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Impfliebe - Das spezifisches Immunsystem ist die Spezialeinheit des Körpers. Die Recken dieser Abwehr lernen wir in dieser Folge kennen. Freut euch auf die Folge und die kleine Gesangseinlage von Favian am Anfang :) Anzeige: Hier der Link zu Meditricks: https://www.meditricks.de Rabattcode: SitusInversus15 Instagram: ⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://www.instagram.com/der_vorklinikpodcast/⁠⁠⁠⁠⁠⁠ Website: ⁠Situs Inversus (dervorklinikpodcast.de) (00:00) - Einführung und MHC-Komplexe (12:35) - Antigenpräsentierende Zellen (13:38) - T-Lymphozyten (24:04) - Antikörperklassen und Reifung (31:51) - B-Lymphozyten und AK-Klassenwechsel Für die Inhalte in diesem Podcast übernehmen wir keine Gewähr. Der Podcast kann den Besuch von Vorlesungen nicht ersetzen. Wir empfehlen das Studium von einschlägiger Fachliteratur über den Inhalt des Podcasts hinaus.

Videos zur Serie unter youtube.com/medizinmensch Lymphknoten-Schmerzen und Schwellungen sind eine Erinnerung an die wichtige Funktion dieser lymphatischen Organe bei Infektion und Entzündung. Doch wie entsteht Lymphknoten-Schwellung? Welche Rolle spielen Lymphknoten bei der Immunantwort durch Lymphozyten und andere Immunzellen wie dendritische Zellen? Bei Lymphe handelt es sich um Gewebsflüssigkeit, die nicht durch das Venen absorbiert werden kann. Das Lymphsystem dient der Drainage und vermeidet so ein Lymphödem. Das Video ist Teil der Serie "Hidden Champions" in der du über Organe lernen kannst, deren Funktion nicht allgemein bekannt ist wie Lymphknoten, Nebenniere und Milz. 0:00 Intro 0:18 Anatomie 1:00 Lymphflüssigkeit enthält Informationen, Beispiel Zahninfektion 1:50 Struktur Lymphknoten 3:10 Zusammenspiel Lymphknoten und Gewebe bei Infekt 4:24 Dendritische Zellen, Beobachter der Schlacht, CCR7 6:14 Derweil im Lymphknoten 6:49 CCL als Lockruf für CCR7 positive DC 7:20 Antigenpräsentation der DC im Lymphknoten 8:17 Auffinden der passenden Lymphzelle 10:42 Interaktion DC und T Zelle 11:30 Klonale Vermehrung aktivierte T Zelle Glossar: Antigen: Ein Ziel für eine Immunantwort, meist ein Eiweißfragment CCR7 (C-C Chemokin Rezeptor 7): Chemokinrezeptor der bei Aktivierung von dendritischen Zellen aktiv wird, und Zelle mittels CCL19 und CCL21 u.a. in den Lymphknoten transportiert Dendritische Zelle: Sternförmige Immunzelle mit ausgeprägter Fähigkeit Antigen an T Zellen zu präsentierten Granulozyt: Einfache angeborene Immunzelle und eine der ersten Verteidigungslinien gegen Infektionen. Tötet Bakterien mittels Bleiche (Wasserstoffperoxid u.ä) dem sog. oxidativem "Burst" T Zelle: Eine Art von Immunzelle, die sich bei Aktivierung mittels Klonierung vermehrt T Zell Rezeptor (TCR): Andockstelle auf T Zellen, Kann jeweils ein bestimmtes Antigen binden und ermöglicht so eine Immunreaktion Abonniere jetzt und erhalte jeden "Medizin-Mittwoch" weitere interessante Folgen zu medizinischen Themen. Folge direkt herunterladen

Thu, 17 Mar 2016 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19285/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19285/1/Prix_Niclas_Jasper.pdf Prix, Niclas Jasper

Im Mittelpunkt der Arbeit stehen die Auswirkungen des Prostanoids Prostaglandin E2 (PGE2) auf die Fähigkeit von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDC) zur Antigenpräsentation auf MHC-I- und MHC II Molekülen. Die Kreuzpräsentation von exogenem Antigen auf MHC I Molekülen ist eine entscheidende Fähigkeit der dendritischen Zellen (DC), die es ihnen ermöglicht zytotoxische T-Zellen zu aktivieren. PGE2 wird in Aktivierungsprotokollen als „Goldstandard“ in Kombination mit Zytokinen, wie TNF-α, IL-1β und IL 6, als Reifestimulus für DC in klinischen DC-basierten Tumorvakzinierungsstudien verwendet. Bisher wurde über den Effekt von PGE2 auf die Antigenpräsentation von Tumorantigen in Proteinform nicht berichtet. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von PGE2 und spezifischen EP Rezeptoragonisten auf verschiedene Funktionen von MoDC, die für die Antigenpräsentation auf MHC-I- und MHC-II-Molekülen relevant sind, untersucht. Zuerst wurde die Auswirkung von PGE2 und den EP Rezeptoragonisten auf die Ausreifung der MoDC untersucht. Hierbei wurde ersichtlich, dass MoDC nach Inkubation mit PGE2, vermittelt über EP2/4 Rezeptoren, die Aktivierungsmarker HLA A, HLA-B und HLA-C3, HLA-DR, CD83 und CD86 hochregulieren. Als nächstes wurde der Einfluss von PGE2 auf die Antigenaufnahmefähigkeit der MoDC untersucht. Hierbei wurde die Phagozytosefähigkeit anhand von Zelllysat und apoptotischen Tumorzellen und die Makropinozytosefähigkeit anhand von Dextran Partikeln analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass weder PGE2 noch spezifische EP Rezeptoragonisten die Antigenaufnahme signifikant beeinflussten. Durch Präsentation von Antigen auf MHC-II-Molekülen sind DC in der Lage, tumorspezifische CD4+ T-Zellen zu aktivieren. Die MHC-II Präsentationsfähigkeit der MoDC unter dem Einfluss von PGE2 wurde mit NY-ESO-1157-170 Peptid, NY-ESO-1 Protein sowie mit NY ESO 1-transfiziertem CHO Zelllysat als Antigenquellen untersucht. PGE2 wurde zu den MoDC entweder 24 h vor (Präinkubation) oder zur gleichen Zeit wie das Antigen (Simultaninkubation) hinzugefügt. Die Versuche ergaben, dass die MHC-II-Antigenpräsentation der MoDC durch PGE2 nicht signifikant beeinflusst wird. Die Auswirkung von PGE2 auf die Kreuzpräsentationsfähigkeit der MoDC wurde mit einer Formulierung aus NY-ESO-1 Protein und dem ISCOMATRIX® adjuvant (NY ESO-1/IMX) und einem Immunkomplex bestehend aus NY-ESO-1 Protein und dem Antikörper anti NY ESO-1 mAk (Klon ES121; NY-ESO-1/IC) untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sowohl die Kreuzpräsentation von NY-ESO-1/IMX als auch von NY ESO 1/IC durch PGE2 dosisabhängig signifikant gehemmt wurde. Dieser Effekt wird, ähnlich wie die Zell-Reifung, über die EP2/4-Rezeptoren vermittelt. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluss, dass PGE2 über einen EP2/4-Rezeptor-vermittelten Mechanismus die Kreuzpräsentationsfähigkeit der MoDC inhibiert, ohne jedoch die Antigenaufnahme oder die MHC-II Präsentation signifikant zu beeinflussen. Eine klinische Relevanz der Ergebnisse besteht bei der Verwendung von DC für therapeutische Tumorvakzinierungen zur Induktion einer gegen Malignome gerichteten Immunantwort. Die Benutzung von PGE2 als Reifestimulus für MoDC, die mit Protein-Antigenen gepulst werden, birgt das Risiko, die Induktion von tumorantigenspezifischen CD8+ T-Zellen negativ zu beeinflussen.

