Podcasts about cd8 t zellen

Die Marek’sche Erkrankung (MD) ist weltweit eines der bedeutendsten Probleme in der Geflügelindustrie und verantwortlich für erhebliche wirtschaftliche Schäden. Die MD wird durch ein lymphotropes und strikt zell-assoziiertes α-Herpesvirus (MDV) verursacht, das immunsuppressiv wirkt und regelmäßig T Zelltumore induziert. B- und T-Zellen sind die primären Zielzellen des MDV in vivo. In B-Zellen kommt es zu einer lytischen Infektion und zum massiven Untergang der infizierten Zellen. Dagegen wird eine latente Infektion primär in CD4+ αβTCR+ T-Zellen beobachtet, welche nach Reaktivierung des Virus auch transformieren und Lymphome bilden können. Bis heute basieren alle Untersuchungen zur MD Pathogenese entweder auf in vivo Versuchen oder aber auf Zellkultursystemen, die mit Fibroblasten oder Nierenzellen arbeiten. Ein in vitro Infektionssystem für B- und T-Zellen, den primären Zielzellen des Virus, konnte bis heute nicht etabliert werden. Ursächlich hierfür war das Fehlen geeigneter Zellkultursysteme für diese Zellen, die ex vivo nur eine sehr kurze Überlebenszeit und einen schnellen apoptotischen Zelltod zeigen. Fortschritte in der aviären Immunologie haben zur Charakterisierung zahlreicher Zytokinen und Wachstumsfaktoren geführt, die B- und T-Zellen in vitro aktivieren, zur Proliferation anregen und erhöhte Überlebensraten induzieren. Diese Zytokine wurden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um neue Kultursysteme für Hühner-Lymphozyten zu etablieren, mit deren Hilfe in vitro MDV Infektionsmodelle für B- und T Zellen aufgebaut werden konnten. Die erfolgreiche Infektion der Zellen wurde mit Hilfe genetisch modifizierten MDV-Reporterviren (MDV RB-1B UL47GFP und RB-1B MeqGFP-UL47RFP) nachgewiesen. Die aus der Milz, dem Blut und der Bursa Fabricii isolierten B-Zellen wurden mit löslichem chCD40L stimuliert und mit MDV RB-1B UL47GFP infizierten Fibroblasten co-kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion konnten infizierte B-Zellen durch die Expression von UL47GFP durchflusszytometrisch identifiziert werden. Die Infektion wurde zusätzlich durch die zytoplasmatische Färbung der MDV-Proteine ICP4 und gB bestätigt. Der Anteil infizierter Bursa-B-Lymphozyten stieg von 2,5% am ersten Tag nach der Infektion (p.i.) bis auf ca. 15% an Tag 4 p.i. Vergleichbare Werte wurden auch für B-Zellkulturen aus der Milz und dem Blut gefunden. Die durchflusszytometrische Charakterisierung der infizierten Zellpopulation erfolgte mit Hilfe zahlreicher Hühner-spezifischer monoklonaler Antikörper. Infizierte B-Zellen sind chBu1+ und zeigen einen distinkten Phänotyp sowie eine intermediäre Zellgröße. Für die weitere Charakterisierung wurden infizierte und nicht infizierte Bursa-B-Zellen durchflusszytometrisch sortiert (> 95% Reinheit) und Mikroarray basierten Genexpressionsanalysen unterzogen. Auch T-Zellen aus der Milz, dem Blut und dem Thymus konnten nach αVβ1-TCR (TCR-2) Stimulation auf dieselbe Weise mit RB-1B MeqGFP-UL47RFP infiziert werden. Der Hauptteil der infizierten T-Zellen zeigte einen CD4+ αVβ1-TCR+ Phänotyp, allerdings fanden sich auch einige infizierte CD8+ T-Zellen. Durch die alleinige Expression von MeqGFP oder die gleichzeitige Expression von UL47RFP und MeqGFP konnten die infizierten Thymozyten in eine latent und eine zytolytisch infizierte Population unterteilt werden. Während die zytolytisch infizierte Population primär aus B-Zellen und CD8+ T-Zellen bestand, waren die latent infizierten T-Zellen zum Großteil CD4+ T Zellen. Erstmals gelang es in dieser Arbeit die Übertragung des Virus von der B-Zelle auf die T Zellen durch Co-Kultivierung mit durchflusszytometrisch sortierten infizierten B Zellen direkt nachzuweisen. Darüber hinaus konnten aus Langzeitkulturen infizierter Thymozyten vier lymphoblastoide Zelllinien (JS1 –JS4) isoliert werden. Alle vier Linien zeigten ein homogenes, lymphoblastoides Erscheinungsbild und waren CD4+, αVβ1-TCR+, MHC I+ und MHC II+. Dieser Phänotyp entspricht exakt dem von in vivo transformierten T Zelllymphomen. Das in dieser Arbeit etablierte Infektionssystem ist das erste Kultursystem, mit dem eine reproduzierbare und effiziente MDV Infektion von Lymphozyten in vitro erreicht wird. Es spiegelt die verschiedenen Phasen des natürlichen Infektionszyklus wider. Damit eröffnet sich erstmals ein Weg, die Interaktion von B-Zellen und Virus, bzw. T-Zellen und Virus detailliert und zu definierten Zeitpunkten zu analysieren. Hervorzuheben ist, dass die hier beschriebenen Methoden nicht nur verbesserte Untersuchungsmöglichkeiten bieten, sondern auch dazu beitragen können, die Zahl der bisher notwendigen Tierversuche in der MDV-Forschung deutlich zu reduzieren.

Thu, 6 Jun 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15830/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15830/1/Hetrodt_Justin.pdf Hetrodt, Justin

Thu, 21 Mar 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16943/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16943/1/Rabenstein_Hannah.pdf Rabenstein, Hannah ddc:610, ddc:600, Medizinische Fa

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Charakterisierung des Immunsystems von Patienten mit Schizophrenie zu leisten. In einer Fall-Kontroll-Studie wurden unbehandelte Patienten während der akuten Exazerbation einer Schizophrenie (n = 39) und im Verlauf (n = 25) untersucht. Als Kontrollgruppe dienten 39 freiwillige Probanden. Klinisch wurde die Psychopathologie mittels Perceived Stress und Positiv- und Negativ-Syndrom Skala erhoben. Parameter zu Charakterisierung des Immunsystems waren allgemeine zelluläre Immunantwort (Lymphozyten, Aktivierte und Naive/ Gedächtnis-T-Zellen, Monozyten), virusspezifische Immunantwort (EBV-/ CMV-spezifische T-Zellen, anti-EBNA/ -CMV IgG), Virusinfektion (EBV-/ CMV-DNA) und neuroendokrine Stressantwort (Cortisol). Der subjektive Stress korrelierte mit der Erkrankungsschwere (PSS x PANSS, r = 0.46, p = 0.02, n = 25). Eine Erhöhung der Granulozyten, Rauchen und subjektiver Stress erklärten die Variablilität in den Leukozyten besser als die Unterscheidung Patient oder Kontrolle (F(4,51) = 11.2, p = 0,00001). In der Patientengruppe waren CD4+ T-Zellen und B-Zellen proportional erhöht (48.1 (10.0) vs. 46.5 (10.9) %, p = 0.04; resp. 13.9 (5.1) vs. 11.8 (4.1) %, p = 0.01), zytotoxische Lymphozyten erniedrigt (CD8+ T-Zellen: 21 (6.0) vs. 25 (6.1) %, p = 0.005; NK-Zellen: 10.2 (4.8) vs. 12.4 (7.3) %, p = 0.04); Kein Unterschied konnte bzgl. der virusspezifischen T-Zell-Antwort und Infektionsrate von CMV und EBV zwischen den Gruppen festgestellt werden. In der Patientengruppe fand sich eine Assoziation zwischen Positivsymptomatik und CD3+CD25+ T-Zellen (F(1,25) = 5.95, p = 0.005) sowie depressiver Symptomatik mit CMV-Seropositivität (F(1,24) = 25.15, p = 0.0004). Die Ergebnisse dieser Arbeit haben im wesentlichen drei Implikationen für die Psychoneuroimmunologie der Schizophrenie: (1.) krankheits-assoziierter Stress trägt zu einem proinflammatorischen zellulären Immunstatus bei, (2.) eine weitere Charakterisierung der CD3+CD25+ T-Zellen könnte zur Aufklärung einer autoimmunen Prädisposition bei paranoider Schizophrenie beitragen, (3.) der Zusammenhang zwischen Seropositivität für CMV und depressiver Symptomatik weist auf eine depressive Untergruppe mit erhöhter Suszeptibilität und/oder Exposition hin.

