Podcasts about ein durchbruch

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.

Die sprunghafte Entwicklung in der Femtosekundenlasertechnologie Anfang der 90er Jahre ermöglicht es, laserphysikalische Experimente in den verschiedensten Bereichen der Naturwissenschaften bei Pulsdauern von einigen Femtosekunden und elektrischen Feldstärken in der Größenordnung inneratomarer Felder durchzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die drei wichtigsten Prozesse im Bereich der Wechselwirkung von Atomen mit starken Laserfeldern untersucht: Im Fall der Above-threshold Ionisation (ATI) absorbiert ein Elektron aus dem Lichtfeld mehr Photonen, als zu seiner Ionisation notwendig sind. Die Überschussenergie kann mit einem Flugzeitspektrometer in Form der kinetischen Energie des Photoelektrons gemessen werden. Im ATI-Spektrum wird die Zahl der gemessenen Photoelektronen als Funktion ihrer Energie aufgetragen: Es ergibt sich eine Serie von Maxima im Abstand der Photonenenergie. Diese fallen mit steigender Photoelektronenenergie stark ab und entsprechen der Anzahl der jenseits der Ionisationsschwelle absorbierten Photonen. Die Form der Spektren gibt detaillierte Hinweise auf Einzelheiten des Ionisationsvorgangs. Zum Beispiel misst man für lineare Polarisation des eingestrahlten Lichts eine plateauartige Struktur, die durch einen Rückstreuprozess des Elektrons am Ionenrumpf hervorgerufen wird: Die Einhüllende des ATI-Spektrums folgt zunächst dem störungstheoretisch erwarteten starken Abfall für niedrige Elektronenenergien. Sie geht dann in das ATIPlateau über, bis sie am sogenannten Cutoff endgültig stark abfällt. Neben dem Ionisationsprozess beobachtet man bei der Wechselwirkung von Atomen mit intensiven Laserfeldern auch die Erzeugung hoher Harmonischer (high harmonic generation, HHG). Dabei emittieren die Atome Strahlung mit Photonenenergien, die einem Vielfachen der Energie der eingestrahlten Photonen entsprechen. Aufgrund der Inversionssymmetrie werden im Gas nur die Harmonischen ungerader Ordnung erzeugt. HHG kann durch Elektronen erklärt werden, die - statt wie bei ATI am Ionenrumpf zu streuen, rekombinieren und auf diese Weise die aus dem Laserfeld aufgenommene Energie in Form von hochenergetischer Strahlung abgeben. Auch im Spektrum der Harmonischen fand man ein Plateau, das sich bis in den Bereich weicher Röntgenstrahlung erstrecken kann. HHG erlaubt es damit, vergleichsweise effizient kohärente kurzwellige Strahlung zu erzeugen, die vielversprechende Anwendungen ermöglicht, zum Beispiel in der Biologie (Mikroskopie). Als dritte Möglichkeit kann das Elektron seine während des Ionisationsprozesses gewonnene Energie dazu benutzen, ein zweites Elektron aus dem Atom zu lösen. Dies wird nicht-sequentielle Doppelionisation (NSDI) genannt und beinhaltet hochinteressante korrelierte Ionisationsdynamik. Für die Experimente dieser Arbeit wurde ein hochrepetitives (100kHz) Lasersystem aufgebaut, das bei einer Pulsenergie von 6µJ und einer Pulsdauer von 50fs Spitzenintensitäten von 2 · 1014W/cm2 erzeugt. Für Messungen in diesem Intensitätsbereich wurde ein kombiniertes Elektronen- und Ionen-Flugzeitspektrometer sowie ein Vakuum-UVSpektrometer konstruiert. Ersteres wurde im Rahmen dieser Arbeit aufgebaut und erlaubt die gleichzeitige Messung von Elektronen und Ionen. Das XUV-Spektrometer wurde im Rahmen dieser Arbeit umgebaut und erstmals zur Messung hoher Harmonischer eingesetzt. Bei einer Repetitionsrate von 100kHz sind sehr detaillierte Analysen des Ionisationsprozesses möglich. So wurde eine vergleichende Studie zum Einfluß der Elliptizität des einfallenden Lichtfeldes auf die drei oben genannten Effekte durchgeführt. Elliptisch polarisiertes Licht beschleunigt