Infektionen mit Pigeon-Circovirus gelten als Wegbereiter für ein verlustreiches und bei jungen Brieftauben weit verbreitetes multifaktorielles Krankheitsgeschehen, der Jungtaubenkrankheit. Neben der klinisch manifesten Form einer PiCV-Infektion kommt es auch zu subklinischen Infektionen, die am lebenden Tier durch die bislang entwickelten Nachweismethoden nicht sicher zu diagnostizieren sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein indirektes Virusnachweisverfahren entwickelt und zur Untersuchung von Taubenseren eingesetzt. Da PiCV nicht mit klassisch-kulturellen Verfahren vermehrt werden kann, wurde das Antigen für die Antikörperdetektion, basierend auf dem PiCV-Kapsidprotein, rekombinant in E. coli exprimiert. Um die Expression des Virusproteins im prokaryotischen System zu erleichtern, wurde die cap-Sequenz ohne die Arginin-Codon-reichen, 5’-terminalen 117 Nukleotide kloniert. Ein 5’-terminal eingefügter 6xHistidin-Tag ermöglichte die Aufreinigung mittels Metall-Affinitäts-Chromatographie und den Nachweis des rekombinanten Kapsidproteins rCapPiCV über anti-His-Antikörper. Durch Expression des Konstrukts und anschließende denaturierende Aufreinigung konnte rCapPiCV in großer Menge und hoher Reinheit gewonnen werden. Durch vergleichende Untersuchung der Reaktivität von rCapPiCV gegen Präimmun- und Immunseren von experimentell PiCV-infizierten Tauben und einem anti-His-Antikörper im Western Blot konnte die spezifische Bindung von anti-PiCV-Antikörpern durch das rekombinante Protein gezeigt werden. Damit gelang erstmals der Nachweis von anti-PiCV-Antikörpern. Auf der Basis des rCapPiCV wurde ein indirekter ELISA entwickelt und zur Untersuchung von Taubenseren eingesetzt. Mit Hilfe des rCapPiCV-ELISAs konnte die Serokonversion experimentell PiCV-infizierter Tauben ein bis drei Wochen p. i. gezeigt werden. Die Untersuchung im Western Blot bestätigte bei allen Seren das Ergebnis der serologischen Untersuchung im ELISA und damit die Spezifität der Antigenpräparation. Der rCapPiCV-ELISA wurde daraufhin zur Untersuchung eines natürlich, subklinisch infizierten Taubenbestands eingesetzt und detektierte in 30 (81 %) von 37 getesteten Taubenseren anti-PiCV-Antikörper. Dadurch wurde gezeigt, dass das entwickelte indirekte Virusnachweisverfahren geeignet ist, PiCV-Infektionsgeschehen auf Bestandsebene nachzuweisen. Aus dem Patientengut der Klinik für Vögel wurden Seren von Tauben mit unbekannten PiCV-Infektionsstatus aus den Jahren 1989, 1991 und 1994 ausgewählt und im rCapPiCV-ELISA getestet. Von 81 Seren waren 59 (73 %) PiCV-seropositiv, was darauf schließen lässt, dass PiCV schon vor seiner Erstbeschreibung 1997 in Deutschland in Taubenpopulationen zirkulierte. Die vorgestellten serologischen Methoden können in weiterführenden Studien zu Epidemiologie, Pathogenese und Verlauf der PiCV-Infektion eingesetzt werden. Diese Daten aus der Forschung sind nötig, um die Bedeutung der PiCV-Serologie auf Bestands- und Einzeltierebene und ihren Nutzen für die klinische Diagnostik zu bewerten. Neben dem Einsatz zur Bindung virusspezifischer Antikörper, ist rCapPiCV eine potenzielle Subunit-Vakzine für die PiCV-Impfstoffentwicklung.

Dendritische Zellen (DC) übernehmen essentielle Aufgaben in der Homöostase des Immunsys-tems und in der Induktion von Toleranz oder Immunität. Eine besondere Wechselwirkung findet hierbei zwischen DC und T-Zellen statt, welche durch die Präsentation und Erkennung von Selbstpeptiden, beziehungsweise Fremdantigenen, vermittelt wird. DC spielen eine wichtige Rolle bei der Selektion eines funktionellen T-Zell-Kompartiments im Thymus. In der vorliegenden Stu-die wurde die Funktion der Antigenpräsentation von DC für die Homöostase und die Aktivierung von CD8-T-Zellen in vivo untersucht. Diese Arbeit soll zeigen, dass die Präsentation von Selbstpeptiden auf DC die homöostatische Pro-liferation (HP) von naiven CD8-T-Zellen induziert. Nach der Depletion von T-Zellen durch Be-strahlung oder Antikörpergabe kam es zu einer HP von naiven CD8-T-Zellen. Diese Proliferation war streng MHC-abhängig. Die Expression von MHC-I auf DC reichte aus, um eine komplette HP zu erlauben, welche im Teilungsmuster, der Aktivierungsmarkermodulation und den Proliferati-onsraten jener von proliferierenden Zellen in C57BL/6-Wildtypmäusen glich. Überraschenderwei-se waren CD4-T-Zellen in der Lage, die HP von transferierten naiven CD8-T-Zellen zu inhibieren. Erst durch die Depletion von endogenen CD4-T-Zellen kam es zu Teilungen, während CD25-positive regulatorische T-Zellen keinen Einfluss auf die HP von naiven CD8-T-Zellen ausübten. DC sind essentiell um Toleranz beziehungsweise Immunität nach der Erkennung von Fremdanti-genen zu generieren. Um die Bedeutung der Antigenpräsentation auf DC genauer zu charakterisie-ren, wurde die Immunantwort in einem Mausstamm, in welchem alle Zellen MHC-I tragen zu Tie-ren, in denen nur DC MHC-I exprimieren und somit naive CD8-T-Zellen aktivieren können, un-tersucht. Hierbei wurde deutlich, dass DC ausreichten um Toleranz, als auch Immunität von nai-ven CD8-T-Zellen zu induzieren. Kam es jedoch zu einer differentiellen Antigenpräsentation nach systemischer Administration des Antigens (als Peptid oder Virus in die Blutbahn), waren antigen-präsentierende nicht-DC in der Lage, die Immunantwort abzuschwächen. Dies geschah durch In-duktion von Apoptose, wodurch die Anzahl antigenspezifischer Effektor-T-Zellen verringert und somit auch die Formation des immunologischen Gedächtnisses beeinträchtigt werden konnte. Diese Ergebnisse betonen die enorme Bedeutung der Antigenpräsentation durch DC, weisen aber auch auf die besondere Rolle der Antigenpräsentation durch andere Zelltypen als DC hin, welche in der Lage sind eine Immunantwort deutlich zu modulieren.