Aus zahlreichen humanmedizinischen Studien ist bekannt, dass eine Anästhesie und ein chirurgischer Eingriff zur Beeinträchtigung des Immunsystems mit Komplikationen wie Wundheilungsstörungen, schweren Allgemeininfektionen oder gar zum Tod des Patienten führen können. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde untersucht, inwiefern zwei unterschiedliche Anästhesieverfahren einerseits alleine durch eine direkte Anästhetikaeinwirkung (Gruppen ohne chirurgischen Eingriff) und andererseits in Kombination mit einem chirurgischen Eingriff (Gruppen mit einer Nabelexstirpation) ausgewählte Immunzellkonzentrationen bei Kälbern beeinflussen. Verglichen wurde eine reine Inhalationsanästhesie mit Isofluran (INH) mit einer kombinierten Anästhesie mit einer Xylazin-Ketamin-Einleitung und Aufrechterhaltung mit Isofluran (KOM). Insgesamt wurden 24 Anästhesien durchgeführt, jeweils sechs in den Gruppen mit (INHc, KOMc) und ohne chirurgischen Eingriff (INHo, KOMo). Die Zuordnung zu einer Anästhesieform wurde per Losverfahren entschieden. Die Anästhesien wurden an insgesamt 20 Kälbern der Rasse Deutsches Fleckvieh durchgeführt. Es handelte sich um 16 männliche und 4 weibliche Tiere, mit einem durchschnittlichen Gewicht von 81,0 ± 19,6 kg. Im Schnitt waren die Kälber 51,9 ± 22,8 Tage alt. 24 Stunden vor der OP/Anästhesie erhielten alle Kälber Meloxicam (0,5 mg/kg KGW s.c.) und zusätzlich ab diesem Zeitpunkt für fünf Tage das Antiinfektivum Cefquinomsulfat (1 mg/kg KGW s.c.) verabreicht. Einen Tag vor der Anästhesie, am Morgen vor der Anästhesie (OP-Tag), sowie ein, drei und acht Tage postoperativ wurde den Kälbern eine Blutprobe entnommen, daraus die Gesamtleukozytenzahl (WBC), der Absolutwert und die Prozentwerte der Granulozyten bestimmt und die Leukozyten isoliert. Die Lymphozytensubpopulationen CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie die Monozyten wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern markiert und im Durchflusszytometer gemessen. Bei den Leukozytenkonzentrationen war ein Anstieg der Konzentrationen bei INHc auffällig, wohingegen es bei INHo zum Absinken der Konzentrationen kam. Diese Unterschiede waren bereits am Morgen des OP-Tages vor der Anästhesie und dann am dritten postoperativen Tag statistisch signifkant. In den beiden chirurgisch versorgten Gruppen lagen die Leukozytenkonzentrationen acht Tage postoperativ über den Ausgangswerten, wohingegen sie bei den Kontrollgruppen unterhalb der Ausgangskonzentrationen blieben, jedoch ohne statistisch signifikante Unterschiede. INHo wies auch bei den Lymphozyten geringere Konzentrationen als in den anderen drei Gruppen auf. Es kam aber bei der Untersuchung der Lymphozytenkonzentrationen zwischen den Gruppen zu keinen statistisch signifikanten Unterschieden. Der Vergleich der CD4+ T-Zellkonzentrationen lieferte sowohl beim Vergleich INHc und KOMc als auch bei Untersuchung von INHo und KOMo einen Tag postoperativ statistisch signifikante Unterschiede mit deutlich geringeren Werten bei Einsatz einer reinen Inhalationsanästhesie. Bei den beiden OP-Gruppen war dieser signifikante Unterschied auch am achten postoperativen Tag feststellbar und zeigte sich auch bei den CD8+ T-Zellkonzentrationen. Zwischen den beiden Kontrollgruppen bestand bereits am Morgen des OP-Tages vor der Anästhesie ein statistisch signifikanter Unterschied bei den CD4+ T-Zellen. Ein ähnliches Bild zeigte sich im Vergleich der beiden OP-Gruppen bei den CD8+ T-Zellen. Bei den CD8+ T-Zellen kam es auch am achten postoperativen Tag bei INHc und KOMc zu einem statistisch signifikanten Unterschied. Auch der Vergleich des Verlaufs der CD4+ T-Zellkonzentrationen über alle Probenzeitpunkte hinweg erbrachte einen signifikanten Unterschied zwischen Inhalationsanästhesie und kombinierter Anästhesie mit deutlich höheren Konzentrationen nach einer kombinierten Anästhesie. Zu berücksichtigen ist jedoch, dass die beiden Gruppen mit einer Isoflurananästhesie bereits am ersten Probentag vor jeglicher Manipulation geringere Werte aufwiesen als die Gruppen mit einer kombinierten Anästhesie. Die Monozyten zeigten Anstiege der Konzentrationen bei INHc und KOMc sowie bei KOMo. Bei INHo hingegen kam es zum stetigen Absinken der Konzentrationen. Hier ergab sich an allen postoperativen Probentagen ein signifikanter Unterschied zu KOMo und am dritten postoperativen Tag auch im Vergleich zur INHc-Gruppe. Bei den neutrophilen Granulozyten kam es ab dem OP-/Narkose-Tag in der INHc-Gruppe zum Anstieg der Konzentrationen. In den anderen drei Gruppen hingegen verhielten sie sich genau umgekehrt und sanken ab. Daraus ergaben sich innerhalb der Inhalationsgruppe am OP-Tag, sowie am ersten und dritten postoperativen Tag und beim Vergleich der chirurgisch versorgten Gruppen am dritten postoperativen Tag statistisch signifikante Unterschiede. Hinsichtlich des Einflusses der Anästhetika auf die Immunzellen (Leukozyten, Lymphozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, Monozyten) nehmen wir an, dass unsere Ergebnisse dafür sprechen, dass Isofluran alleine einen direkten hemmenden Effekt auf die Immunzellen besitzt, wohingegen es unter einem chirurgischen Eingriff zu einer Aktivierung der Immunabwehr und Aufhebung der negativen Isofluranwirkung kommt. Ketamin scheint einen, mitunter erst verspätet eintretenden, indirekt aktivierenden Effekt auf die Immunzellen zu haben, indem es zu einem Kortisolanstieg führt, der wiederum, nach anfänglicher Suppression, ca. 24 Stunden später eine Immunsystemaktivierung nach sich zieht. Lediglich auf die Neutrophilenchemotaxis wird Ketamin eine negative Wirkung zugeschrieben und erklärt möglicherweise das Absinken der Granulozytenkonzentrationen bei KOMc und KOMo. Aufgrund des Ergebnisses, dass nur wenige signifikante Unterschiede in den OP-Gruppen INHc und KOMc gefunden wurden, sowie der Tatsache, dass wir keine postoperativen Komplikationen in Form von Wundheilungsstörungen beobachteten, gehen wir davon aus, dass die beiden getesteten Anästhesieverfahren das Immunsystem von Kälbern bei einer Nabelbruchoperation nicht in klinisch relevanter Weise nachteilig beeinflussen.

Es hat sich gezeigt, dass virusspezifische CD8+ T Zellenantworten eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der HIV-Infektion spielen. Aus bislang ungeklärten Gründen geht diese anfängliche Kontrolle durch HIV-spezifische CD8+ T Zellen jedoch mit der Zeit verloren und es kommt zu einem Fortschreiten der HIV Infektion, die letztlich eine medikamentöse Therapie notwendig macht. Eine chronische Immunaktivierung ist kennzeichnend für eine fortschreitende HIV Infektion. Daher wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit zunächst die Expression von immunstimulierenden Signalen, anhand von CD38, und von inhibitorischen Signalen, anhand von PD-1, auf HIV-spezifischen CD8+ T Zellen von Patienten mit einer unbehandelten, chronischen HIV-Infektion untersucht. Es zeigte sich, dass CD38 und PD-1 auf HIV-spezifischen CD8+ T Zellen ko-exprimiert wurden und mit den klinisch wichtigen Parametern Viruslast und CD4+ T Helferzellzahl korrelierten. Die Ko Expression von CD38/PD-1 auf CD8+ T Zellen von Progressoren mit fortschreitender HIV-Infektion war hoch signifikant höher als bei Controllern, deren CD8+ T Zellen die HI-Virämie noch kontrollieren konnten (p

CD8+ T-Zellen spielen in der Bekämpfung von EBV eine essentielle Rolle. Zur Kontrolle dieser infizierten B-Zellen besitzt der EBV-Träger ein Repertoire an EBV-spezifischen CD8+ T-Zellen, dessen Zusammensetzung sich oft vorhersagen läßt. Neben den CD8+ T-Zellen gegen latente Proteine von EBV spielen dabei CD8+ T-Zellen gegen lytische Proteine und darunter die immundominanten IE-antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen eine wichtige Rolle. Der Grund für diese Dominanz ist bisher nicht geklärt worden, obwohl es bereits Hypothesen dazu gibt. EBV etabliert über die ersten Tage hinweg die latente Infektion in der B-Zelle und so prozessiert die frühinfizierte B-Zelle latente Antigene, die durch die entsprechenden CD8+ T-Zellen erkannt werden. Erst kürzlich wurde bekannt, dass auch die IE-Proteine des lytischen Zyklus von EBV von der frühinfizierten B-Zelle transient exprimiert werden. Ich konnte zeigen, dass die IE-Proteine in dieser frühen Phase der Infektion von der B-Zelle präsentiert und durch IE-antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen erkannt werden. Ein später im lytischen Zyklus erwartetes E-Protein wurde jedoch nicht präsentiert. Dies bestätigt die Annahme eines abortiv-lytischen Zyklus in der frühinfizierten B-Zelle. In dieser Arbeit wurde auch gezeigt, dass die Erkennung der IE-Proteine im Mittel zeitlich vor der Erkennung der latenten Proteine von EBV in der Frühphase der Infektion lag. Da dies mit einer gegenüber den Latenzantigenspezifischen T-Zellen gesteigerten Proliferation der IE-antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen einherging, stellt eine frühere Antigenerkennung durch die IE-antigen-spezifischen T-Zellen einen plausiblen Grund für die Immundominanz dieser T-Zellen dar.

