Podcasts about chemokinrezeptoren

Thu, 31 Jan 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15657/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15657/1/Summo_Claudia.pdf Summo, Claudia

Die Rekrutierung von Zellen ist ein komplexer, in mehreren Schritten ablaufender Mechanismus, der eine zentrale Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie z.B. Entzündung, Transplantatabstoßung, Tumormetastasierung und Stammzell¬migration hat. Die Migration von Zellen aus dem Blutstrom oder einem Reservoir in ein Zielgewebe bzw. Zielorgan und umgekehrt wird durch zahlreiche spezifische und unspezifische Reize ausgelöst und orchestriert. Dies erfolgt zu einem großen Teil durch von Chemokinen regulierte Mechanismen. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, welche an spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte Chemokinrezeptoren (CCR) binden. Zellen mit entsprechenden Chemokinrezeptoren wandern entlang eines Chemokingradienten zum jeweiligen Ziel, z.B. einem Entzündungsherd oder einem Zielorgan. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom (CTCL), einem Non-Hogkin-Lymphom mit primärer kutaner Manifestation. Der Nachweis von Chemokinrezeptoren erfolgte in vitro mit der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Durchflusszytometrie und mit Migrations-versuchen. Der Chemokinrezeptornachweis auf Hautschnitten von CTCL-Patienten erfolgte mit der Immunhistochemie. Erstmals konnte der hautassoziierte Chemokinrezeptor CCR10 im Rahmen des CTCL nachgewiesen werden. Außerdem gelang der Nachweis der Chemokinrezeptoren CCR4, CCR7 und CXCR3 in Hautschnitten und Lymphknotenbiopsien. CXCR3 wurde erstmals im Sezary Syndrom, einer fortgeschrittenen und aggressiven CTCL-Unterform, beschrieben. In der Immunhistochemie wurde die stärkste CCR10-Expression in Sezary Syndrom-Hautschnitten festgestellt. In Biopsien von befallenen Lymphknoten zeigte sich ein auffälliges CCR10-Verteilungsmuster: CCR10-positive Zellen wurden im Lymphsinus nachgewiesen, drangen aber nur vereinzelt in den Lymphknoten ein. In peripheren, nicht-kutanen Lymphomen wurde CCR10 nicht nachgewiesen und ist somit vermutlich exklusiv auf dem primär kutanen CTCL exprimiert. Es ist davon auszugehen, dass CCR10 den Epidermotropismus vor allem in aggressiveren Stadien reguliert. Die Bedeutung von CCR10 für die lymphatische Metastasierung des CTCL ist noch nicht geklärt. CCR10 könnte in der Zukunft als Faktor für die klinische Einstufung des CTCL oder als Ziel für eine gezielte Tumortherapie dienen. Die gezielte Tumortherapie ist u.a. mit Chemokinantagonisten möglich. Sie erlauben die gezielte Beeinflussung der chemokingesteuerten Rekrutierung von Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen. Deshalb wurde ein membranbindender Antagonist des Chemokins CCL5, als potentielles Agens für die lokale Therapie von Tumoren oder von Transplantatabstoßungen, generiert. Das Chemokin CCL5 und seine Rezeptoren spielen in der akuten Transplantatabstoßung und in der Tumorprogression, z.B. im Mammakarzinom, eine zentrale Rolle. Der CCL5-Antagonist Met-RANTES inhibiert in Transplantatabstoßungsmodellen die