das Elektron in zwei Raumrichtungen. Mit zunehmender Elliptizität verringert sich die Wahrscheinlichkeit, dass das Elektron während des Ionisationsprozesses zum Ionenrumpf zurückkehrt und damit auch die Effizienz von ATI, HHG und NSDI. Ihre Abhängigkeit von der Elliptizität wurde unter nahezu identischen experimentellen Bedingungen gemessen. Die Messung bestätigt die gemeinsame Wurzel der drei Prozesse. Der Einfluß der Polarisation auf die Bahn des Elektrons kann in einem einfachen klassischen Modell beschrieben werden, das die gemessene Abhängigkeit näherungsweise reproduziert. Ein Durchbruch in der theoretischen Beschreibung von Prozessen in starken Feldern gelang Lewenstein et. al. mit vom Feynman’schen Pfadintegral abgeleiteten Gleichungen. Der klassische Limes dieser Theorie ist das oben erwähnte klassische Modell. Beide erlauben eine intuitive Deutung der physikalischen Vorgänge mit Hilfe von räumlichen Trajektorien bzw. Quantentrajektorien, die das Elektron aufgrund der Wechselwirkung mit dem Feld nehmen kann. Im ATI-Experiment ist es uns dabei gelungen, unter bestimmten Bedingungen ein ATI-Spektrum in die Beiträge von einzelnen Paaren von Quantentrajektorien zu zerlegen. Führen mehrere Quantentrajektorien zum gleichen Endzustand des Elektrons, so können sie miteinander interferieren. Die Interferenz von Quantentrajektorien beeinflusst die Form der ATI-Spektren auf verschiedenste Art. Dies zeigt zum einen die Messung der Interferenz niederenergetischer Elektronen und rückgestreuter hochenergetischer Elektronen. Eine Voraussetzung für ihre Interferenz mit messbarem Kontrast ist eine vergleichbare Amplitude in den entsprechenden Termen der Wellenfunktion. Im Plateau-Bereich der Photoelektronenspektren ist dies für kleine elliptische Polarisation des Lichts erfüllt, da dann, wie schon erwähnt, der Rückstreuvorgang abgeschwächt wird. Die Interferenz der beiden Beiträge zeigt sich in der Winkelverteilung der Photoelektronen dadurch, dass sich das ATI-Plateau aufgrund der Interferenz aufspaltet. Ein zweites Beispiel für den Einfluss von Interferenzeffekten betrifft die Form der Einhüllenden eines ATI-Spektrums. Diese wird durch resonanzartig auftretende Effekte bei bestimmten Intensitäten dominiert. Die Dynamik in der Ausbildung des ATI-Plateaus wurde durch die detaillierte Messung der Intensitätsabhängigkeit der ATI-Spektren untersucht. Dazu wurde in kleinen Schritten die Intensität erhöht und die dazugehörigen Spektren aufgenommen. Die resonanzartigen Effekte treten gerade bei solchen Intensitäten auf, bei denen die Theorie eine große Anzahl von Quantentrajektorien braucht, um das Spektrum zu approximieren. Daraus kann man auf konstruktive Interferenz der beteiligten Trajektorien schließen. Ein völlig neuer Bereich der Wechselwirkung ultrakurzer Pulse mit Atomen eröffnet sich bei Pulslängen um oder kürzer als 5fs. Solche Pulse bestehen aus weniger als zwei optischen Zyklen (FWHM). Dadurch wird die Phase zwischen der Einhüllenden des Pulses und seiner Trägerwelle von Bedeutung (absolute Phase). Da alle Effekte, die durch intensive Laserfelder hervorgerufen werden, vom Verlauf des elektrischen Feldes des Laserpulses abhängen, hängen sie auch von der absoluten Phase ab. Dies ist von entscheidender Bedeutung für verschiedene moderne Forschungsbereiche wie die Erzeugung von Attosekundenpulsen, die kohärente Steuerung atomarer und molekularer Prozesse, die Laserplasmaphysik aber auch die Entwicklung optischer Frequenzstandards. An der Politecnico di Milano haben wir mit einem 5fs-Lasersystem erstmals Effekte der absoluten Phase nachweisen können. Dies wurde durch eine Korrelationsanalyse der in entgegengesetzte Raumrichtungen emittierten Photoelektronen erreicht.