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Der humane Thyreotropin-Rezeptor (TSH-R) steuert die zentralen Funktionen der Schilddrüse und ist der wichtigste Regulator für deren Wachstum und Differenzierung. Er gehört zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und kann nach einer Stimulation mit TSH die G-Proteine aller vier Familien (Gs, Gi/o, Gq/11 und G12/13) aktivieren. Dabei werden die meisten zellulären Reaktionen wie die Proliferation der Schilddrüsenepithelzellen und die Bereitstellung der Schilddrüsenhormone einer Aktivierung von Gs zugeordnet. Zu Gs-unabhängigen Signalwegen des TSH-R war dagegen erst wenig bekannt. Da der Gq/11-vermittelte Signalweg durch die Aktivierung der Phospholipase C und Proteinkinase C in maligne Prozesse von Schilddrüsenzellen involviert sein könnte, sollten in der vorliegenden Arbeit Gq/11-abhängige Effektoren des TSH-R in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen identifiziert und näher charakterisiert werden. Als Modellsystem wurden FTC 133 wt TSH-R Zellen verwendet, eine follikuläre Schilddrüsenkarzinom-Zelllinie, die den humanen TSH-R überexprimiert. In diesen wurde die Aktivierung des Calcium/Calcineurin-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT nach TSH-Stimulation erstmalig beschrieben. Bei einer anschließenden Reihenuntersuchung der NFAT-abhängigen Zielgene Autotaxin, VEGF, c-Myc, Regulator von Calcineurin 1 (RCAN1) und Cyclooxygenase-2 (Cox-2) wurden c-Myc, RCAN1 und Cox-2 als TSH-regulierte Gene identifiziert. Die Induktion von c-Myc war unabhängig von NFAT, dagegen bestätigten Expressionsstudien mit Calcineurin-Inhibitoren und dem spezifischen NFAT-Inhibitor INCA-6, dass RCAN1 und Cox-2 durch eine NFAT-Aktivierung induziert wurden. Diese Aktivierung wurde durch Gq/11-Proteine vermittelt, denn nach spezifischer Herunterregulation der Gq- und G11-α-Untereinheiten mittels siRNA konnten die Zielgene nicht mehr TSH-abhängig induziert werden. Weitere Analysen zum Mechanismus der NFAT-Aktivierung zeigten, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i) allein über intrazelluläre Speicher nicht ausreichend war. Um NFAT zu aktivieren, mussten zusätzlich Calciumionen aus dem Extrazellulärraum einströmen. Untersuchungen mit dem STIM1-Inhibitor SKF-96365 wiesen dabei auf einen Calciumioneneinstrom über Speicher-operierte Ionenkanäle hin. Zusätzlich zur NFAT-regulierten Genexpression wurde in dieser Arbeit die TSH-induzierte Expression des Metallothioneins MT1X in FTC 133 wt TSH-R Zellen und in primären Thyreozyten analysiert. Die mRNA Induktion dieses Cystein-reichen und zytoprotektiven Proteins war ebenfalls abhängig von einer Expression der Gq/11-Proteine. Eine Erhöhung der [Ca2+]i reichte jedoch nicht aus, um MT1X signifikant zu induzieren. Zur gesteigerten Expression war darüber hinaus auch die Aktivierung der Proteinkinase C notwendig. In der vorliegenden Dissertation konnten somit RCAN1, Cox-2 und MT1X als Gq/11-regulierte Zielgene des humanen TSH-R charakterisiert werden. Dabei wurde eine NFAT-regulierte Genexpression nach einer TSH-Stimulation erstmalig gezeigt. Die präsentierten Ergebnisse weisen damit auf eine bisher unbeachtete biologische Rolle von Gq/11-abhängigen Signalwegen des humanen TSH-R in der Schilddrüse hin.