Rekrutierung von Leukozyten. Der akute Entzündungsprozess und der daraus resultierende chronische Gefäßschäden werden so vermindert. Auch in einem Tumormodell ist ein Effekt auf die lokale Tumorprogression wahrscheinlich. Der in dieser Arbeit hergestellte CCL5-Antagonist Met-RANTES(Dimer)-GPI soll eine lokale Therapie ohne systemische Nebenwirkungen ermöglichen. Durch die erstmals beschriebene Bindung eines Chemokins oder Chemokinderivats an einen Glykosylinositolphosphatidyl (GPI)-Anker soll der Antagonist effektiv in die Zellmembranen von Endothelzellen inkorporiert werden, länger auf dem Endothel verbleiben und die benötigte Proteinmenge vermindern. Zunächst wurde durch die Erweiterung des signalgebenden N-Terminus von CCL5 der CCL5-Antagonist Met-RANTES generiert. Ein Aminosäureaustausch erzeugte ein dimerisierendes Molekül, welches einfacher als die zur Polymerisierung neigende Wildform zu isolieren war. Das Protein wurde mit der PCR mit einem GPI-Anker fusioniert und in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen subkloniert. Met-RANTES(Dimer)-GPI wurde erfolgreich aus den CHO-Zellen isoliert und mit der Säulenchromatographie gereinigt. In in vitro-Versuchen wurde Met-RANTES(Dimer)-GPI effektiv in die Oberfläche von humanen Endothelzellen reinkorporiert und hemmte die transendotheliale Migration von Monozyten, welche bei der Transplantat¬abstoßung und bei der Tumorprogression eine wichtige Rolle spielen. Mit Met-RANTES(Dimer)-GPI präperfundierte Transplantate zeigen möglicherweise einen geringeren vaskulären Schaden bei der akuten Transplantatabstoßungsreaktion. Im Tumormodell soll eine Hemmung der Tumorinfiltration durch Monozyten, welche eine beschleunigte Tumorprogression verursachen, erreicht werden. Im Vergleich zu nicht GPI-gebundenen CCL5-Antagonisten würde eine lokale fokussierte Therapie ermöglicht und eine eventuell geringere zu applizierende Proteinmenge bei längerer Verweildauer erzielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben zunächst einen genaueren Einblick in die Pathogenese des CTCL. Der Chemokinrezeptor CCR7 wird vor allem von fortgeschrittenen Formen mit lymphatischer Infiltration exprimiert. CCR10 wird erstmals im Zusammenhang mit dem CTCL beschrieben und vor allem von fortgeschrittenen Unterformen exprimiert. Desweiteren wurde ein membranbindender Chemokinantagonist hergestellt. Erstmals wird die Kombination eines Chemokins oder Chemokinderivats mit einem GPI-Anker beschrieben. Der Antagonist erlaubt eine hohe lokale Applikation ohne systemische Zirkulation des Agens. Mögliche Einsatzgebiete sind die gezielte Tumortherapie oder die Behandlung der Transplantatabstoßung.

The two chemokine receptors CCR2 and CCR5 play important roles in the recruitment and activation of monocytes/macrophages and T-lymphocytes at sites of infection and inflammation. To further examine their function, I cloned the two murine chemokine receptors Ccr2 and Ccr5 from genomic mouse DNA by a PCR-based cloning strategy and functionally expressed them in stably transfected CHO-cells. These cells were used to generate the first monoclonal antibodies against Ccr2 and Ccr5.