Die Reaktivierung von Herpesviren, wie EBV, CMV und HHV-6, kann bei Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation zu schwerwiegenden Erkrankungen und sogar zum Tod führen. Zur Behandlung von EBV- oder CMV-assoziierten Komplikationen hat sich in der Vergangenheit der adoptive Transfer von virusspezifischen T-Zellen, die aus dem T-Zellgedächtnis des Stammzellspenders isoliert wurden, als wirksam und gut verträglich erwiesen. Patienten mit einem CMV-negativen Transplantatspender haben ein erhöhtes Risiko für CMV-assoziierte Erkrankungen, und gerade in diesem Fall fehlt eine adoptive Therapie, weil CMV-spezifische T-Zellen von einem solchen Spender nicht verfügbar sind. Um dieses Problem zu lösen, habe ich in meiner Arbeit die Herstellung von CMV-spezifischen T-Zellen mittels retroviralem Transfer des spezifischen T-Zellrezeptors untersucht. Zuerst habe ich CD4+ und CD8+ T-Zellklone mit verschiedenen HLA-Restriktionen, die die endogen prozessierten und präsentierten CMV-Antigene pp65 und IE-1 erkennen, aus dem T-Zellgedächtnis von CMV-positiven Spendern generiert und charakterisiert. Für den retroviralen Transfer wurden vier pp65-spezifische T Zellrezeptoren unterschiedlicher HLA-Restriktionen ausgewählt. Die Gene der TCRs wurden kloniert und auf primäre T-Zellen CMV-negativer Spender übertragen. CMV-TCR-transgene T Zellen zeigten ein breites Spektrum an wichtigen Effektorfunktionen wie die Freisetzung von IFN-γ und IL 2 sowie Zytotoxizität und Proliferation gegenüber endogen prozessiertem pp65, und die Zellen konnten durch strikt antigenspezifische Stimulation angereichert und expandiert werden. Die Expansion der TCR-transgenen Zellen war von einem Anstieg der spezifischen Effektorfunktionen begleitet, was zeigt, dass die übertragene Spezifität stabil und voll funktionsfähig war. Deshalb erwarte ich, dass diese CMV-TCR-transgenen T-Zellen sich für die effektive Kontrolle einer akuten CMV-Infektion eignen und darüber hinaus für ein antivirales Gedächtnis sorgen werden. Auch die Reaktivierung von HHV-6 führt in immunsupprimierten Patienten zu ernsthaften Erkrankungen. Leider ist es allerdings bisher nicht möglich, HHV-6-spezifische T Zellen für den adoptiven Transfer herzustellen, weil die Antigene und Epitope der HHV-6-spezifischen Immunantwort nicht bekannt sind. Durch die Stimulation mit Peptiden aus den HHV-6-Tegumentproteinen U11 und U54, die aufgrund von konservierten HLA-Bindungsmotiven als CD8-T-Zellepitope vorhergesagt wurden, ist es mir gelungen, HHV-6-spezifische CD8+ T-Zellen von gesunden Virusträgern in vitro anzureichern. Ich konnte T-Zellklone spezifisch für mehrere HLA-A*0201-restringierte Epitope herstellen: die U11-Peptide GIL, MLW und SLM sowie die U54-Peptide ILY und LLC. Ich zeigte, dass ILY und LLC bei der intrazellulären Antigenprozessierung entstehen. ILY-spezifische T-Zellen erkannten virusinfizierte Zellen in vitro. Damit habe ich die ersten CD8-T Zellepitope von HHV-6 charakterisiert und gezeigt, dass sich auch die HHV-6-spezifische T Zellantwort, ähnlich wie die CMV-spezifische, gegen virale Tegumentproteine richtet. Durch Multimerfärbung von peripheren Blutzellen konnte ich zeigen, dass diese HHV-6-spezifischen T Zellen im T-Zellgedächtnis gesunder Virusträger im Vergleich zu anderen herpesvirusspezifischen T-Zellen selten sind. Diese Erkenntnisse liefern eine Grundlage für weitere Untersuchungen des HHV-6-spezifischen T-Zellrepertoires und helfen, Strategien für die Herstellung von HHV-6-spezifischen T-Zellen für die Immuntherapie zu entwickeln.

Im Mittelpunkt der Arbeit stehen die Auswirkungen des Prostanoids Prostaglandin E2 (PGE2) auf die Fähigkeit von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDC) zur Antigenpräsentation auf MHC-I- und MHC II Molekülen. Die Kreuzpräsentation von exogenem Antigen auf MHC I Molekülen ist eine entscheidende Fähigkeit der dendritischen Zellen (DC), die es ihnen ermöglicht zytotoxische T-Zellen zu aktivieren. PGE2 wird in Aktivierungsprotokollen als „Goldstandard“ in Kombination mit Zytokinen, wie TNF-α, IL-1β und IL 6, als Reifestimulus für DC in klinischen DC-basierten Tumorvakzinierungsstudien verwendet. Bisher wurde über den Effekt von PGE2 auf die Antigenpräsentation von Tumorantigen in Proteinform nicht berichtet. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von PGE2 und spezifischen EP Rezeptoragonisten auf verschiedene Funktionen von MoDC, die für die Antigenpräsentation auf MHC-I- und MHC-II-Molekülen relevant sind, untersucht. Zuerst wurde die Auswirkung von PGE2 und den EP Rezeptoragonisten auf die Ausreifung der MoDC untersucht. Hierbei wurde ersichtlich, dass MoDC nach Inkubation mit PGE2, vermittelt über EP2/4 Rezeptoren, die Aktivierungsmarker HLA A, HLA-B und HLA-C3, HLA-DR, CD83 und CD86 hochregulieren. Als nächstes wurde der Einfluss von PGE2 auf die Antigenaufnahmefähigkeit der MoDC untersucht. Hierbei wurde die Phagozytosefähigkeit anhand von Zelllysat und apoptotischen Tumorzellen und die Makropinozytosefähigkeit anhand von Dextran Partikeln analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass weder PGE2 noch spezifische EP Rezeptoragonisten die Antigenaufnahme signifikant beeinflussten. Durch Präsentation von Antigen auf MHC-II-Molekülen sind DC in der Lage, tumorspezifische CD4+ T-Zellen zu aktivieren. Die MHC-II Präsentationsfähigkeit der MoDC unter dem Einfluss von PGE2 wurde mit NY-ESO-1157-170 Peptid, NY-ESO-1 Protein sowie mit NY ESO 1-transfiziertem CHO Zelllysat als Antigenquellen untersucht. PGE2 wurde zu den MoDC entweder 24 h vor (Präinkubation) oder zur gleichen Zeit wie das Antigen (Simultaninkubation) hinzugefügt. Die Versuche ergaben, dass die MHC-II-Antigenpräsentation der MoDC durch PGE2 nicht signifikant beeinflusst wird. Die Auswirkung von PGE2 auf die Kreuzpräsentationsfähigkeit der MoDC wurde mit einer Formulierung aus NY-ESO-1 Protein und dem ISCOMATRIX® adjuvant (NY ESO-1/IMX) und einem Immunkomplex bestehend aus NY-ESO-1 Protein und dem Antikörper anti NY ESO-1 mAk (Klon ES121; NY-ESO-1/IC) untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sowohl die Kreuzpräsentation von NY-ESO-1/IMX als auch von NY ESO 1/IC durch PGE2 dosisabhängig signifikant gehemmt wurde. Dieser Effekt wird, ähnlich wie die Zell-Reifung, über die EP2/4-Rezeptoren vermittelt. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluss, dass PGE2 über einen EP2/4-Rezeptor-vermittelten Mechanismus die Kreuzpräsentationsfähigkeit der MoDC inhibiert, ohne jedoch die Antigenaufnahme oder die MHC-II Präsentation signifikant zu beeinflussen. Eine klinische Relevanz der Ergebnisse besteht bei der Verwendung von DC für therapeutische Tumorvakzinierungen zur Induktion einer gegen Malignome gerichteten Immunantwort. Die Benutzung von PGE2 als Reifestimulus für MoDC, die mit Protein-Antigenen gepulst werden, birgt das Risiko, die Induktion von tumorantigenspezifischen CD8+ T-Zellen negativ zu beeinflussen.

Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

Die Kontrolle von selbstreaktiven T-Zellen durch Toleranzmechanismen ist ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems zur Vermeidung von Autoimmunkrankheiten. Man vermutet, dass Kreuzpräsentation von körpereigenen Ag in Abwesenheit einer Entzündung einen Mechanismus darstellen könnte, periphere CD8+ T-Zell-Toleranz zu induzieren. Durch Kreuzpräsentation werden von Dendritischen Zellen (DC) Antigene (Ag), die nicht von DC selbst exprimiert werden (exogene Ag), im Kontext von MHC Klasse I an CD8+ T Zellen präsentiert. Apoptotisches Material, welches von eigenen Geweben stammt, könnte dabei als Quelle für Selbstantigene dienen. Man hat kürzlich die Wichtigkeit der kleinen Rho-GTPase Rac1 für die Phagozytose apoptotischen Materials entdeckt. Um die Rolle von Kreuzpräsentation in der peripheren Toleranzinduktion durch DC in vivo zu untersuchen, wurde eine transgene Maus konstruiert, in der Rac1 DC-spezifisch inhibiert ist (CD11c-Rac1(N17) Tg+). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde diese Mauslinie zunächst näher charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die CD11c-Rac1(N17) Tg+ Maus einen Defekt in der Kreuzpräsentation von löslichem Protein aufzeigt. Dabei war der Effekt unabhängig von der Art der Ag-Aufnahme. Die Präsentation endogener Ag in Form von Viren oder die Präsentation löslicher Peptide war indes normal. Durch Verwendung von OVA-Alexa Fluor 647 und DQ-OVA konnte festgestellt werden, dass in transgenen DC die Menge aufgenommenen OVA-Proteins reduziert und die Menge prozessierten OVA-Proteins normal bis leicht reduziert ist. Kerksiek et al. zeigten außerdem eine verminderte Phagozytose von zellassoziierten Ag durch transgene DC. Es ist insgesamt anzunehmen, dass eine verminderte Kreuzpräsentation zumindest zum Teil auf einem Defekt in der Ag-Aufnahme beruht, evtl. auch auf einen Defekt im Prozessierungsablauf. Eine reduzierte Ag-Präsentation von löslichen Ag durch transgene DC an CD4+ T-Zellen konnte ausgeschlossen werden. Diese Ergebnisse zeigen zusammenfassend, dass die CD11c-Rac1(N17) Tg+ Maus ein geeignetes Werkzeug darstellt, um die Rolle von Kreuzpräsentation in vivo zu studieren. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde weiterhin gezeigt, dass Kreuzpräsentation ein wichtiger Prozess ist, um periphere Toleranz zu induzieren und aufrechtzuerhalten. In einem Mausmodell für autoimmunen Diabetes (Rip-mOVA), löste die verminderte Kreuzpräsentation von membrangebundenem Ovalbumin (mOVA) im Pankreas Diabetes aus. Es wurde zwar weniger Proliferation der OT-I T-Zellen in doppeltransgenen Mäusen (Rac/Rip) als in Rip-mOVA Mäusen beobachtet, diese noch vorhandenen OT-I Zellen waren jedoch wegen verminderter Kreuztoleranz nicht anerg, wie es in Rip-mOVA Mäusen zu sehen war. Das führte nach Immunisierung mit HSV-OVA schließlich zur Zerstörung der -Inselzellen und damit zur Auslösung von Diabetes. Versuche, in denen T-Zellen von CD11c-Rac1(N17) Tg+ Mäusen in Rezipienten mit Thy1.1 Hintergrund transferiert wurden, deuten auch darauf hin, dass in CD11c-Rac1(N17) Tg+ Mäusen die Ausübung peripherer Toleranz inhibiert ist. Es sollte weiterhin gezeigt werden, ob die potentiell autoreaktiven CD8+ T-Zellen der transgenen Mauslinie ausreichen, um Autoimmunität in Form einer Transplantat-gegen-Empfänger Krankheit (GVHD) auszulösen. In Abwesenheit von CD4+ T-Zellen blieben (auch) die (Kontroll-) Versuchstiere gesund. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass eine effektive Kreuzpräsentation auf die CD4+ T-Zell Hilfe angewiesen ist. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, wie essentiell die ständige Kreuzpräsentation von exogenen Selbstantigenen für die Kontrolle von Autoimmunreaktionen ist.

Dendritische Zellen (DC) übernehmen essentielle Aufgaben in der Homöostase des Immunsys-tems und in der Induktion von Toleranz oder Immunität. Eine besondere Wechselwirkung findet hierbei zwischen DC und T-Zellen statt, welche durch die Präsentation und Erkennung von Selbstpeptiden, beziehungsweise Fremdantigenen, vermittelt wird. DC spielen eine wichtige Rolle bei der Selektion eines funktionellen T-Zell-Kompartiments im Thymus. In der vorliegenden Stu-die wurde die Funktion der Antigenpräsentation von DC für die Homöostase und die Aktivierung von CD8-T-Zellen in vivo untersucht. Diese Arbeit soll zeigen, dass die Präsentation von Selbstpeptiden auf DC die homöostatische Pro-liferation (HP) von naiven CD8-T-Zellen induziert. Nach der Depletion von T-Zellen durch Be-strahlung oder Antikörpergabe kam es zu einer HP von naiven CD8-T-Zellen. Diese Proliferation war streng MHC-abhängig. Die Expression von MHC-I auf DC reichte aus, um eine komplette HP zu erlauben, welche im Teilungsmuster, der Aktivierungsmarkermodulation und den Proliferati-onsraten jener von proliferierenden Zellen in C57BL/6-Wildtypmäusen glich. Überraschenderwei-se waren CD4-T-Zellen in der Lage, die HP von transferierten naiven CD8-T-Zellen zu inhibieren. Erst durch die Depletion von endogenen CD4-T-Zellen kam es zu Teilungen, während CD25-positive regulatorische T-Zellen keinen Einfluss auf die HP von naiven CD8-T-Zellen ausübten. DC sind essentiell um Toleranz beziehungsweise Immunität nach der Erkennung von Fremdanti-genen zu generieren. Um die Bedeutung der Antigenpräsentation auf DC genauer zu charakterisie-ren, wurde die Immunantwort in einem Mausstamm, in welchem alle Zellen MHC-I tragen zu Tie-ren, in denen nur DC MHC-I exprimieren und somit naive CD8-T-Zellen aktivieren können, un-tersucht. Hierbei wurde deutlich, dass DC ausreichten um Toleranz, als auch Immunität von nai-ven CD8-T-Zellen zu induzieren. Kam es jedoch zu einer differentiellen Antigenpräsentation nach systemischer Administration des Antigens (als Peptid oder Virus in die Blutbahn), waren antigen-präsentierende nicht-DC in der Lage, die Immunantwort abzuschwächen. Dies geschah durch In-duktion von Apoptose, wodurch die Anzahl antigenspezifischer Effektor-T-Zellen verringert und somit auch die Formation des immunologischen Gedächtnisses beeinträchtigt werden konnte. Diese Ergebnisse betonen die enorme Bedeutung der Antigenpräsentation durch DC, weisen aber auch auf die besondere Rolle der Antigenpräsentation durch andere Zelltypen als DC hin, welche in der Lage sind eine Immunantwort deutlich zu modulieren.