Ziel dieser Dissertation war es, die Funktionen des rekombinanten humanen Hitzeschock-Protein 70 (rhuHsp70) in der durch dendritischen Zellen (DCs) vermittelten innaten und adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Intrazellular hat das Hitzeschock-Protein 70 vielfältige Funktionen unter anderem bei der Proteinfaltung und der Verhinderung von Aggregationen. Die Rolle des extrazellulären Hsp70 im Immunsystem ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Aufgrund seiner verschiedenen beschriebenen Funktionen, die die innate Aktivierung von von immunkompetenten Zellen, wie DCs, und die effiziente Präsentierung von gebundenen Antigenen umfassen, wurde ein bedeutendes thera-peutisches Potential des rekombinanten oder aus Tumormaterial isolierten Hsp70 für die immun-basierte Tumortherapie postuliert. Allerdings gibt es zu der Rolle von Hsp70 im Immunsystem widersprüchliche Daten. Mit dem Nachweis von Kontaminationen in dem für viele Studien verwendeten rekombinanten Hsp70, die auf die E.coli Kultur zurückgeführt wurden, wurden die Funktionen von Hsp70 angezweifelt. Welches therapeutisches Potential Hsp70 tatsächlich hat, war offen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass rhuHsp70 die Kreuzpräsentation von Peptidantigenen signifikant steigerte. Durch den Vergleich von gleichen Mengen Peptid-antigen, allein oder im Komplex mit rhuHsp70, wurde zum ersten Mal die Steigerung durch rhuHsp70 quantifiziert. Dabei zeigte rhuHsp70 selbst keine Signal-Funktion auf die DCs. RhuHsp70 induzierte keinen intrazellulären Einstrom von Calciumionen, induzierte nicht die phänotypische Maturierung, aktivierte nicht Zytokinsektretion und veränderte nicht die Makropinozytoseeigenschaften der DCs. Demnach hat rhuHsp70 keine dem einem Maturierungssignal vergleichbaren Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Reinheit des verwendeten rhuHsp70 entscheidend für die korrekte Schlussfolgerung und Interpretation der experimentellen Ergebnisse ist. Schon geringe Mengen an Kontaminationen wie Endotoxine haben stimulatorische Aktivität auf DCs, die fälschlicherweise dem rhuHsp70 zugeschrieben wird. Mit dieser Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass die in den rhuHsp70 Präparationen in nanomolaren Konzentrationen enthaltenen freien Nukleotide und nicht rhuHsp70 selbst den intrazellulären Einstrom von Calciumionen in DCs induzieren. Bis dato wurden die Nukleotide nicht als Ursache für das mit Hsp70 induzierte Calciumsignal beachtet. Mit der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin gezeigt, dass die Funktion von rhuHsp70 in der Kreuzpräsentation nicht an eine innate Signalfunktion gebunden ist. Durch eine bisher nicht durchgeführte Verknüpfung von biochemischer Analyse der Substrat- rhuHsp70 Interaktionen und immunologischer Antigenpräsentation wurde als wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Kreuzpräsentation die Komplexbildung zwischen Peptid und rhuHsp70 nachgewiesen. Die gesteigerte Kreuzpräsentation korreliert direkt mit der biochemischen Komplexbildung. Dabei war die rhuHsp70 vermittelte Steigerung unabhängig von TAP, Sec61 und der Ansäuerung der endolysosomalen Kompartimente. Die Kreuzpräsentation von verschiedenen Peptiden mit unterschiedlichen Prozessierungsbedingungen wurde durch Bindung an rhuHsp70 verstärkt. Es wurde gezeigt, dass mehr Peptidantigen in den APCs vorhanden war, die mit rhuHsp70:Peptid inkubiert wurden, im Vergleich zu den APCs, die mit der gleichen Menge Peptid ohne rhuHsp70 inkubiert wurden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die verbesserte Kreuzpräsentation der Peptid-antigene durch rhuHsp70 auch zu einer Zunahme von Antigen-spezifischen T-Zellen unter Primingbedingungen führt. Dabei wurden beim Priming mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger oder gleich viel Antigen-spezifische IFN-g und Perforin sezernierenden Zellen erhalten. Bemerkenswert ist, das die Zellen aus dem Primingansatz mit den rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs eine deutlich bessere Antigenspezifität als die Zellen aus dem Primingansatz mit Peptid gepulsten DCs aufwiesen. Die Quantifizierung der Zusammensetzung der geprimten Zellpopulation ergab, dass mit rhuHsp70:Peptid gepulsten im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger CD8+ T-Zellen erhalten wurden. Konsistent wurde eine Zunahme der CD3+CD4+ T-Zellen beobachtet. Innerhalb dieser CD3+CD4+ T-Zellpopulation war der Anteil der FOXP3+ T-Zellen in den Ansätzen mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs erhöht, aber es wurde hierbei keine konsistente Zunahme der CD25++FOXP3+ Zellen beobachtet. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit ergeben sich neue interessante Fragen zu der Interaktion von rhuHsp70 mit dem Immunsystem. So ist zu klären, welche Funktionen die durch das Priming mit rhuHsp70:Peptid Komplex gepulsten DCs entstehenden CD4+ T-Zellen ausüben. Wichtig ist auch, den Grund der besseren Antigenspezifität der mit rhuHsp70:Peptid Komplex geprimten Zellen zu untersuchen.

