussage über die Auswirkung einer langsam resorbierenden Augmentation auf ein genähtes Kreuzband zu machen. Momentan stellt diese Art der VKB-Reparatur keine Alternative zum Sehnentransplantat dar.