Ziel dieser Dissertation war es, die Funktionen des rekombinanten humanen Hitzeschock-Protein 70 (rhuHsp70) in der durch dendritischen Zellen (DCs) vermittelten innaten und adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Intrazellular hat das Hitzeschock-Protein 70 vielfältige Funktionen unter anderem bei der Proteinfaltung und der Verhinderung von Aggregationen. Die Rolle des extrazellulären Hsp70 im Immunsystem ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Aufgrund seiner verschiedenen beschriebenen Funktionen, die die innate Aktivierung von von immunkompetenten Zellen, wie DCs, und die effiziente Präsentierung von gebundenen Antigenen umfassen, wurde ein bedeutendes thera-peutisches Potential des rekombinanten oder aus Tumormaterial isolierten Hsp70 für die immun-basierte Tumortherapie postuliert. Allerdings gibt es zu der Rolle von Hsp70 im Immunsystem widersprüchliche Daten. Mit dem Nachweis von Kontaminationen in dem für viele Studien verwendeten rekombinanten Hsp70, die auf die E.coli Kultur zurückgeführt wurden, wurden die Funktionen von Hsp70 angezweifelt. Welches therapeutisches Potential Hsp70 tatsächlich hat, war offen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass rhuHsp70 die Kreuzpräsentation von Peptidantigenen signifikant steigerte. Durch den Vergleich von gleichen Mengen Peptid-antigen, allein oder im Komplex mit rhuHsp70, wurde zum ersten Mal die Steigerung durch rhuHsp70 quantifiziert. Dabei zeigte rhuHsp70 selbst keine Signal-Funktion auf die DCs. RhuHsp70 induzierte keinen intrazellulären Einstrom von Calciumionen, induzierte nicht die phänotypische Maturierung, aktivierte nicht Zytokinsektretion und veränderte nicht die Makropinozytoseeigenschaften der DCs. Demnach hat rhuHsp70 keine dem einem Maturierungssignal vergleichbaren Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Reinheit des verwendeten rhuHsp70 entscheidend für die korrekte Schlussfolgerung und Interpretation der experimentellen Ergebnisse ist. Schon geringe Mengen an Kontaminationen wie Endotoxine haben stimulatorische Aktivität auf DCs, die fälschlicherweise dem rhuHsp70 zugeschrieben wird. Mit dieser Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass die in den rhuHsp70 Präparationen in nanomolaren Konzentrationen enthaltenen freien Nukleotide und nicht rhuHsp70 selbst den intrazellulären Einstrom von Calciumionen in DCs induzieren. Bis dato wurden die Nukleotide nicht als Ursache für das mit Hsp70 induzierte Calciumsignal beachtet. Mit der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin gezeigt, dass die Funktion von rhuHsp70 in der Kreuzpräsentation nicht an eine innate Signalfunktion gebunden ist. Durch eine bisher nicht durchgeführte Verknüpfung von biochemischer Analyse der Substrat- rhuHsp70 Interaktionen und immunologischer Antigenpräsentation wurde als wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Kreuzpräsentation die Komplexbildung zwischen Peptid und rhuHsp70 nachgewiesen. Die gesteigerte Kreuzpräsentation korreliert direkt mit der biochemischen Komplexbildung. Dabei war die rhuHsp70 vermittelte Steigerung unabhängig von TAP, Sec61 und der Ansäuerung der endolysosomalen Kompartimente. Die Kreuzpräsentation von verschiedenen Peptiden mit unterschiedlichen Prozessierungsbedingungen wurde durch Bindung an rhuHsp70 verstärkt. Es wurde gezeigt, dass mehr Peptidantigen in den APCs vorhanden war, die mit rhuHsp70:Peptid inkubiert wurden, im Vergleich zu den APCs, die mit der gleichen Menge Peptid ohne rhuHsp70 inkubiert wurden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die verbesserte Kreuzpräsentation der Peptid-antigene durch rhuHsp70 auch zu einer Zunahme von Antigen-spezifischen T-Zellen unter Primingbedingungen führt. Dabei wurden beim Priming mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger oder gleich viel Antigen-spezifische IFN-g und Perforin sezernierenden Zellen erhalten. Bemerkenswert ist, das die Zellen aus dem Primingansatz mit den rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs eine deutlich bessere Antigenspezifität als die Zellen aus dem Primingansatz mit Peptid gepulsten DCs aufwiesen. Die Quantifizierung der Zusammensetzung der geprimten Zellpopulation ergab, dass mit rhuHsp70:Peptid gepulsten im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger CD8+ T-Zellen erhalten wurden. Konsistent wurde eine Zunahme der CD3+CD4+ T-Zellen beobachtet. Innerhalb dieser CD3+CD4+ T-Zellpopulation war der Anteil der FOXP3+ T-Zellen in den Ansätzen mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs erhöht, aber es wurde hierbei keine konsistente Zunahme der CD25++FOXP3+ Zellen beobachtet. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit ergeben sich neue interessante Fragen zu der Interaktion von rhuHsp70 mit dem Immunsystem. So ist zu klären, welche Funktionen die durch das Priming mit rhuHsp70:Peptid Komplex gepulsten DCs entstehenden CD4+ T-Zellen ausüben. Wichtig ist auch, den Grund der besseren Antigenspezifität der mit rhuHsp70:Peptid Komplex geprimten Zellen zu untersuchen.

Salmonellen verfügen über ein sogenanntes Typ III-Sekretionssystem (T3SS), mit dessen Hilfe Effektormoleküle mit zellmodulatorischer Funktion durch die Wirtszellmembran direkt in das Zytosol von Makrophagen, dendritischen Zellen oder Epithelzellen transloziert werden. Das Salmonella-T3SS kann verwendet werden, um heterologe Proteine in den endogenen MHC Klasse I-Antigenpräsentationsweg von eukaryontischen Zellen einzuschleusen. Als T3SS-Trägerprotein hat sich das „Yersinia outer protein E“ (YopE) bewährt. Als Modellantigene dienten die immundominanten Proteine Listeriolysin O (LLO) und p60 des intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes. Am Beispiel der murinen Listeriose konnte im Tiermodell demonstriert werden, dass die einmalige orale Immunisierung mit einem rekombinanten S. typhimurium-Impfstamm, der entweder chimäres YopE/LLO oder YopE/p60 exprimiert und transloziert, zu einer effektiven und protektiven CD8 T-Zellantwort führt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der Einfluss von Booster-Immunisierungen auf die Induktion antigenspezifischer CD8 T-Zellantworten im oralen Mausmodell untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass der rekombinante S. typhimurium-Impfstamm nach homologen Booster-Immunisierungen zeitlich in seiner Fähigkeit beeinträchtigt war, Darm, mesenteriale Lymphknoten und die Milz geimpfter Mäuse zu kolonisieren. Die schnelle Eliminierung der Salmonellen nach wiederholter oraler Gabe beruhte dabei nicht auf p60217-225-spezifischen zytotoxischen CD8 T-Zellen, die durch die primäre Immunisierung induziert worden waren, sondern auf einer gegen den Impfstamm gerichteten Immunantwort, der sogenannten anti-Vektor-Immunität. Die herabgesetzte Kolonisierungsdauer nach Boost-Immunisierungen verhinderte dabei auch eine verstärkte antigenspezifische CD8 T-Zellantwort. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass im Gegensatz zu einer Langzeit-Kolonisierung über einen Zeitraum von 21 Tagen, eine Kurzzeit-Kolonisierung oral immunisierter Mäuse über 6 Tage nicht ausreicht, um eine schützende p60-spezifische CD8 T-Zellantwort gegen Listeriose zu induzieren. Durch die Verwendung von zwei verschiedenen Salmonella-Serovaren (S. dublin und S. typhimurium) im Rahmen einer heterologen „prime-boost“-Immunisierung konnte die Salmonella-spezifische anti-Vektor-Immunität umgangen werden. Diese Strategie führte zu einer verlängerten Kolonisierungsdauer von über 14 Tagen und zu einer verstärkten antigenspezifischen CD8 T-Zellantwort nach Booster-Immunisierungen.

Die Triomzell-Vakzinierung ist ein neuer, überaus potenter Ansatz in der Immuntherapie maligner Lymphome. Aus A20-Lymphomzellen der Maus wurde durch Fusion mit der Ratten-Hybridomzelllinie 2.4G2 die Triomzelllinie BiV hergestellt. Die entstandenen Triomzellen enthalten potenziell alle Antigene der parentalen Lymphomzellen und zusätzlich die anti-Fcγ-Rezeptor-Spezifität des Hybridoms. Die Präsentation der Tumorantigene wird somit durch Redirektion gegen internalisierende Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) ermöglicht. Durch Triom-Immunisierung konnte nicht nur ein Langzeit-Tumorschutz in Mäusen vermittelt werden, sondern es wurden sogar etablierte Tumoren abgestoßen. Der Tumorschutz wird dabei über CD4+ und CD8+ T-Zellen vermittelt, die humorale Immunantwort spielt nur eine untergeordnete Rolle. Mehrfach in vitro restimulierte und adoptiv transferierte T-Zellen aus immunisierten Mäusen waren im Gegensatz zu identisch behandelten T-Zellen aus naiven Mäusen tumorprotektiv. Das war insofern erstaunlich, als beide T-Zellpopulationen in vitro den gleichen A20-spezifischen Aktivierungszustand zeigten. Ein eingeschränktes T-Zell-Rezeptor-(TZR-) Repertoire von in vitro restimulierten T-Zellen aus immunisierten Mäusen korrelierte mit dem Tumorschutz. Restimulierte T-Zellen aus naiven Mäusen zeigten hingegen keine Einschränkung im TZR-Repertoire. Durch die Immunisierung der Mäuse erfolgt offensichtlich eine In-vivo-Aktivierung, die sich durch In-vitro-Stimulationen nicht nachstellen lässt.

Tue, 13 Dec 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7903/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7903/1/Werner_Melanie.pdf Werner, Melanie ddc:500, ddc:570, Fakult

Die bisherige Analyse der mini-LCL-stimulierten T-Zelllinien konzentrierte sich hauptsächlich auf die zytotoxischen CD8+ T-Zellen. Klinische Studien haben aber gezeigt, dass für eine lang anhaltende Immunität nach Stammzelltransplantation (SCT) der adoptive Transfer von CMV-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen wichtig ist. Neuere Studien unterstreichen die Rolle der CD4+ T-Zellen bei der Etablierung eines funktionierenden CD8+ T-Zellgedächtnis. Darüber hinaus wirken CD4+ T-Zellen antiviral durch die Sekretion von Zytokinen, wie IFN-g und TNF-a, und können ebenfalls zytotoxisch aktiv gegen Virus-befallene Zellen werden. Die vorliegende Arbeit sollte untersuchen, ob das mini-EBV-System geeignet ist T-Zellen zu generieren, die viele verschiedene CMV-Epitope - durch MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle präsentiert - erkennen. T-Zellkulturen von Spendern mit unterschiedlichen HLA-Typen sollten etabliert und analysiert werden. Dabei stand eine eingehende Analyse der Epitop-Spezifitäten der generierten T-Zellen im Vordergrund. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob sich mLCLs zur Primärstimulation von naiven T-Zellen eignen. Da neben pp65 auch IE1 ein weiteres wichtiges CMV-Antigen darstellt, sollten zwei neue mEBV-Plasmide konstruiert werden, damit auch Spender erreicht werden können, die keine ausgeprägte Immunantwort gegen pp65 besitzen. Es gibt nur wenige gesunde Seropositive, die keine Immunität gegen zumindest eines dieser beiden Antigene besitzen. Ein Vektor sollte eine Expressionskassette für IE1 enthalten, der zweite eine Kassette für ein Fusionsprotein bestehend auch pp65 und IE1 (pp65_IE1). Mit Hilfe der generierten IE1-mLCLs und pp65_IE1-mLCLs sollten autologe T-Zellen stimuliert und ihre Eigenschaften eingehend charakterisiert werden.