Notch-Signale spielen bei der Entwicklung von Lymphozyten eine wichtige Rolle. So induzieren Notch1-Signale in Lymphozyten-Vorläuferzellen im Knochenmark die Entwicklung zu T-Zellen, während Notch2-Signale essentiell für die Differenzierung reifer B-Zellen zu Marginalzonen-B-Zellen sind. Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert reife B-Zellen und regt diese zur permanenten Proliferation an. EBNA2, das erste Protein, das in EBV-infizierten B-Zellen exprimiert wird, verwendet zur Regulation von Zielgenen den gleichen Signalweg wie Notch und wird deshalb als (partielles) funktionelles Äquivalent eines aktivierten Notch-Rezeptors (NotchIC) bezeichnet. Notch und EBNA2 können sich bezüglich der Muskelzelldifferenzierung gegenseitig ersetzen, die Proliferation in B-Zellen kann dagegen nur EBNA2 induzieren. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, mit Hilfe welcher Zielgene Notch und EBNA2 unterschiedliche und gemeinsame Funktionen vermitteln. Zu diesem Zweck wurde ein Zellsystem etabliert, bei dem Tetrazyclin-regulierbares aktives Notch1IC oder Notch2IC in humane reife EBV-immortalisierte B-Zellen eingebracht wurde. In diesem System konnten Notch1IC oder Notch2IC in Abwesenheit von EBNA2 exprimiert werden, sowie EBNA2 in Abwesenheit von NotchIC. Die Expression von Zielgenen wurde anhand einer Microarray- Analyse untersucht. Damit sollten Notch1IC-, Notch2IC- und EBNA2-regulierte Zielgene identifiziert werden. Hierbei wurde vornehmlich auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen Notch1IC- und Notch2IC-regulierten Genen, sowie zwischen NotchIC- und EBNA2-regulierten Genen eingegangen. Durch Notch1IC wurden 270 Gene induziert und 374 Gene reprimiert. Notch2IC konnte 757 Gene induzieren und 959 Gene reprimieren. EBNA2 induzierte 6.250 Gene und reprimierte 6.811 Gene. Die Auswertung der Zielgene in der Clusteranalyse ergab, dass viele Gene reguliert wurden, die mit dem Zellzyklus und der Immunmodulation assoziiert sind. Aus diesem Grund sollten diese beiden Signalwege näher untersucht werden. In dem beschriebenen Zellsystem konnten weder Notch1IC noch Notch2IC die EBNA2-vermittelte Proliferation ersetzen. So konnten Notch1IC und Notch2IC zwar einige Zellzyklus-Gene induzieren, die aber assoziierten eher mit der S-Phase und mit der Mitose. Die von EBNA2 stark induzierten Gene c-Myc und LMP1, sowie die G1-Phase assoziierten D-Cycline und der Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 konnten durch NotchIC nicht oder nur schwach induziert werden. Vermutlich können Notch1IC und Notch2IC die Proliferation weder aufrechterhalten noch induzieren, da sie nicht fähig sind, G1-Phase Gene, sowie c-Myc und LMP1 ausreichend stark zu induzieren. Der Einfluss von NotchIC auf die Immunmodulation war mit der von EBNA2 vergleichbar. Die Repression vieler Gene, die mit der Immunmodulation assoziieren, weist darauf hin, dass sowohl Notch1IC, Notch2IC als auch EBNA2 die Immunantwort negativ regulieren. So könnten B-Zellrezeptor (BCR)-Signale über die Repression von Komponenten und Signalmolekülen des BCR abgeschwächt werden, die Antigenpräsentation über die Repression von MHC-Molekülen vermindert werden und der allgemeine Aktivierungszustand zusätzlich über die Repression von Komplement-, Toll-like- und Fc-Rezeptoren vermindert werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass Notch1IC, Notch2IC und EBNA2 den Klassenwechsel negativ beeinflussen. Dies wird möglicherweise über die transkriptionelle Repression der Interleukin-Rezeptoren IL4Rα1 und IL13Rα1, sowie über die Modulation von Molekülen des Signalwegs vermittelt, die die Expression von sterilen Transkripten induzieren und somit die Voraussetzung zum Klassenwechsel bilden.

Traumatisch-hämorrhagischer Schock stellt in seiner Ausprägung einen immensen Eingriff für den biologischen Organismus dar. Verminderte Gewebeperfusion führt zu verschiedenartigsten Veränderungen des geweblichen Metabolismus, der biologischen Textur und Funktion, sowohl auf systemischer, als auch auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Traumatisch-hämorrhagischer Schock führt zu schwerer Suppression der humoralen und zellulären Immunantwort, wie z.B. verminderter Zytokinsekretionsfähigkeit von Makrophagen und Lymphozyten, verminderter MHC Klasse II Expression, oder verminderter Antigenpräsentationsfähigkeit in männlichen Versuchstieren. Diese pathophysiologischen Veränderungen der Immunantwort sind mit einer erhöhten Anfälligkeit für infektiöse Komplikationen, Sepsis und letztendlich Letalität verbunden. Nach Trauma und schwerem Blutverlust zeigen sich interessanterweise Geschlechtsunterschiede in der humoralen, als auch der zellulären Immunantwort, der Anfälligkeit und Sterblichkeit für und von Sepsis, dem Auftreten von MOF (Multiple Organ Failure) und letztendlich der Mortalität. Die divergenten Effekte männlicher und weiblicher Sexualhormonen spiegeln sich darin wieder, dass das männliche Patientenkollektiv nach Trauma und schwerem Blutverlust anfälliger für bakterielle Komplikationen in Form von Infektionen, Sepsis und MOF ist und in Folge dessen eine erhöhte Mortalität besitzt. Es zeigt sich, dass männliche Sexualhormone für die beobachtete Benachteiligung des männlichen Geschlechts gegenüber dem weiblichen Geschlecht nach Trauma und Blutverlust unter diesen Umständen verantwortlich sind. So lässt sich in Tierexperimentellen Studien nachweisen, dass Kastration oder die Verabreichung eines selektiven Testosteronrezeptorblockers vor traumatisch-hämorrhagischem Schock, sowohl die unterdrückte Immunantwort/Zytokinsekretionsfähigkeit von Makrophagen, als auch von Lymphozyten, unterschiedlicher Kompartimente bei männlichen Mäusen behebt und mit einem verbesserten Überleben assoziiert ist. Dies bestätigt sich in dieser Dissertationsarbeit, da sich eine Suppression der MHC Klasse II (Ia) Expression auf Peritoneal- und Milzmakrophagen bei männlichen Mäusen nach traumatisch-hämorrhagischem Schock durch vorangegangene Kastration männlicher Mäuse beheben lässt. Nachdem die MHC Klasse II für die Initiierung und Aufrechterhaltung der zellulären und humoralen Immunantwort entscheidend verantwortlich ist, legen die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit nahe, dass die temporäre Beseitigung der Testosteronwirkungen mittels eines spezifischen Testosteronrezeptorblockers in Form von z.B. Flutamid, welches seit langem bei Patienten mit Prostatakarzinom klinisch eingesetzt wird, als mögliches Therapiekonzept zur Reduktion septischer Komplikationen und der Mortalität für die klinische Anwendung einen hilfreichen und sinnvollen Ansatz, über einen in dieser Studie beobachteten, entscheidenden Pathomechanismus, nämlich der Normalisierung der Immunantwort via wiederhergestellter MHC Klasse II Expression bei männlichen Patienten nach Trauma, Blutverlust und operativen Eingriffen, darstellen könnte. Es muss untersucht werden, ob letztendlich wirklich Testosteron für die nach traumatisch-hämorrhagischem Schock beobachtete Suppression der MHC Klasse II Expression bei männlichen Mäusen verantwortlich ist. Dazu könnten physiologische Mengen 5α-DHT an kastrierte Mäuse, oder alternativ der selektive Testosteronrezeptorblocker Flutamid an männliche Mäuse vor dem Experiment verabreicht werden. Eine zu dieser Studie weiterführende Untersuchung wäre, ob Kastration auch die Antigenpräsentation nach traumatisch-hämorrhagischem Schock in männlichen Mäusen verbessert. Ferner sollte weiterhin eruiert werden, ob wirklich Makrophagen für diese Suppression verantwortlich sind, oder eventuell andere Antigenpräsentierende Zellen, wie Dendritische Zellen, da sie ebenso die Fähigkeit zur Adhärenz an Kulturplatten besitzen und nicht durch den verwendeten Makrophagenmarker demaskiert werden können. Im Hinblick auf die Granulozyteninfiltration nach Trauma und Blutverlust bei kastrierten Mäusen im Vergleich zu männlichen Mäusen wäre die Untersuchung der generellen Mechanismen wichtig. Als potentieller Mechanismus wurde die Infiltration durch Granulozyten postuliert. Es zeigt sich jedoch sowohl bei scheinkastrierten, als auch bei kastrierten Mäusen nach Trauma und Blutverlust eine signifikant gesteigerte Infiltration. Somit hat Kastration keinen Einfluss auf die Granulozyteninfiltration. Die exakten zugrunde liegenden Mechanismen des protektiven Effekts von Kastration auf die MHC Klasse II (Ia) Expression und die Auswirkungen auf die Granulozyteninfiltration sind unbekannt.

