Podcasts about lentiviren

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Ziel: 1)Etablierung einer immortalisierten hMSC-Zelllinie durch lentivirale hTERT-Transduktion. 2)Untersuchung der biologischen Effekt einer lentiviralen Transduktion von hTERT auf hMSCs. 3)Aufklärung des Transformationspotenyials von hTERT-transduzierten hMSCs. Material und Methoden: hMSCs wurden mit Lentiviren, die hTERT enthieten, transduziert. Konale hMSCs-hTERT wurden durch Isolation einzelner Zellen gewonnen. Die Expression von hTERT wurde mittels RT-PCR bestätigt. Die Zellproliferation wurde durch morphologische Beobachtung und Berechnung der “population doubling level”(PDL) und “population doubling time”(PDT) überwacht. Die Verhinderung der Seneszenz durch hTERT-Transduktion wurde durch Seneszenz-assoziierte β-gal-Färbung bestätigt. Dabei dienten nicht-transduziert hMSCs als Kontrollen. Der Stammzellcharakter von hMSC-hTERT wurde durch adipogene, chondrogene und osteogene Differenzierung überprüft. Zur Untersuchung der potenziellen tumorösen Transformation von lentiviral transduzierten hMSCs wurden Karyotypisierung und FISH-Analyse durchgeführt. Des Weiteren wurde der zeitliche Verlauf der Tumorsuppressor-Gene-Expression von RB1,TP53 und p21 untersucht, ein in vitro Softagar-Assay und in vivo Nacktmäusen Klonale und heterogene hMSCs-hTERT implantiert. Ergebnisse: hTERT wurde erfolgreich in hMSCs transduziert und “single-cell-picking”-Klone(SCP) konnten etabliert werden. In der RT-PCR wurde die hTERT-Expression bestätigt. Nicht-transduzierte hMSCs zeigten keine hTERT-Expression. Sowohl klonale, als auch heterogene hTERT-transduzierte hMSCs konnten über mehr als 500 Tage Kultiviert werden, während nicht-transduzierte hMSCs nach weniger als 250 Tagen seneszent wurden. Drei Phasen des Wachstums mit unterschiedlichen PDL und PDT konnten in hMSCs-hTERT beobachtet werden. Die Zellmorphologie der hMSCs-hTERT veränderte sich von einem gemischten Phänotyp in der “initialen Phase”(PDT 2,3 bis 5,5, PDL 20,7 bis 27,1) zu einem vermehrten Auftreten von flachen Zellen in der “Plateau-Phase” (PDT 9,2 bis 22,1, PDL 30,6 bis 48,2). Dies war ganz im zeitlichen Einklang mit dem Alterungsprozess von nicht transduzierten hMSCs. In der letzten und andauernden Phase zeigte sich eine hohe Anzahl von schnell wachsenden, kleinen und spindelförmigen Zellen (PDT von 2,1 bis 6,1, PDL 53,7 bis 105,6), welche aus einem Selbstselecktionierungsprozess in einer kontinuierlichen in-vitro Kultur hervorgegangen waren. Die erhaltene Differenzieungs-Kapazität der hTERT-transduzierten hMSCs wurde sowohl für klonale als auch heterogene hMSCs-hTERT durch eine positive Adipogenese-spezifische Oil-red-O-Färbung, Chondrogenese-spezifische Toluidinblau-Färbung und Osteogenese-spezifische von-Kossa-Färbung bestätigt. Zur Untersuchung einer potentiellen malignen Transformation der hMSCs-hTERT wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt, die keine Auffälligkeiten zeigte. Darüber hinaus konnte eine unveränderte RB1, TP53 und p21 Tumorsuppressor-Gen-Expression nachgewiesen werden. Als Hinweis auf eine erhaltene Kontaktinhibition zeigten sich im Softagar-Assay keine Kolonien. Nach subkutaner Implantation der Zellen im Nacktmaus-Modell zeigte sich histologisch in vivo keine Tumorformation. Fazit: Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass eine lentivirale Transduktion von hMSCs mit hTERT eine effiziente und relative sichere Methode zur Erzeugung immortalisierter hMSCs ist. Obwohl es notwedig ist die Differenzierungskapazität und onkogene Potenzial für einen noch längeren Zeitraum zu untersuchen, konnte nach mehr als 500 tage in Zellkultur nachgewiesen werden, dass klonal expandierte lentivital hTERT-transduzierte hMSCs eine viel versprechende Zelllinie für die Forschung, aber möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen zum Beispiel im Bereich “Tissue engineering” sein könnte.

Hintergrund Humane mesenchymale Stammzellen sind ein viel versprechendes Ziel für die ex vivo Gentherapie, und Lentiviren sind exzellente Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsfrequenzen mit langfristiger Genexpression erreichen. Dennoch könnte die Seneszenz von hMSCs die therapeutische Anwendung, infolge von zeitaufwendiger Zellselektion und Virus Titration, limitieren. Diese Arbeit beschreibt optimierte Protokolle für hoch effizienten ex vivo lentiviralen Gentransfer in hMSCs und eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu bestimmen. Methoden EGFP wurde als Markergen/-protein verwendet, um verschiedene lentivirale Expressionsvektoren herzustellen. Die Produktion von Lentiviren wurde mit verschiedenen Verpackungssystemen getestet. Der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde durch Polybrene und Blasticidinselektion erhöht. hMSCs von verschiedenen Spendern wurden mittels PCR und Western Blot analysiert. Regulierte Genexpression wurde durch Herstellung eines Tet-On selbstregulierten Expressionsvektors erreicht. Mit einem p24 ELISA-Test wurden übrig gebliebene virale Partikel im Zellkulturüberstand detektiert. Die Effizienz des lentiviralen Gentransfers wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet und mittels qRT-PCR und FACS-Analyse quantifiziert. Die lentiviralen Titer wurden mit qRT-PCR der exprimierten Transgene bestimmt. Die hMSC Differenzierung wurde histologisch untersucht. Ergebnisse Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten hoch effizienten Gentransfer in hMSCs bei der Verwendung von Polybrene. Die Blasticidinselektion hat den Prozentsatz der transgenen Zellen weiter erhöht unter Selektion von Zellen die mehrere Transgenkopien tragen. Die positiven Effekte von Polybrene und der Blasticidinselektion sind nicht von hMSCs eines speziellen Spenders abhängig. Präzise Regulation der Genexpression wurde durch Herstellung eines selbstregulierten Tet-On-Expressionssystems erreicht. Keine viralen Antigene wurden im Zellkulturüberstand nach aufeinander folgenden Medienwechseln detektiert, was auf die Abwesenheit von infektiösen Partikeln nach einigen Tagen hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein starker linearer Zusammenhang zwischen der Virusverdünnung und der Stärke der Transgenexpression mittels qPCR Analysen beobachtet, wodurch die Virustitration durch Quantifizierung der Transgenexpression ermöglicht wird. Abschließend wurde durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung gezeigt, dass transduzierte hMSCs ihren Stammzellcharakter beibehalten haben und dass die Transgenexpression durch die Differenzierung nicht beeinflusst wurde. Schlussfolgerungen Die Quantifizierung der Transgen-Kopienanzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer nach dem ex vivo Gentransfer in hMSCs zu bestimmen. Die in dieser Arbeit optimierte und charakterisierte Methode für die effiziente lentivirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen, in Verbindung mit regulierbarer Transgenexpression, ist ein sicheres, verlässliches und leistungsstarkes Verfahren und bildet eine aussichtsreiche Grundlage für zukünftige Gentherapie und Tissue Engineering Anwendungen in hMSCs.

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.