Die Eigenschaft von Leukozyten, das Gefäßsystem zu verlassen und in das umliegende Gewebe auszuwandern, ist von essentieller Bedeutung für die Bekämpfung von Infektionen und darüber hinaus entscheidend für die Pathogenese des I/R-Schadens. Die Extravasation von Leukozyten stellt dabei einen kaskadenartig verlaufenden Prozess dar, welcher sich in die Schritte Rolling, Adhärenz, transendotheliale und interstitielle Migration gliedern lässt. Ein geeignetes Versuchsmodell, welches am M. cremaster der Maus in vivo alle Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses während I/R zu analysieren erlaubt, liegt bisher nicht vor. Während die frühen Schritte des leukozytären Extravasationsprozesses weitgehend aufgeklärt sind, sind die Schritte der transendothelialen und interstitiellen Migration von Leukozyten unzureichend verstanden. In vitro Untersuchungen zeigen, dass das Molekül JAM-A in die Transmigration von Leukozyten involviert ist, jüngste in vivo Studien zeigen jedoch kontroverse Ergebnisse. Ferner gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass die Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 an der Extravasation von Leukozyten beteiligt sind. Welche Bedeutung diese Chemokinrezeptoren für die einzelnen Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei Entzündung und I/R besitzen, ist bislang unklar. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher i) ein geeignetes Modell zur Untersuchung aller Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei I/R am M. cremaster der Maus zu entwickeln, ii) die Bedeutung des Adhäsionsmoleküls JAM-A für die Transmigration von Leukozyten zu untersuchen und iii) die Rolle der Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 für die einzelnen Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei Entzündung und I/R zu analysieren. In unterschiedlichen Versuchsansätzen wurde mit Hilfe der RLOT-Intravitalmikroskopie am M. cremaster anästhesierter Mäuse die leukozytären Migrationsparameter untersucht. Zur Bestimmung des Phänotyps transmigrierter Leukozyten wurden immunhistochemische Färbungen von Paraffinschnitten durchgeführt. In einer ersten Versuchsreihe wurden die einzelnen Schritte des leukozytären Extravasations-prozesses systematisch in Abhängigkeit von Ischämiedauer und Reperfusionszeit untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es bereits nach 30 min Ischämie und 120 min Reperfusion gegenüber schein-operierten Kontrolltieren zu einem starken Anstieg von Leukozyten-adhärenz und -transmigration kommt. Eine Verlängerung der Ischämiezeit auf 60 bzw. 90 min konnte keine Steigerung der Effekte erzielen. Diese Befunde waren der Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen, welche die Mechanismen des leukozytären Rekrutierungs-prozesses näher charakterisieren sollen. In diesem Zusammenhang wurde in einer zweiten Versuchsreihe unter Verwendung von JAM-A-defizienten Mäusen die Bedeutung des Adhäsionsmoleküls JAM-A für die Leukozytenrekrutierung systematisch unter verschiedenen inflammatorischen Bedingungen analysiert. Unsere Daten belegen, dass die transendotheliale Migration von neutrophilen Granulozyten und Monozyten einer Stimulus-spezifischen Regulation durch JAM-A unterliegt. Ferner lassen die Ergebnisse unserer Untersuchungen in eJAM-A-defizienten Tieren darauf schließen, dass endotheliales JAM-A die Transmigration von neutrophilen Granulozyten und Monozyten zwar in der Initialphase entzündlicher Prozesse vermittelt, zu späteren Zeitpunkten jedoch keine Bedeutung mehr zu besitzen scheint. Schließlich deuten unsere Befunde darauf hin, dass leukozytäres JAM-A an den der interstitiellen Leukozytenmigration zugrunde liegenden Mechanismen beteiligt ist. In einer letzten Versuchsreihe wurde die Rolle der Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 für die Rekrutierung von Leukozyten bei Chemokin-induzierter Entzündung und I/R untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Chemokinrezeptoren die Extravasation von neutrophilen Granulozyten und Monozyten bei Chemokin-induzierter Entzündung durch Effekte auf Adhärenz und (konsekutive) transendotheliale Migration mediieren und keinen Einfluss auf das interstitielle Migrationsverhalten transmigrierter Leukozyten besitzen. Des Weiteren ist es mittels durchflusszytometrischer Analyse gelungen, die Expression von Ccr2 und Ccr5 auf nativen neutrophilen Granulozyten nachzuweisen. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass die Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 zur Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten in das postischämische Gewebe durch dynamische bzw. differentielle Regulation von Adhärenz und (konsekutiver) Transmigration beitragen.