Dendritische Zellen können in ihrer Eigenschaft als antigen-präsentierende Zellen adaptive Immunantworten induzieren. In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass DC im Menschen eine durch zytotoxische T-Zellen getragene Anti-Tumor-Immunantwort induzieren können. Im Rahmen dieser klinischen Studien ist die Frage nach der wirksamsten Tumor-Antigen-Präparation noch unbeantwortet. In der vorliegenden Arbeit wurden DC mit unterschiedlichen Antigenpräparationen der HLA-A2+ Pankreaskarzinom-Zelllinie Panc-1 gepulst und hinsichtlich ihrer Kapazität verglichen, T-Zellen zu aktivieren. Unterschiedliche Antigenpräparationen aus apoptotischem Tumormaterial wurden mit nekrotischem Tumormaterial verglichen, da für phagozytiertes apoptotisches Zellmaterial eine Kreuzpräsentation auf MHC-I-Molekülen der DC beschrieben wird. Eine solche Kreuzpräsentation könnte, so war das Ziel, zu einer gesteigerten tumorspezifischen zellulären Immunantwort führen. Apoptotisches Tumormaterial wurde durch die Behandlung der Tumorzellen mit UV-B-Licht oder Hyperthermie gewonnen und entweder als Zellsuspension oder als zellfreier Überstand (apoptotische Körperchen) zur Pulsung der DC verwandt. Als Modell für nekrotisches Tumormaterial diente durch Frier-Tau-Zyklen gewonnenes Tumorzelllysat. Monozyten-abgeleitete DC von HLA-A2+ Spendern wurden mit Tumorantigen gepulst, danach ausgereift und mit autologen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) kokultiviert. Nach drei Restimulationen im Abstand von jeweils einer Woche, wurde die T-Zell-Aktivierung mittels einer intrazellulären IFN-γ-Messung sowie Zytotoxizitätsassays bestimmt. Im Vergleich mit Lysat induzierte das Pulsen der DC mit apoptotischen Tumorzellen eine höhere Frequenz aktivierter zytotoxischer T-Zellen und T-Helferzellen sowie eine größere MHC-I-restringierte Tumorzelllyse. Es konnte dabei keine Aktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) oder γ/δ Zellen festgestellt werden. Wurden die DC mit ganzen apoptotischen Tumorzellen gepulst zeigte sich eine noch ausgeprägtere Tumorzelllyse. In diesem Fall jedoch konnte die lytische Aktivität nur zum Teil durch MHC-I-blockierende Antikörper unterbunden werden. Außerdem wurden die Kontrollzelllinien Kato-III und K562 ebenfalls lysiert. Beides sind Hinweise auf eine Beteiligung von NK-Zellen an der Tumorzelllyse. In der Tat konnten intrazelluläre IFN-γ-Färbungen neben einer Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen auch eine Aktivierung von NK- und γ/δ T-Zellen zeigen. Transwell-Kultivierungs-Experimente erbrachten daraufhin den Nachweis, dass die festgestellte NK-Zell-Aktivierung abhängig war von direktem Zell-zu-Zell Kontakt mit Tumorzellen und gleichzeitiger Anwesenheit von DC-produziertem IL-12. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Wahl der Antigenpräparation eine entscheidende Determinante in der therapeutischen Initiation einer Anti-Tumor-Immunantwort ist. Anti-Tumor-Vakzine, die aus DC und apoptotischen Tumorzellen bestehen, könnten in vivo sowohl Effektorzellen des adaptiven als auch des angeborenen Immunsystems aktivieren.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.