Durch den Transfer tumorspezifischer T-Zellen können solide Tumore nicht nur in Tieren, sondern auch im Menschen erfolgreich behandelt werden. Dudley et al. konnten kürzlich nach dem autologen Transfer stimulierter tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) nach vorheriger non-myeloablativer Konditionierung in zwei von zwölf Patienten mit Melanomen eine Tumorregression erreichen (Dudley et al. 2002). Änliche Erfolge konnten Chang et al. bei der Behandlung von fortgeschrittenen Nierenkarzinomzellen erzielen (Chang et al. 2003). Sie vakzinierten Patienten mit Calmette-Guérin Bacillus versetzten Tumorzellen und ernteten anschließend die T-Zellen aus den angrenzenden Lymphknoten der Vakzinierungsregion. Nach autologem Transfer der vorwiegend CD8+ T-Zellen, welche in vitro mit anti-CD3 stimuliert wurden, sprach die Therapie bei neun von 34 Patienten an. Die Mechanismen der T-zellvermittelten Tumorregression sind aber bis heute noch unklar. Gegenstand dieser Arbeit war es daher Faktoren zu untersuchen, welche eine Rolle bei der Regression von D5-Melanomlungenmetastasen durch den adoptiven Transfer CD4+/CD8+ T-Zellen aus Tumorvakzin drainierenden Lymphknoten (TVDLN) nach Vakzinierung mit D5G6 (einem GM-CSF transduzieren D5-Subklon) spielen. Hierzu wurden D5-Zellen in vitro mit Zytokinen, welche von Effektor T-Zellen (TE) produziert werden, stimuliert. Wir konnten zeigen, dass D5-Tumorzellen die als proapoptotisch geltenden Rezeptoren TNF-R I sowie Fas nach IFN-g-Stimulation exprimieren. Die Inkubation mit den Liganden dieser Rezeptoren TNF-a, LT-a und FasAb bewirkt keine Apoptoseinduktion. Gleichzeitige Inkubation dieser Liganden führt nur zu einer Apoptoserate von 25% in D5. Mögliche Gründe der relativen Apoptoseresistenz von D5 könnten die intrazellulären Apoptoseinhibitionsproteine c-IAP I, c-IAP II und Survivin sein, welche wir in D5 nachweisen konnten. Da nach adoptivem Transfer tumorspezifischer TE Makrophagen die pulmonalen Tumormetastasen infiltrieren, untersuchten wir, ob TE Chemokine exprimieren. Unsere Untersuchungen ergaben, dass TE die Chemokine MIP-1a, MIP-1b und RANTES tumorspezifisch exprimieren. Nach Stimulation von D5-Tumorzellen mit den Zytokinen TNF-a und IFN-g, welche von TE tumorspezifisch exprimiert werden, wird die Chemokin-mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig in D5 exprimiert. Auch die Koinkubation von D5 mit TE induziert die Expression der mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig. Deutlich erhöhte KC und MCP-1 Proteinkonzentrationen wurden im Überstand von D5-Tumorzellen mittels ELISA nach TNF-a Stimulation gegenüber unstimulierten und IFN-g stimulierten D5-Zellen festgestellt. Um zu prüfen, ob die von D5 gebildeten Substanzen auch tatsächlich chemotaktisch auf Makrophagen wirken, führten wir einen chemotaktischen Assay durch. Wir konnten zeigen, dass es zu einer signifikanten Steigerung der Anzahl migrierter Makrophagen in Richtung D5- Tumorzellen nach deren Stimulation mit IFN-g und TNF-a kommt. Da wir in TE die Expression von TNF-a-mRNA und die Sekretion von IFN-g tumorspezifisch nachweisen konnten, besteht Grund zur Annahme, dass in vivo TE in der Lage sind Tumorzellen zur Chemokinbildung anzuregen, was zu einer Invasion von Makrophagen in die Tumorregionen führt. Dass Makrophagen möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Tumorregression spielen, deckt sich auch mit der Beobachtung von Feinmesser et. al., welche mit einer peritumorösen Injektion von Multikinen (Zytokin-/Chemokinmischung) Kopf und Halstumore behandelten (Feinmesser et al. 2003). Nach dieser Therapie zeigte sich in den Tumorregionen der erfolgreich behandelten Patienten im Gegensatz zu Non-Respondern eine hohe Anzahl migrierter und aktivierter Makrophagen. Wir fanden mit den Ergebnissen unserer Studie erstmals Hinweise darauf, dass im murinen Melanommodell B16BL6-D5 nicht ausschließlich die direkte T-zellabhängige Zytotoxizität zur Tumorregression führt, sondern dabei weitere Zellarten wie Makrophagen/Monozyten involviert sind, welche mittels tumorspezifischer Chemokine rekrutiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung der Mechanismen T-zellvermittelter Tumorregression. Die Kenntnisse dieser Mechanismen haben entscheidende Bedeutung bei der Entwicklung neuer, effektiver Behandlungskonzepte gegen solide Tumore.

Dendritische Zellen (engl.: dendritic cells, DC) gelten seit ihrer Entdeckung als eine der wichtigsten Zelltypen des Immunsystems. Dies gilt sowohl für die Erzeugung von Immunität als auch von Toleranz, insbesondere in Bezug auf T-Zell-vermittelte Immunreaktionen (Banchereau et al. 1998). Im Zuge dessen wird in DC enorme Hoffnung bezüglich des Verständnisses von Autoimmunerkrankungen sowie Erkrankungen wie z.B. Krebs gesetzt, bei der DC schon seit einigen Jahren zur Immuntherapie verwendet werden (Banchereau et al. 2001). Die Analysen von DC beinhalteten jedoch bisher immer die Isolation von DC ex vivo oder deren Kultivierung in vitro. Diese experimentellen Versuchsschritte zeigten einen tiefgreifenden Einfluss auf den Phänotyp von DC und somit auch auf deren immunstimulatorischen Eigenschaften (Pierre et al. 1997; Gallucci et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde durch die Entwicklung eines transgenen Maussystems erstmals der generelle Einfluss von DC auf CD8-T-Zellen in vivo detailliert analysiert. Dies konnte direkt an der Qualität der CD8-T-Zellantworten auf bestimmte Immunstimuli abgelesen werden, ohne die DC isolieren oder anderweitig manipulieren zu müssen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Bedeutung von DC im Thymus bei der Selektion sich entwickelnder CD8-T-Zellen analysiert, da es in Bezug auf die Bedeutung von DC sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Selektion widersprüchliche Meinungen gibt. Es konnte gezeigt werden, dass DC im Thymus nicht zur positiven Selektion von CD8-T-Zellen befähigt sind, sondern dass hierbei den Epithelzellen des Thymus eine entscheidende Bedeutung zukommt. Durch Zelltransferversuche konnte weiterhin gezeigt werden, dass DC zur Eliminierung autoreaktiver CD8-T-Zellen, und somit zur Induktion zentraler Toleranz, durch negative Selektion im Thymus ausreichten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Vermögen von DC sowie die Qualität der durch sie induzierten CD8-T-Zell-Immunantworten untersucht. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass DC ausreichend sind, um eine vollständige und funktionelle Immunantwort durch CD8-T-Effektorzellen in vivo zu induzieren. Bei der Aktivierung von CD8-T-Zellen nur durch DC, konnten beim Vergleich mit Wildtyp-Mäusen jedoch auch qualitative sowie quantitative Unterschiede festgestellt werden, die eine mögliche Bedeutung weiterer Zellen bei der „Feinregulation“ CD8-basierter T-Zellantworten wahrscheinlich machen. Im Gegensatz hierzu konnten keine Unterschiede bei CD8-TZellreaktion nach Induktion von Toleranz erkannt werden. DC konnten in diesem Fall eindeutig als der hauptverantwortliche Zelltyp zur Erzeugung peripherer Toleranz in vivo identifiziert werden.