Ziel dieser Dissertation war es, die Funktionen des rekombinanten humanen Hitzeschock-Protein 70 (rhuHsp70) in der durch dendritischen Zellen (DCs) vermittelten innaten und adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Intrazellular hat das Hitzeschock-Protein 70 vielfältige Funktionen unter anderem bei der Proteinfaltung und der Verhinderung von Aggregationen. Die Rolle des extrazellulären Hsp70 im Immunsystem ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Aufgrund seiner verschiedenen beschriebenen Funktionen, die die innate Aktivierung von von immunkompetenten Zellen, wie DCs, und die effiziente Präsentierung von gebundenen Antigenen umfassen, wurde ein bedeutendes thera-peutisches Potential des rekombinanten oder aus Tumormaterial isolierten Hsp70 für die immun-basierte Tumortherapie postuliert. Allerdings gibt es zu der Rolle von Hsp70 im Immunsystem widersprüchliche Daten. Mit dem Nachweis von Kontaminationen in dem für viele Studien verwendeten rekombinanten Hsp70, die auf die E.coli Kultur zurückgeführt wurden, wurden die Funktionen von Hsp70 angezweifelt. Welches therapeutisches Potential Hsp70 tatsächlich hat, war offen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass rhuHsp70 die Kreuzpräsentation von Peptidantigenen signifikant steigerte. Durch den Vergleich von gleichen Mengen Peptid-antigen, allein oder im Komplex mit rhuHsp70, wurde zum ersten Mal die Steigerung durch rhuHsp70 quantifiziert. Dabei zeigte rhuHsp70 selbst keine Signal-Funktion auf die DCs. RhuHsp70 induzierte keinen intrazellulären Einstrom von Calciumionen, induzierte nicht die phänotypische Maturierung, aktivierte nicht Zytokinsektretion und veränderte nicht die Makropinozytoseeigenschaften der DCs. Demnach hat rhuHsp70 keine dem einem Maturierungssignal vergleichbaren Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Reinheit des verwendeten rhuHsp70 entscheidend für die korrekte Schlussfolgerung und Interpretation der experimentellen Ergebnisse ist. Schon geringe Mengen an Kontaminationen wie Endotoxine haben stimulatorische Aktivität auf DCs, die fälschlicherweise dem rhuHsp70 zugeschrieben wird. Mit dieser Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass die in den rhuHsp70 Präparationen in nanomolaren Konzentrationen enthaltenen freien Nukleotide und nicht rhuHsp70 selbst den intrazellulären Einstrom von Calciumionen in DCs induzieren. Bis dato wurden die Nukleotide nicht als Ursache für das mit Hsp70 induzierte Calciumsignal beachtet. Mit der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin gezeigt, dass die Funktion von rhuHsp70 in der Kreuzpräsentation nicht an eine innate Signalfunktion gebunden ist. Durch eine bisher nicht durchgeführte Verknüpfung von biochemischer Analyse der Substrat- rhuHsp70 Interaktionen und immunologischer Antigenpräsentation wurde als wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Kreuzpräsentation die Komplexbildung zwischen Peptid und rhuHsp70 nachgewiesen. Die gesteigerte Kreuzpräsentation korreliert direkt mit der biochemischen Komplexbildung. Dabei war die rhuHsp70 vermittelte Steigerung unabhängig von TAP, Sec61 und der Ansäuerung der endolysosomalen Kompartimente. Die Kreuzpräsentation von verschiedenen Peptiden mit unterschiedlichen Prozessierungsbedingungen wurde durch Bindung an rhuHsp70 verstärkt. Es wurde gezeigt, dass mehr Peptidantigen in den APCs vorhanden war, die mit rhuHsp70:Peptid inkubiert wurden, im Vergleich zu den APCs, die mit der gleichen Menge Peptid ohne rhuHsp70 inkubiert wurden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die verbesserte Kreuzpräsentation der Peptid-antigene durch rhuHsp70 auch zu einer Zunahme von Antigen-spezifischen T-Zellen unter Primingbedingungen führt. Dabei wurden beim Priming mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger oder gleich viel Antigen-spezifische IFN-g und Perforin sezernierenden Zellen erhalten. Bemerkenswert ist, das die Zellen aus dem Primingansatz mit den rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs eine deutlich bessere Antigenspezifität als die Zellen aus dem Primingansatz mit Peptid gepulsten DCs aufwiesen. Die Quantifizierung der Zusammensetzung der geprimten Zellpopulation ergab, dass mit rhuHsp70:Peptid gepulsten im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger CD8+ T-Zellen erhalten wurden. Konsistent wurde eine Zunahme der CD3+CD4+ T-Zellen beobachtet. Innerhalb dieser CD3+CD4+ T-Zellpopulation war der Anteil der FOXP3+ T-Zellen in den Ansätzen mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs erhöht, aber es wurde hierbei keine konsistente Zunahme der CD25++FOXP3+ Zellen beobachtet. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit ergeben sich neue interessante Fragen zu der Interaktion von rhuHsp70 mit dem Immunsystem. So ist zu klären, welche Funktionen die durch das Priming mit rhuHsp70:Peptid Komplex gepulsten DCs entstehenden CD4+ T-Zellen ausüben. Wichtig ist auch, den Grund der besseren Antigenspezifität der mit rhuHsp70:Peptid Komplex geprimten Zellen zu untersuchen.

Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise an die Bedingungen ihres Standortes gebunden. Zur Aufrechterhaltung ihrer photosynthetischen Effizienz, insbesondere unter transienten Veränderungen des Lichtregimes, haben höhere Pflanzen eine Reihe molekularer Anpassungsmechanismen entwickelt, die sowohl kurz- als auch längerfristige Adaptationen des Photosyntheseapparates ermöglichen. Für die einzigartige Dynamik der photosynthetischen Membran höherer Pflanzen spielen die reversible Phosphorylierung von Thylakoidmembranproteinen und komplexe Protein-Protein-Interaktionen unter Beteiligung multifunktioneller, regulatorischer Proteine herausragende Rollen. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Identifikation und die funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments, vor allem der Thylakoidmembran, weitere Erkenntnisse zur Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen beizutragen, die die Lichtenergie mit physiologischen Reaktionen verknüpfen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Existenz multipler, membranintegraler Proteinkinasen in den Thylakoidmembranen aus Spinatchloroplasten wurde durch den Nachweis von sechs minoren, kinaseaktiven Polypeptiden in Cytochrom b/f-Komplex-angereicherten, subthylakoidalen Fraktionen bekräftigt. Die Instabilität der in Abwesenheit des Kinasesubstrats HistonIII-S renaturierten Aktivitäten im basischen Milieu spricht für eine Autophosphorylierung der potentiellen Proteinkinasen an Serin- oder Threoninresten. 2. Die 64 kDa-Komponente AMS6 wurde mit dem monospezifischen Antikörper gegen den NTerminus seiner Aminosäuresequenz als membranintegrale Komponente gestapelter Regionen der Thylakoidmembran identifiziert. AMS6 ist weder mit der phosphorylierbaren Polyphenoloxidase noch der redoxkontrollierten LHCII-Kinase identisch, was mit Hilfe hochauflösender Gelsysteme bzw. durch Perfusionschromatographie subthylakoidaler Thylakoidmembranfraktionen gezeigt wurde. Die funktionelle Rolle von AMS6, dessen Assoziation mit dem trimeren LHCII-Komplex, nicht aber mit PSII-LHCII-Superkomplexen nachgewiesen werden konnte, ist unklar. Eine mögliche regulatorische Rolle der 64 kDa- Komponente in der Modulation des Absorptionsquerschnittes am PSII wird diskutiert. 3. Die potentielle Sensorkinase AMS9 (58 kDa) wurde mit dem heterologen Antikörper gegen das mutmaßliche cyanobakterielle Homologe slr0311 als periphere Komponente der Thylakoidmembran identifiziert. Die Interaktion mit der Stromaseite der photosynthetischen Membran erfolgte über schwache hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen. Die Akkumulation von AMS9 in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran war konsistent mit seiner Assoziation mit dem PSI. Die mögliche Funktion von AMS9 als Sensorkinase eines thylakoidalen Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystems unter Beteiligung des komplexen Polypeptids TTP30 wurde am Beispiel des rekombinanten cyanobakteriellen Homologen untersucht. Die Zerstörung des slr0311-Gens im Genom von Synechocystis sp. PCC6803 eignete sich unter den Versuchsbedingungen jedoch nicht zur Aufklärung der physiologischen Rolle von AMS9 in Spinatchloroplasten. 4. Das komplexe Polypeptid TTP30, für das in den Genomen von Spinacia oleracea L. und Arabidopsis thaliana L. mehr als ein Gen existiert, wurde durch den in organello-Import des in vitro-translatierten Vorläufers als plastidäre Komponente identifiziert. Das importierte Protein konnte über einen kurzen hydrophoben Abschnitt am C-Terminus mit der Thylakoidmembran interagieren. Die Deletion des potentiellen Membranankers führte zur Akkumulation des C-terminal verkürzten Proteins im Stroma. Die proteolytischen Erkennungssequenzen seiner größeren hydrophilen Domäne waren der Protease-Aktivität im Stroma durch die räumliche Anordung des charakteristischen, zentralen Tetratricopeptid- "repeat"-Moduls vermutlich nur bedingt zugänglich. 