Fragestellung: Um mögliche proinflammatorische Zeichen bzw. Frühindikatoren (sog. Mikroinflammation) bei Patienten mit chronischem Nierenversagen und nierentransplantierten Patienten aufzuspüren, die an späteren Organkomplikationen (chronische Transplantatdysfunktion, Herz-Kreislaufmorbidität, endotheliale Dysfunktion, Infektanfälligkeiten) beteiligt sein können, untersuchten wir die Expression funktioneller monozytärer Oberflächenantigene. Als immunologischen Marker der Aktivität einer Entzündungsreaktion verglichen wir die in der Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorter (FACS))gemessene Expression sog. mCD14-Rezeptoren und der CD14+CD16++-Rezeptoren auf peripheren Blut-Monozyten mit serologischen Parametern wie C-reaktives Protein und Leukozytenzahl. Die Frage, ob die beiden Oberflächenantigene CD14 und CD16 sowie die Koexpression beider Antigene (proinflammatorisch aktivierte Monozyten) zum „immunologischen Monitoring“ geeignet sind, sollte erstmalig klinisch an Gesunden, Patienten nach Nierentransplantation sowie Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium ohne Dialysebehandlung untersucht werden. Ergänzend wurden nichtorgantransplantierte Patienten mit akuten infektiösen Komplikationen auf mögliche Modulationen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+/CD16++-Zellen) hin untersucht. CD14 existiert membrangebunden (mCD14) und in löslicher Form (sCD14) und ist verantwortlich für die Interaktion von Endotoxin (LPS) mit Monozyten und Neutrophilen. LPS ist ein Glykoprotein der äußeren Membranschicht gramnegativer Bakterien. CD14 ist der wichtigste Rezeptor für gram-negative bakterielle Lipopolysaccharide (Endotoxin), jedoch auch für Peptidoglykan und Lipoteichonsäure gram-positiver Erreger. CD 16 ist der funktionell wichtige Fcγ–Rezeptor Typ III (FcγRIII, IgG-Rezeptor Typ III), der mit niedriger Affinität monomeres IgG sowie polymeres IgG oder Immunkomplexe bindet. Er vermittelt wichtige immunphysiologische Funktionen wie antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, Beseitigung zirkulierender Immunkomplexe, Superoxidbildung und ist auch an der Signaltransduktion beteiligt. Die untersuchten CD14+CD16++-Monozyten bewirken im Zusammenwirken von TNFα, IL-1, IL-6 und IL-10 bewirkt eine stärkere Entzündungsreaktion als die konventionellen CD14++CD16negativen-Zellen; sie sind sehr potente Antigen-präsentierende Zellen, besitzen eine hohe Phagozytoseaktivität und verstärken die endotheliale Adhäsion. Untersuchungsaufbau: Wir untersuchten 69 Patienten nach Nierentransplantation (23 Frauen, 46 Männer) im Alter von durchschnittlich 52,63 +/- 11,42 Jahren (Median 53,84 Jahre). Die Patienten erhielten durchschnittlich vor 6,38 +/- 5,2 Jahren ein Nieren- Transplantat (Median 8,16 Jahre). Wir unterschieden diese Patienten hinsichtlich ihrer Immunsuppression in folgende Gruppen: 1) Mycophenolat-Mofetil-Monotherapie (MMFmono), 2) Cyclosporin-Monotherapie (CyAmono) und 3) einer Kombination aus MMF und CyA (MMF-CyAkombi). In die Gruppe mit MMF-Monotherapie wurden16 Personen eingeschlossen (3 Frauen, 13 Männer) im Alter von durchschnittlich 51,29 +/- 10,47 Jahren (Median 51,15 Jahre). In der Gruppe der CyA-monotherapierten Patienten befanden sich 11 Personen (3 Frauen, 8 Männer) im Durchschnittsalter von 58,43 +/- 8,01 Jahren (Median 59,96 Jahre). Zur Gruppe der MMF-CyA-kombinationstherapierten Patienten gehörten 18 Patienten (3 Frauen, 15 Männer) im Alter von 46,69 +/- 10,22 Jahren (Median 47,44 Jahre). Des weiteren wurden 13 Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (12 Männer, eine Frau) im Alter von 32 bis 74 Jahren (Median 65,0 Jahre; Mittelwert 63,5 Jahre +/- 10,3 Jahre) in die Analysen miteinbezogen. Parallel wurden 8 Patienten (6 Frauen, 2 Männer) im Verlauf einer akuten Infektion erfasst (Mittelwert 74,6 +/- 10,53 Jahre; Median 78 Jahre). Unser Kontrollkollektiv bestand aus 18 klinisch gesunden freiwilligen Probanden im Alter zwischen 24 und 54 Jahren (Median 31Jahre; Mittelwert 33,42 +/- 9,91 Jahre; 10 Frauen, 8 Männer). Ergebnisse: 1. Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz hatten signifikant höhere CRP-Serumkonzentrationen als Gesunde (p=0,010)(Gesunde 0,33 mg/dl vs. Urämiker 0,7 mg/dl). 2. Die mCD14-Expression auf peripheren Blutmonozyten war bei Urämikern (p=0,024) und bei nierentransplantierten Patienten (p=0,026) signifikant niedriger als bei Gesunden.(Gesunde 517 MFI vs. Urämiker 426 MFI vs. NTX 433 MFI) 3. Der prozentuale Anteil CD14+CD16++-Monozyten im Blut war sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (p=0,00000487; MFI= 13,0%) als auch bei Patienten nach Nierentransplantation (p=0,00298; MFI=9,3%) signifikant höher. 4. Die Leukozytenzahl im Blut war weder bei immunsupprimierten Nierentransplantierten noch bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium signifikant gegenüber Gesunden verändert. 5. Hinsichtlich der verschiedenen Strategien der immunsuppressiven Therapie ließen sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen der MMF-mono, der CyA-mono und der MMF-CyA-kombi-behandelten Nt-Patienten feststellen. 6. Die Absolutzahl CD14+CD16++-Monozyten war sowohl bei urämischen Patienten (p=0,003; 430/µl) als auch bei nierentransplantierten Patienten (p=0,005; 413/µl) gegenüber Gesunden signifikant erhöht. 7. Bei Nierentransplantierten fiel die CRP-Konzentration im Serum mit steigendem Alter des Transplantates logarithmisch ab (p=0,065), die mCD14-Expression fiel linear ab (p=0,063) wohingegen der prozentuale Anteil der CD14+CD16++- Monozyten invers ansteigt (p=0,0036). 8. Im Verlauf akuter infektiöser Erkrankungen war der Anteil der CD14+CD16++- Monozyten signifikant höher als bei Gesunden (p=0,000049) und fiel bis zur stationären Entlassung so signifikant ab (p=0,012), so dass kein Unterschied mehr zwischen Gesunden und Kranken mehr nachweisbar war. Schlußfolgerungen: 1. Sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz wie bei Nierentransplantierten finden sich anhand erhöhter Zahlen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+CD16++-Phänotyp) eindeutig Zeichen einer sog. „Mikroinflammation“; dies ausdrücklich auch bei NTX-Patienten, obwohl diese unter einer dauerhaften immunsuppressiven Behandlung stehen. 2. Proinflammatorische Blutmonozyten sind Ziel- und Effektorzellen der Immunabwehr. Darüber hinaus sind sie pathophysiologisch an den Vorgängen einer Atheromatose beteiligt. CD14+CD16++-Blutmonozyten entsprechen dem Phänotyp von Gewebsmakrophagen. Erhöhte Anteile CD14+CD16++-Blutmonozyten gehen möglicherweise parallel mit der erhöhten Progressionsrate der Atheromatose von Organtransplantierten und Patienten mit Niereninsuffizienz. Andererseits sind sie an der Auslösung und Perpetuation der chronischen Transplantatdysfunktion (chronisches Transplantatversagen) ursächlich beteiligt, was aus Biopsiedaten hervorgeht. Die hier erfolgten Blutzellanalysen unterstützen diese These. 3. Dauerimmunsuppression bei Nierentransplantierten vermag nicht den proinflammatorischen Status diese Patienten zu unterdrücken. Damit gilt für alle NTXPatienten, dass sich mehr oder weniger schnell trotz potenter Immunsuppression irgendwann ein Transplantatversagen einstellt. Es spricht alles dafür, dass aktivierte Blutmonozyten hier die Schlüsselrolle spielen. Wir postulieren, dass dies nur dann abgeschwächt oder vermindert werden könnte, wenn sich die zellulären Marker, die auf chronische inflammatorische Aktivität hinweisen, pharmakologisch günstig beeinflussen ließen.