Impfstoffe gelten als effektive und günstige Arzneimittel. Jedoch stehen für viele Infektionskrankheiten wie AIDS, Tuberkulose, Hepatitis C oder Malaria keine oder keine wirksamen Impfmöglichkeiten zur Verfügung. Um gegen intrazelluläre Erreger oder auch Tumore wirksam zu sein, muß ein potentieller Impstoff eine humorale und eine starke zelluläre Immunantwort induzieren. Diese Vorraussetzung kann vor allem durch genetische Immunisierungen mit DNA oder viralen Vektoren erfüllt werden. Vor diesem Hintergrund wurde im Rahmen dieser Arbeit das Potential einer DNA-Vakzine und eines HSV-1-basierten Vektors untersucht, Mäuse vor Infektionen mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes zu schützen. Zunächst wurde die Immunantwort untersucht, welche durch Immunisierung mit einem OVA-kodierenden Plasmid induziert wurde. Dabei konnte erstmals in vivo gezeigt werden, daß die Form (sezerniert oder membrangebunden) des exprimierten Antigens nach einer DNA-Immunsierung mittels Gene Gun sowohl das Ausmaß der humoralen Immunantwort beeinflußt, als auch die Expansion antigenspezifischer CD4- und CD8-T-Zellen. Desweiteren stellte sich heraus, daß replikationsinkompetente, rekombinante HSV-1- (rHSV-1) Vektoren und HSV-1-Amplikons in der Lage sind, eine sehr starke CTL-Antwort, aber nur eine schwache Antikörper- und CD4-T-Zellantwort zu induzieren. Eine starke, antigenspezifische CTL-Antwort konnte ebenso durch Immunisierung mit rekombinanten MVA-Vektoren generiert werden. In Vakzinierungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, daß mit rHSV-1 immunisierte Mäuse vor Infektionen mit hohen Dosen an rekombinanten Listerien geschützt waren, wohingegen DNA-immunisierte Mäuse nur vor Infektionen mit einer mittleren, aber dennoch letalen Dosis geschützt waren. Der Immunschutz war in beiden Fällen von langer Dauer. Im Rahmen dieser Arbeit konnte demonstriert werden, daß die DNA-Immunisierung per Gene Gun eine einfach anzuwendende, verläßliche und effektive Methode ist, eine humorale und zelluläre protektive Immunantwort in Mäusen zu induzieren. Besonders im Hinblick auf neue Vakzinierungsstrategien gegen intrazelluläre Erreger, die vor allem durch starke zytotoxische T-Zellantworten bekämpft werden können, erscheinen Immunisierungen mit rHSV-1-Vektoren als sehr geeignete Methode, die es gilt, sorgfältig zu untersuchen und weiterzuentwickeln.

Die Immunantwort auf ein Verbrennungstrauma beginnt im Moment der Verletzung und resultiert in einer Monozytenaktivierung, die mit einer vermehrten Synthese und Ausschüttung von inflammatorischen Mediatoren einhergeht. Unter physiologischen Bedingungen dient ein ausgewogenes Zusammenspiel von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen der Homöostase, wohingegen das Immunsystem nach massivem Trauma mit einer oft exzessiven Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren reagiert. Patienten mit schwerer Verbrennungsverletzung sind daher hochgradig gefährdet ein ausgedehntes „systemic inflammatory response syndrome, (SIRS)“, d. h. eine maligne Ganzkörperinflammation, eine Sepsis oder eine Multiorgandysfunktion, assoziiert mit einer hohen Letalität, zu entwickeln. Eine überwiegend antiinflammatorische Immunantwort dagegen manifestiert sich als systemische Immundefizienz und Anergie mit einer signifikant erhöhten Infektionsanfälligkeit. Es besteht eine eindeutige Ursache-Effekt-Beziehung zwischen Trauma und Zytokinsystem. Mechanischer Stress führt zu schweren Störungen der Interaktion von Monozyten und T-Zellen mit der Folge einer schwerwiegenden Immundysfunktion, wobei PGE2 als einer der Hauptmediatoren der traumainduzierten Immundepression angesehen wird. Erhöhte PGE2-Spiegel sind mit einer reduzierten T-Zellmitogenese, IL-2-Produktion und IL-2-Rezeptorexpression korreliert und für eine Verschiebung der T-Helfer-Aktivität in Richtung eines dominierenden TH2 Phänotyps mit erhöhter Synthese der immunsuppressiven Zytokine IL-4 und IL-10 verantwortlich. Zytokine sind für die Kommunikation im Immunsystem, vor allem bei der Koordination einer Immunantwort durch T-Lymphozyten, von entscheidender Bedeutung. Als sezernierte Proteine waren sie bis vor kurzem der durchflusszytometrischen Analyse nur begrenzt zugänglich. Wir konnten sie wie in vorliegender Arbeit beschrieben in fixierten Zellen intrazellulär nachweisen, d. h. vor der Sekretion. Dieses Verfahren erlaubte es uns, die Expression der Zytokingene quantitativ, kinetisch, korreliert mit Oberflächenproteinen und auf die Einzelzelle bezogen analytisch zu erfassen, zumindest bis zur posttranslationalen Ebene. In peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) von 10 Patienten mit schwerer Verbrennungsverletzung (KOF >30%) und 15 gesunden Kontrollpersonen wurde die Zytokinsynthese mit Ionomycin und PMA polyklonal induziert und die Zellen anschließend mit fluorochromkonjugierten monoklonalen Antikörpern gegen IL-2, IL 4 und IFN-g, sowie gegen CD4-, CD8-, CD45RA- und CD45RO-Zelloberflächenantigene in unterschiedlichen Kombinationen gefärbt. Massives Verbrennungstrauma führte nach polyklonaler Stimulation der T Lymphozyten zu teils signifikanten systemischen Veränderungen der Zytokinexpression in den Kulturüberständen. Verglichen mit einer exzessiven IL-4 Freisetzung und stark erhöhter IL-10 Sekretion zeigten die IFN-g- und die IL-2 Synthese eine nur mäßige Steigerung gegenüber den gesunden Kontrollen. Wir sahen somit eine traumatisch induzierte Veränderung des Zytokinprofils in Richtung eines überwiegend TH2-artigen, immunsuppressiven Phänotyps. Diese Verschiebung von einer eher zytotoxischen (TH1) zu einer weitgehend humoralen und daher abgeschwächten Immunantwort ist mit einer erhöhten Infektionsanfälligkeit verbunden. Mit der durchflusszytometrischen Einzelzellanalyse gelang uns dann erstmalig die Identifikation der CD8+ Zelle, die ursächlich für die gesteigerten Syntheseantworten im posttraumatischen Verlauf verantwortlich ist. Die Synthesekapazität der CD4+ T-Helferzellen blieb nahezu unverändert. Eine Ausnahme bildete die prozentuale Abnahme IFN-g positiver Gedächtniszellen (CD45RO+) zugunsten einer zunehmenden Zahl IFN-g produzierender naiver T Helferzellen (CD45RA+). In der CD8+ Subpopulation kam es in der ersten Woche nach Verbrennungsverletzung zu einer signifikanten Steigerung der IL-2, IL-4 und IFN-g de novo Synthese, die interessanterweise bei weiterer, differenzierter Analyse eine positive Korrelation mit dem klinischen Verlauf ergab. Patienten, die verstarben, zeigten im Vergleich zu den Überlebenden signifikant erhöhte IL-4 und IL-2 Syntheseraten der CD8+ Zellen. Betrachtet man die IL-2 Synthese dieser CD8+ Zellen genauer, nahm nur die Zahl IL-2-produzierender CD8+CD45RA+ Zellen signifikant zu, verglichen mit dem Kontrollkollektiv, wobei beide Patientenkollektive an dieser Entwicklung partizipierten. Auch die IFN-g Synthese der CD8+CD45RA+ Subpopulation zeigte an allen Tagen post Trauma eine signifikante Zunahme gegenüber den Kontrollen ohne aber mit der Überlebensrate zu korrelieren. Dagegen war der prozentuale Anteil IFN-g produzierender CD8+ CD45RO+ Zellen von Verstorbenen signifikant gegenüber den Überlebenden reduziert und blieb auch an allen Untersuchungstagen deutlich hinter dem Kontrollniveau zurück, das von den überlebenden Patienten z. T. signifikant übertroffen wurde. Neben der funktionellen Charakterisierung über die Zytokinexpression (intrazellulär) kann der Aktivierungsstatus des Immunsystems durchflusszytometrisch auch über eine Oberflächenphänotypisierung ermittelt werden, ohne aber damit funktionell unterschiedliche Subpopulationen von T Zellen definieren zu können. Einen ersten Hinweis auf die Aktivierung des Immunsystems von Verbrennungspatienten erhielten wir über die signifikante Zunahme von IL-2Ra (CD25) tragenden T-Zellen in der ersten Woche nach Trauma. Aktivierte T-Zellen exprimieren darüberhinaus MHC-Klasse II-Moleküle und verschiedene Adhäsionsmoleküle, denen bei der Wechselwirkung der Zellen entscheidende Bedeutung zukommt. Akzessorische Moleküle erhöhen beispielsweise die Avidität der T-Zell-APC Interaktion und wirken kostimulatorisch. Wir konnten nach schwerer Verbrennungsverletzung eine verstärkte Expression des vorherrschenden T-Zellrezeptors (TCR) a/b und der akzessorischen T Zellmoleküle CD2, CD7, CD28, CD29 und CD80 nachweisen. Die Zunahme von CD28-Molekülen auf der Oberfläche von CD4+ und CD8+ T-Zellen ist besonders bemerkenswert, da mit zunehmender Signalstärke des über CD28 vermittelten Signals die Differenzierung einer T-Zelle auf die TH2-Entwicklung ausgerichtet wird. Die Aktivierung von T-Lymphozyten ist außerdem mit markanten Veränderungen im Expressionsmuster einzelner CD45 Isoformen verknüpft. Die Induktion der CD45RO Isoform und der Verlust von CD45RA waren beim Schwerstverbrannten besonders auffällig. Die durchflusszytometrische Bestimmung des Aktivierungsstatus des Immunsystems hat unseres Erachtens das Potenzial einer Standardmethode zur Ermittlung von Hochrisikopatienten mit deren Hilfe immunsupprimierte Patienten und solche mit SIRS und Sepsis unterschieden werden können. Die zentrale Vorbedingung für eine effektivere Sepsistherapie stellt eine verbesserte Diagnostik im Sinne kontinuierlicher zellbiologischer Informationen („Online-Monitoring“) am Krankenbett dar, um die meist sehr schnell wechselnden immuninflammatorischen Zustandsbilder direkt zu erkennen und einer zeitgerechten, individuell adaptierten Behandlungsintervention zuzuführen.