Die beiden Pathogen-assoziierten molekularen Muster, CpG-Oligonukleotide, als Imitate bakterieller DNA, und LPS, sind in der Lage, das menschliche Immunsystem zu stimulieren. Vor Entdeckung der Toll-like Rezeptoren konnte nicht zwischen direkten und indirekten Effekten von CpG-Oligonukleotiden und LPS auf Zellen des menschlichen Immunsystems unterschieden werden. Durch die Entdeckung der Toll-like Rezeptoren und vor allem die Charakterisierung von TLR9 als Rezeptor für CpG und TLR4 als Rezeptor für LPS entstand die Möglichkeit, die Zielzellen von PAMPs an Hand der Expression der dazugehörigen Rezeptoren zu definieren. Dendritische Zellen sind im Immunsystem des Menschen essenziell für die Auslösung einer Immunantwort. Sie sind in der Lage, eindringende Pathogene an Hand von PAMPs schnell und sicher zu erkennen, und daraufhin eine passende Immunantwort zu initiieren. Zwei Subpopulationen von dendritischen Zellen konnten kürzlich im peripheren Blut identifiziert werden: Plasmazytoide dendritische Zellen (PDC) und myeloide dendritische Zellen (MDC). In der vorliegenden Arbeit wurden die Unterschiede zwischen PDC und MDC in ihren Reaktionen auf CpG-Oligonukleotide, LPS und CD40 Ligand charakterisiert. Funktionelle Untersuchungen zeigten, dass nur PDC und nicht MDC direkte Zielzellen von CpG-ODN im humanen Immunsystem darstellen, während LPS MDC aktiviert, jedoch nicht PDC. Damit konsistent konnte auf molekularbiologischer Ebene nachgewiesen werden, dass PDC TLR9 exprimieren, jedoch nicht TLR4, während MDC den für die Erkennung von LPS notwendigen Rezeptor TLR4 besitzen, aber TLR9 nicht exprimieren. In gemischten Populationen reagierten auch myeloide dendritische Zellen auf CpG-Oligodesoxynukleotide, was auf eine indirekte Aktivierung durch plasmazytoide dendritische Zellen hinweist. PDC reagierten nach Stimulation mit ODN 2006 mit einer Hochregulation von Reifemarkern und kostimulatorischer Moleküle, der Expression von Chemokinrezeptoren, der Produktion proinflammatorischer Chemokine und einer verminderten Apoptoserate. Nach Stimulation mit ODN 2216 sezernierten sie große Mengen IFN-α, während ODN 2006 für die Induktion von IFN-α eine Kostimulation mit CD40 Ligand benötigte. Weder ODN 2006, ODN 2216 oder CD40 Ligand alleine waren in der Lage, IL-12 in PDC zu induzieren, die synergistische Stimulation von PDC mit CpG-ODN und CD40 Ligand führen jedoch zur Produktion großer Mengen an IL-12. Unter optimaler Stimulation mit ODN 2006 und CD40 Ligand können PDC damit gleichzeitig IL-12 und IFN-α produzieren. Das Verhältnis der produzierten Zytokine ist dabei abhängig vom Differenzierungsgrad der PDC. Durch zunehmende Ausreifung der PDC mit IL-3 verschiebt sich nach der Stimulation das Produktionsverhältnis an sezernierten Zytokinen zugunsten von IL-12. Ausreifung mit ODN 2006 ermöglicht PDC, zudem naive allogene CD4 Zellen zu aktivieren, und induziert in Kokulturen IL-12-abhängig ein Th1-gerichtetes Zytokinprofil in den CD4 T-Zellen. IFN-α schien dabei eine geringe Rolle zu spielen. Durch die Charakterisierung der PDC als TLR9-tragende Zielzelle für CpG-DNA, trägt diese Arbeit entscheidend dazu bei, die PDC als Schlüsselzelle für die physiologischen Wirkungen von TLR9-Liganden zu identifizieren und zu verstehen. Dies ist von hoher Relevanz für die Entwicklung therapeutischer Anwendungen von CpG-ODN in der Tumortherapie, Asthmabehandlung, Infektionsprophylaxe und als Adjuvans bei Impfungen.