Vor einigen Jahren wurde in der entzündlichen Haut neben den Langerhans-Zellen die Existenz einer weiteren Art dendritischer Zellen, der sogenannten Inflammatorischen Dendritischen Epidermalen Zellen (IDEC) herausgearbeitet. Über Herkunft, Verwandtschaft zu anderen Zellarten und Funktion der IDEC ist bislang wenig bekannt. Um die Abstammung der IDEC zu erforschen und ihre Rolle in der entzündlichen Haut neben jener der Langerhans-Zellen besser zu verstehen, sollte der Mannoserezeptor auf diesen beiden dendritischen Zellen in der Haut gesucht und die ihnen zur Verfügung stehenden Endozytose-Mechanismen ermittelt werden. In gesonderten Experimenten sollte die Phagozytosefähigkeit der Langerhans-Zellen und der IDEC geprüft werden. Als Kontrollzellen dienten Monozyten und MoDC´s, von welchen bereits Daten bekannt sind. Es wurden APAAP-Färbungen an histologischen Schnitten gesunder und entzündlicher Haut unter Verwendung des spezifischen Antikörpers D547 zur Identifizierung des Mannoserezeptors auf den Langerhans-Zellen und den IDEC vorgenommen. In der durchflußzytometrischen Immunphänotypisierung wurden die jeweiligen Zellen mit dem rezeptorspezifischen Antikörper D547 gefärbt. In durchflußzytometrischen Versuchen wurde die Pinozytose mittels Lucifer Yellow nachgewiesen. Zur Untersuchung der Rezeptor-vermittelten Endozytose wurden die Zellen mit Dextran-FITC inkubiert. Durch Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels Mannan wurde die Rezeptor-vermittelte Endozytose von der Pinozytose abgegrenzt. Die Phagozytose der Zellen wurde unter Verwendung von opsonisierten E.coli untersucht. Durch die immunhistologische Färbung und die Phänotypisierung jeweils mit dem Antikörper D547 konnte gezeigt werden, daß sich der Mannoserezeptor nicht auf den Langerhans-Zellen der normalen und der entzündlichen Haut befindet und nur auf den IDEC nachgewiesen werden kann. Er war in der Phänotypisierung der Monozyten nicht, auf den MoDC´s dagegen deutlich zur Darstellung zu bringen. Die Pinozytose konnte bei allen Zelltypen dargestellt werden. Weiterhin konnte unter Verwendung von Dextran-FITC und Hemmung des Mannoserezeptors durch Mannan gezeigt werden, daß Monozyten keine, MoDC´s dagegen eine deutliche Rezeptorvermittelte Endozytose aufweisen. Langerhans-Zellen besitzen die Fähigkeit zur Rezeptor-vermittelten Endozytose nicht, MoDC´s hingegen nehmen mannosylierte Antigene rezeptorgebunden in sich auf. Die Ergebnisse ergeben mit denjenigen der Phänotypisierung ein Konzept, welches sagt, daß Langerhans-Zellen keinen Mannoserezeptor tragen, IDEC jedoch ebenso wie die MoDC´s den Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche exprimieren und ihn zur Endozytose benutzen. Ferner konnte gezeigt werden, daß Blutmonozyten opsonisierte E.coli phagozytieren. MoDC´s nahmen keine E.coli in sich auf. Ebenso konnte gezeigt werden, daß Langerhans-Zellen aus normaler und entzündlicher Haut keine Phagozytose-Aktivität entfalten. Auch IDEC phagozytierten E.coli nicht. Langerhans-Zellen und IDEC konnten weiter voneinander abgegrenzt werden. Die Expression des Mannoserezeptors auf den IDEC und ihre Präsenz ausschließlich in entzündlichen Hautläsionen läßt vermuten, daß sie den in der Antigenpräsentation äußerst effizienten unreifen dendritischen Zellen zuzuordnen sind und ihnen eine Rolle in der Genese des atopischen Ekzems und in der Abwehr pathogener Organismen von entzündeter Haut zukommt. Die Ähnlichkeit der IDEC mit den MoDC´s nicht nur in der Rezeptor-vermittelten Endozytose legt die Abstammung dieser Zellen von Blutmonozyten und die Verwandtschaft mit MoDC´s und nicht mit den Langerhans-Zellen nahe. Die Expression des Mannoserezeptors und die Phagozytose-Fähigkeit der Zellen erwiesen sich als voneinander unabhängig. Dies erscheint wesentlich, da eine Funktion des Mannoserezeptors bei der Phagozytose bekannt ist.

Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf MHC-Klasse-II-Molekülen ist von zentraler Bedeutung für eine Reihe immunologischer Prozesse. Die diesem Präsentationsweg zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Abläufe zu leisten, die an diesem endogenen MHC-Klasse-II-Präsentationsweg beteiligt sind. Am Beispiel des zytoplasmatischen/nukleären Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase (NeoR) und eines Modellantigen-spezifischen, MHC-Klasse-II-restringierten CD4+ T-Zell Klons wurde der endogene Präsentationsweg in nicht-professionellen und professionellen antigenpräsentierenden Zellen untersucht. Eine Beteiligung von Schlüsselkomponenten des MHC-Klasse-I-Präsentationsweges konnte durch die Verwendung chemischer und biologischer Inhibitoren ebenso ausgeschlossen werden, wie eine vorzeitige Beladung von neu-synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen im endoplasmatischen Retikulum. Dagegen erwies sich die endogene Präsentation des Modellantigens abhängig von endosomaler/lysosomaler Prozessierung. Durch biochemische und zellbiologische Methoden konnte nachgewiesen werden, daß das Antigen als intaktes Protein in Endosomen/Lysosomen gelangt. Eine mögliche Sekretion des Antigens und anschließende Wiederaufnahme in endosomale Kompartimente konnte durch Zellkulturüberstand- Transferexperimente als Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Durch Inhibitor-Studien und der Beschreibung der Endosomen als Eintrittsort des Antigens in das endosomale/lysosomale System konnte gezeigt werden, daß ein Signalsequenz-vermittelter Import in Lysosomen durch Hitzeschockproteine nicht als Mechanismus in Frage kommt. Dagegen wies die Expression Autophagie-assoziierter Proteine in den verwendeten Zellinien auf eine mögliche Beteiligung dieses zytoplasmatischen Abbauvorganges an der Präsentation des Antigens hin. Eine Inhibition der Autophagie führte zu einer Stabilisierung und Anreicherung des Proteins im Zytoplasma sowie zu einer verminderten Aufnahme des Antigens in das endosomale/lysosomale Kompartiment. Die verminderte Aufnahme korrelierte mit einer starken Abnahme der MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation des Antigens. Diese Ergebnisse identifizieren Autophagie am Beispiel des Modellantigens NeoR als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentation.