Der Triom-Ansatz hat sich als überaus potente Möglichkeit erwiesen, um gegen das murine A20-B-Zell-Lymphom zu vakzinieren. Das Prinzip beruht auf der Redirektion von Tumorantigenen an Antigen-präsentierende Zellen des Immunsystems durch sogenannte Triom-Zellen. Diese entstehen durch die Fusion der Lymphomzellen mit Hybridomen, die Antikörper gegen internalisierende Fc-Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen exprimieren. Der Tumorschutz wird dabei weniger über eine humorale Immunabwehr vermittelt als vielmehr über CD4- und CD8-T-Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher Aspekte der zellulären Immunantwort in Triom-immunisierten Mäusen untersucht werden. Es sollte geklärt werden, ob tumorspezifische T-Zellen vorhanden sind und ob diese möglicherweise gegen den Immunglobulin-Idiotyp des Tumors gerichtet sind. Dazu wurden T-Zellen aus präimmunisierten Mäusen im Vergleich zu solchen aus unbehandelten und tumortragenden Mäusen in vitro mit verschiedenen Tumorantigenen stimuliert und expandiert. Eine tumorspezifische Aktivierung erfolgte bei den Zellen aus den Triom-immunisierten Mäusen am schnellsten und effektivsten. Nach häufigeren Stimulationen stellten sich jedoch bei allen T-Zellen ähnliche Aktivierungswerte ein. In Versuchen mit Idiotyp-negativen A20-Tumorzellen stellte sich heraus, dass der Idiotyp als tumorspezifisches Antigen bei der Aktivierung der T-Zellen zwar eine gewisse Rolle spielt, aber nicht essentiell ist. Auch konnte gezeigt werden, dass alle Zellpopulationen einen CD4+-Phänotyp besaßen. Um über das tumorprotektive Verhalten dieser in vitro reaktiven CD4-T-Zellen auch in vivo einen Überblick zu bekommen, wurden die Zellen nach mehreren Stimulationsrunden zusammen mit Tumorzellen in eine unbehandelte Maus transferiert: Nur die Zellen aus der Triom-immunisierten Maus konnten einen vollkommenen Langzeit-Tumorschutz vermitteln. Dagegen konnten die Zellen aus der tumortragenden Maus das Tumorwachstum nur verlangsamen, und die Zellen aus der unbehandelten Maus zeigten keinerlei Schutzwirkung. Um zu prüfen, ob die unterschiedlichen In-vitro- und In-vivo-Daten zur Tumorspezifität auf der Benutzung von unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren (TZR) beruhten, wurden Studien zum TZR-Repertoire der untersuchten Zellen durchgeführt. In TZR-Vβ-spezifischen RT-PCR-Versuchen konnte gezeigt werden, dass das ursprünglich polyklonale TZR-Repertoire der Zellen erst nach vielen Stimulationsrunden starke Einschränkungen zeigt. Nach kurzer Stimulationszeit fallen hingegen im Vergleich zum Zustand ohne Stimulation keine nennenswerten Unterschiede auf. Die Befunde deuten darauf hin, dass für die Induktion tumorprotektiver T-Zellen eine In-vivo-Aktivierung ablaufen muss, die in vitro nicht simuliert werden kann. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine Einschränkung des TZR-Repertoires mit einem Tumorschutz nach adotivem Transfer der T-Zellen korreliert.

Die gezielte Generierung antigenspezifischer T-Zellinien, zum Beispiel für den Einsatz in der adoptiven Immuntherapie, erfordert die Stimulation der T-Zellen durch Kokultivierung mit anderen Zellen, die das Antigen in einem geeigneten molekularen Kontext auf ihrer Oberfläche präsentieren. Für den Spezialfall der Stimulation Epstein- Barr-Virus-(EBV)-spezifischer T-Zellen existiert ein besonders effizientes System: EBV-immortalisierte B-Zellen, genannt lymphoblastoide Zellinien (LCLs). Solche LCLs sind leicht für jeden beliebigen humanen Spender herzustellen und proliferieren unbegrenzt. Sie exprimieren mehrere virale Proteine, die in vitro wie in vivo eine starke antivirale T-Zell-Antwort hervorrufen, und stimulieren effizient spezifische T-Zellen gegen diese EBV-Antigene. EBV wurde genetisch modifiziert, um ein neues System zur rationellen Generierung antigenpräsentierender Zellen für die T-Zell-Stimulation ermöglichen. Dieses System beruht auf rekombinanten EBV-Vektoren, mini-EBVs, in die das Gen für ein beliebiges Antigen eingebaut wurde. Mini-EBVs immortalisieren B-Zellen, und in den entstehenden Zelllinien, genannt mini-LCLs, wird das gewünschte Antigen exprimiert. Zudem können mini-LCLs im Gegensatz zu LCLs kein infektiöses EBV bilden und sind daher im Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz als besonders sicher anzusehen. In dieser Arbeit sollte die Eignung von mini-LCLs gezeigt werden, effizient ein Fremdantigen zu präsentieren, um antigenspezifische T-Zellen zu restimulieren und expandieren. Schwerpunkt der Arbeiten bilden Untersuchungen mit einem mini-EBVVektor, der als Modellantigen das Gen für pp65 trägt, ein immundominantes T-Zell- Antigen aus dem humanen Cytomegalovirus. Die mini-EBV-Immortalisierung wurde so weit optimiert, daß schließlich bei acht von neun gesunden Normalspendern aus einer kleinen Blutprobe pp65mini-LCLs etabliert werden konnten. Sie waren frei von Wildtyp-EBV, exprimierten intrazellulär pp65 und auf ihrer Oberfläche essentielle Präsentations- und Kostimulationsmoleküle. Durch Restimulation mit der autologen pp65mini-LCL wurden T-Zellinien generiert. Detaillierte Zytotoxizitätsanalysen zeigten die HLA-restringierte, pp65-spezifische Zytotoxizität der pp65mini-LCL-stimulierten T-Zellinien aus vier von vier CMV-seropo-sitiven Spendern. Bei allen diesen T-Zellinien dominierte nach wiederholter Restimulation die pp65-spezifische über die EBV-spezifische Zytotoxizität. T-Zellinien aus EBV-seronegativen Spendern sowie Kontroll-T-Zellinien, die mit Kontroll-mini-LCLs ohne pp65-Expression stimuliert worden waren, zeigten dagegen lediglich eine EBVspezifische Zytotoxizität. Durch Färbung mit HLA:Peptid-Tetrameren wurde die Expansion pp65-epitopspezifischer T-Zellen in allen pp65mini-LCL-restimulierten T-Zellinien aus CMV-seropositiven Spendern nachgewiesen. Bei den drei pp65-T-Zellinien mit einer Kultivierungsdauer von mindestens 50 Tagen, die mit Tetrameren untersucht werden konnten, wurden 40% oder mehr pp65-epitopspezifische CD8+-T-Zellen nachgewiesen. Auch EBV-epitopspezifische Zellen waren nachweisbar, jedoch bestätigten die Tetramer- Analysen, daß durch Restimulation mit pp65mini-LCLs bevorzugt pp65-spezifische T-Zellen expandiert wurden. Der Vergleich mit den Resultaten verschiedener aktuell publizierter Protokolle zur invitro- Generierung pp65-spezifischer T-Zellen für die adoptive Immuntherapie zeigt, daß pp65mini-LCLs ein vorteilhaftes Werkzeug sein werden, um dieses Ziel zu erreichen. Die Erweiterung des mini-EBV-Systems auf andere therapierelevante Antigene ist die Aufgabe der Zukunft.