5. Der polyklonale Antikörper gegen den rekombinanten TTP30-Vorläufer identifizierte ein 34 kDa-Polypeptid im Stroma von Spinatchloroplasten, ein Ergebnis, das der thylakoidalen Lokalisation des in vitro importierten Proteins widersprach. Als möglicher Faktor, welcher die Spezifität des Antikörpers neben der komplexen Struktur des Vorläuferproteins beeinflussen könnte, wurde die Bindung von Calciumionen an das mutmaßliche "helix-loophelix"- Motiv in der N-terminalen Domäne von TTP30 untersucht. 6. Die DNS-Bindeaktivität des mutmaßlichen "helix-loop-helix"-Motivs von TTP30 wurde durch die "South-Western"-Analyse nachgewiesen. Der rekombinante TTP30-Vorläufer konnte Plastiden-DNS aus Spinatchloroplasten in vitro spezifisch binden. Seine säurestabile in vitro-Phosphorylierung sprach für die Regulation der potentiellen DNS-Bindeaktivität durch die posttranslationale Modifikation eines Serin- oder Threoninrestes. Eine mögliche Modulation seiner Aktivität im Sinne eines klassischen Zwei-Komponenten-Systems bestätigte sich nicht. Der Asparaginsäurerest D95 in der N-terminalen, "response regulator"- ähnlichen Domäne des rekombinanten Vorläufers übernahm in vitro keine Phosphorylgruppe von der prokaryotischen Sensorkinase EnvZ. 7. Mit dem kernkodierten Immunophilin TLP40 ist eine weitere plastidäre Komponente mit komplexer, molekularer Struktur untersucht worden. Das Protein war in seiner temporär membrangebundenen Form mit dem Cytochrom b/f-Komplex in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran assoziiert. Seine lateral heterogene Verteilung und die Diskriminierung der Komplexe in den Granastapeln wurden im Zusammenhang mit der regulatorischen Interaktion von TLP40 und einer thylakoidalen Serin-/Threoninphosphatase vom Typ 2A untersucht. 8. Die reversible Interaktion von TLP40 im Thylakoidlumen mit der Innenseite der photosynthetischen Membran aus Spinatchloroplasten wurde in einem Zwei-Phasen- Polymersystem unter Verwendung von "inside-out"-Membranvesikeln nachgewiesen. Zur Identifikation essentieller Interaktionsbereiche wurden verschiedene rekombinante Deletions- und Punktmutanten von TLP40 hergestellt, die entweder keinen funktionellen Leucin-"zipper" besaßen und/oder denen die mutmaßlichen Phosphatasebindestellen im Nterminalen Abschnitt fehlten. 9. Das Gleichgewicht zwischen "freiem" TLP40 und seiner membranassoziierten Form konnte in vitro durch submillimolare Cyclosporin A-Konzentrationen zugunsten des "freien" Anteils verschoben werden. Die reversible Interaktion von TLP40 mit der Innenseite der Thylakoidmembran beeinflußte die Dephosphorylierungsrate thylakoidaler Phosphoproteine und war ein weiterer Hinweis auf eine regulatorische Interaktion des komplexen Immunophilins im Thylakoidlumen mit einer membranintegralen Proteinphosphatase vom Typ 2A. 10. Das Modell der transmembranen Signaltransduktion, die über die katalytische Aktivität der membranintegralen Proteinphosphatase auf der Stromaseite die Stabilität, die Degradation und den Umsatz der Polypeptiduntereinheiten des PSII-Holokomplexes koordinieren soll, wurde anhand zweier molekularbiologischer Ansätze untersucht. Weder die Expression der Antisens- bzw. Sens-RNS für TLP40 in A. thaliana L. noch die Inaktivierung des Gens für das potentielle cyanobakterielle Homologe sll0408 konnten jedoch unter den gewählten Versuchsbedingungen einen detaillierteren Einblick in die physiologische Bedeutung des komplexen Immunophilins TLP40 im Thylakoidlumen von Spinatchloroplasten geben.