Das Zytomegalievirus der Maus (MCMV) zählt zur Familie der Herpesviridae und hat verschiedene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Einer dieser Mechanismen beeinflusst die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle und wird durch das virale Genprodukt von m152 vermittelt. Dieses kodiert für ein Glykoprotein von 40 kDa Größe und wird in dieser Arbeit m152/gp40 genannt. M152/gp40 blockiert den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen zur Zelloberfläche und erkennt nur Moleküle der Maus, nicht aber des Menschen. Diese speziesspezifische Erkennung von MHC-Klasse-IMolekülen ist bisher nur für m152/gp40 bekannt und es wurden daher in der vorliegenden Arbeit Eigenschaften von MHC-Klasse-I-Molekülen untersucht, welche diese Speziesspezifität begründen. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezies des gebundenen ß2- Mikroglobulins, sowie die Anzahl der Glykosylierungen der schweren Kette keinen Einfluss auf die Erkennung von MHC-Klasse-I-Antigenen durch m152/gp40 haben. Die Eigenschaft von m152/gp40, MHC-Klasse-I-Moleküle des Menschen nicht zurückzuhalten, wurde genutzt, um mit Hilfe chimärer MHC-Klasse-I-Moleküle den Bereich, der von m152/gp40 erkannt wird, einzugrenzen. Dieser liegt hauptsächlich in der a1-Domäne, weil die a2- Domäne nur eine schwache Retention bewirkt. Zwar können MHC-Klasse-I-Moleküle, die nur den luminalen Bereich umfassen, von m152/gp40 zurückgehalten werden, doch akkumulieren diese im ER und nicht im „ER-Golgi intermediate compartment“ (ERGIC) / cis-Golgi, wie Wildtyp-H-2Kb. Es wird diskutiert, ob dies ein Hinweis auf einen aktiven Transportmechanismus von MHC-Klasse-I-Molekülen aus dem ER ins ERGIC ist. Neben der Untersuchung der Funktion von m152/gp40 aufgrund der Expression des Gens allein, wurde der Einfluss der drei viralen Genprodukte von m04, m06 und m152 auf die MHC-Klasse-I-Oberflächenexpression mit Hilfe von MCMV-Deletionsmutanten untersucht. Anhand der Analyse der Oberflächenexpression verschiedener MHC-Klasse-I-Allele nach Infektion mit Wildtyp-MCMV oder MCMV-Mutanten konnte gezeigt werden, dass in MCMV nur m06/gp48 und m152/gp40 die Oberflächenexpression von MHC-Klasse-IMolekülen reduzieren. Von den untersuchten Allelen werden H-2Kb und H-2Kk nur schwach zurückgehalten. Es wurde gezeigt, dass dies auf die Funktion von m04/gp34 zurückzuführen ist, wobei m04/gp34 generell die Funktion von m152/gp40 und kaum die Funktion von m06/gp48 behindert. Für weitere Allele konnte gezeigt werden, dass diese unterschiedlich stark von den einzelnen viralen Proteinen zurückgehalten werden. So wird H-2Dd nur von m06/gp48 und m152/gp40 gemeinsam gut zurückgehalten, wohingegen H-2Db von m152/gp40 alleine gut zurückgehalten wird. Eine mögliche Rolle der unterschiedlichen Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Allelen nach MCMV-Infektion für die Inhibition von NK-Zellen wird diskutiert.

Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G3﷓11 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.

Cytomegaloviren, die, wie alle Herpesviren, persistente Infektionen in ihren Wirten etablieren, haben Mechanismen entwickelt, um einer Elimination durch das Immunsystem zu entgehen. Alle bisher untersuchten Herpesviren interferieren mit der MHC-Klasse-I-restringierten Antigenpräsentation. Murines Cytomegalovirus verfügt neben der m152-vermittelten Retention von MHC-Klasse-I-Molekülen im ERGIC/cis-Golgi über weitere Mechanismen, den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen an die Plasmamembran zu verhindern (Thäle et al., 1995; Ziegler et al., 1997). In der vorliegenden Arbeit konnte das MCMV Glykoprotein gp48, welches durch das in der early Phase der Infektion exprimierte Gen m06 kodiert wird, als weiteres MHC-Klasse-I-reaktives Protein identifiziert werden. Zellen, die das Gen m06 stabil exprimieren, weisen eine stark verminderte Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf, und sind dadurch in ihrer Fähigkeit, Peptide gegenüber CD8+ cytotoxischen T-Zellen zu präsentieren, beschränkt. Das Typ I Transmembranprotein gp48 bindet im Endoplasmatischen Retikulum (ER) an neu-synthetisierte b2-Mikroglobulin-assoziierte MHC-Klasse-I-Moleküle, wobei eine Peptidbeladung der Komplexe nicht erforderlich ist. Die gp48/MHC-Klasse-I-Komplexe verlassen das ER und werden durch den Golgi-Apparat in ein Lamp-1+ Kompartment, höchst wahrscheinlich in die Lysosomen, transportiert und dort rasch abgebaut. Die Degradation ist sensitiv gegenüber verschiedenen endosomalen/lysosomalen Inhibitoren. Eine Hemmung führt zur Akkumulation von komplex glykosylierten MHC-Klasse-I- und gp48 Molekülen, die sich resistent gegenüber Endoglykosidase H verhalten. Gp48 Moleküle, welche nicht mit MHC-Klasse-I-Komplexen assoziiert sind, werden nicht in die Lysosomen transportiert, sondern durch das Proteasom abgebaut. Das virale Glykoprotein gp48 kann in eine MHC-Klasse-I-bindende Domäne und eine Transportdomäne unterteilt werden. Der gerichtete Transport der MHC-Klasse-I/gp48- Komplexe in die Lysosomen wird durch ein di-Leucin-Motiv im cytoplasmatischen Anteil von gp48 vermittelt. Eine Deletion des gesamten cytoplasmatischen Anteils bzw. eine Mutation des Membran-proximalen di-Leucin-Motivs führt zur Wiederherstellung der MHC-Klasse-I Oberflächenexpression, ohne die gp48/MHC-Klasse-I-Assoziation zu beeinflussen. Für die Bindung von gp48 an MHC-Klasse-I-Moleküle ist die luminale Domäne ausreichend, sofern diese in membranverankerter Form vorliegt. Die direkte Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle über die luminale Domäne von MCMV gp48 und der gerichtete Transport, vermittelt über ein di-Leucin-Motiv im cytoplasmatischen Anteil von gp48, stellt einen neuartigen viralen Immunevasionsmechanismus dar, die MHC-Klasse-Irestringierte Antigenpräsentation zu verhindern.