Thu, 24 Feb 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3253/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/3253/1/Decard_Sandra.pdf Decard, Sa

Hintergrund und Fragestellung: Die Konfrontation des Immunsystems mit einem definierten Antigen löst eine spezifische Immunantwort aus. Die daran beteiligten TH-Zellen können anhand der von ihnen sezernierten Zytokine in TH1- und TH2-Zellen sowie in weitere Subtypen differenziert werden. Dabei sind TH1-Zellen durch die Synthese von IFN-g charakterisiert, während TH2-Zellen vorwiegend Interleukin-4 produzieren. Die gezielte Auswanderung von TH-Zellen in inflammatorische Gewebe wird unter anderem durch Chemokinrezeptoren, welche chemotaktische Zytokine (sog. Chemokine) binden, gesteuert. TH1-Zellen exprimieren bevorzugt CXCR3 und CCR5, TH2-Zellen dagegen CCR3 und CCR4. TH-Zellen sind an der Pathogenese von Typ I Allergien entscheidend beteiligt. Für die Entwicklung der hinsichtlich der Ausbildung von Typ I Allergien protektiven TH1-Zellen scheint die Auseinandersetzung des Immunsystems mit mikrobiellen Antigenen in der allerfrühesten Kindheit notwendig zu sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in einem Pilotprojekt an einem Normalkollektiv zweijähriger Kinder das Expressionsmuster oben genannter Chemokinrezeptoren auf peripheren TH-Zellen zu analysieren. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, ob ein positiver Zusammenhang zwischen TH2-assoziierten Chemokinrezeptoren und der Familienanamnese hinsichtlich atopischer Erkrankungen, der klinischen Diagnose einer atopischen Dermatitis und anderen in der Allergiediagnostik eingesetzten Parametern besteht, oder sich ein negativer Zusammenhang zwischen den TH1-assoziierten Chemokinrezeptoren und oben genannten Parametern zeigen lässt. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob zwischen der Endotoxinexposition, als Proxy für die mikrobielle Exposition in den ersten Lebensmonaten, und dem Expressionsmuster der Chemokinrezeptoren ein Zusammenhang nachgewiesen werden kann. Ergebnisse:Die Chemokinrezeptoren CCR4, CCR5 sowie CXCR3 waren bei allen Probanden nachweisbar. CCR3 konnte bei acht von 37, IFN-g bei 33 von 42 untersuchten Probanden nachgewiesen werden. IL-4 war nicht nachweisbar. Es bestand ein positiver Trend in der Korrelation zwischen der mRNA-Expression von IFN-g und den Chemokinrezeptoren CCR5 (r=0,571) sowie CXCR3 (r=0,386). Ebenso zeigte sich ein positiver Trend in der Korrelation zwischen CCR5 und CXCR3 (r=0,273). Diese Zusammenhänge waren nicht statistisch signifikant. Dagegen korrelierte die CCR5 mRNA-Expression hochsignifikant (p=0,001) sowie die CCR4 mRNA-Expression grenzwertig signifikant (p=0,046) mit dem Endotoxingehalt in der Muttermatratze der Probanden. Schlussfolgerungen: ·In unstimulierten peripheren T-Helferzellen zweijähriger Kinder ist die Quantifizierung der Chemokinzeptoren CCR4, CCR5 sowie CXCR3 mit Hilfe der real-time RT-PCR möglich. IFN-g ist in der überwiegenden Anzahl der untersuchten Probanden nachweisbar, CCR3 nur bei wenigen, IL-4 bei keinem der Probanden. ·Die mRNA-Expression TH1-/TH2-assoziierter Chemokinrezeptoren in unstimulierten, peripheren T-Helferzellen ist für die Differenzierung von Kindern mit von Kindern ohne atopische Dermatitis nicht hilfreich. ·Dagegen scheint die mRNA-Expression von CCR5 als möglichem Marker einer TH1-Antwort mit dem Symptomenkomplex wheezing zu korrelieren. Dieser Befund muss in Studien mit großen Fallzahlen überprüft werden. Wheezing ist am häufigsten mit viralen Infektionen vergesellschaftet. Die weitere Nachuntersuchung der Kinder im Schulalter wird zeigen, bei welchen Kindern sich dennoch Asthma manifestiert. ·Die perinatale Endotoxin-Exposition ist mit einer erhöhten CCR5 mRNA-Expression peripherer TH-Zellen assoziiert. ·Damit deuten die Befunde auf eine Verwertbarkeit der CCR5 mRNA-Expression als TH1-Marker in unstimulierten peripheren TH-Zellen hin.