Podcasts about keimbahn

Die Genschere CRISPR Cas9 kann Schäden im Erbgut reparieren. Für die Medizinstudentin Karla wäre das die Rettung. Eine Behandlung ihrer Muskelkrankheit scheint in wenigen Jahren möglich.

Die Kraft deiner Ahnen Du erkennst deine übergeordnete Aufgabe aus deiner Ahnenlinie. Was willst du besser machen als deine Ahnen? Was ist das Göttliche, das durch genau dich auf diese Welt kommt? Wo schließt du den Kreis? Und wie profitierst du von der Kraft und den Erfahrungen deiner Ahnen? Du bist die Krone der Schöpfung, du erkennst die Lösung, die durch dich kommt. Hinweise, dass psychische Wunden vererbt werden, gibt es inzwischen auch aus der Biologie. So können starke Belastungen Veränderungen im Erbgut hervorrufen. Die nächste Generation ist dann anfälliger für Ängste und stressbedingte Erkrankungen. Der Fachbegriff heißt Epigenetik. Eine Ursache von erblichen Traumata ist ein epigenetischer Effekt: Dabei verändert sich nicht die Erbgutsequenz, sondern andere Faktoren rund um die DNA, die aber ebenfalls über die Keimbahn weitergegeben werden. Jede Woche sprechen Medium Kristina Sacken, Meditationslehrerin Michaela Aue und Moderatorin Susanne Brückner über alltägliche Herausforderungen und deren Lösung. Medium Kristina Sacken unterstützt Menschen ihre medialen Fähigkeiten zu entwickeln. Kristina ist Juristin, Politologin und Medium. Seit ihrer Kindheit ist sie hellsichtig, wurde international ausgebildet und hat schon hunderte Menschen medial beraten. 2013 hat sie die Kristina Sacken Akademie gegründet, in der sie ihr Wissen über Medialität weitergibt. www.kristinasacken.com Meditationslehrerin Michaela Aue praktiziert und unterrichtet seit mehr als 20 Jahren Yoga & Meditation und ist Host des Podcast — Die Kunst du selbst zu sein. In ihrer Arbeit begleitet sie Menschen auf der Reise zu sich selbst. Sei es mit ihrem online Meditationskurs THE art OF BEING YOU, der Menschen hilft Meditation als neue Gewohnheit in den Alltag zu integrieren. Oder in ihrer Ausbildung zum/r Meditationslehrer:In, durch die Teilnehmende eine neue Ebene ihrer spirituellen Entwicklung erfahren. www.michaelaaue.com

Krankheiten wie AIDS heilen, indem man das betreffende Gen einfach ausschaltet: CRISPR/Cas gilt als großer Hoffnungsträger der Forschung. Selbst gegen die Vermehrung des Coronavirus hat die Gen-Schere in der Zellkultur schon Erfolge vorzuweisen. Ihr großer Vorteil: Vereinfacht gesagt ahmt sie die Natur nach - gelenkte Evolution. Und der Protein-Bausatz ist nur wenige Klicks entfernt: Schon Studierende können das Instrument erproben, per Datenbank-Bestellung im Internet. Doch wie treffsicher ist die Gen-Schere bisher? Hat der Eingriff eines chinesischen Forschers in die Keimbahn von Zwillingen 2018 eine gefährliche Tür aufgestoßen? Wissenschaftsjournalistin Daniela Remus erklärt im Gespräch mit Host Lucie Kluth, warum Genome Editing sie so fasziniert, dass die Büchse der Pandora trotzdem eine richtige Assoziation ist - und weshalb die somatische Medizin mit CRISPR/Cas noch einen weiten Weg vor sich hat.

Krankheiten wie AIDS heilen, indem man das betreffende Gen einfach ausschaltet: CRISPR/Cas gilt als großer Hoffnungsträger der Forschung. Selbst gegen die Vermehrung des Coronavirus hat die Gen-Schere in der Zellkultur schon Erfolge vorzuweisen. Ihr großer Vorteil: Vereinfacht gesagt ahmt sie die Natur nach - gelenkte Evolution. Und der Protein-Bausatz ist nur wenige Klicks entfernt: Schon Studierende können das Instrument erproben, per Datenbank-Bestellung im Internet. Doch wie treffsicher ist die Gen-Schere bisher? Hat der Eingriff eines chinesischen Forschers in die Keimbahn von Zwillingen 2018 eine gefährliche Tür aufgestoßen? Wissenschaftsjournalistin Daniela Remus erklärt im Gespräch mit Host Lucie Kluth, warum Genome Editing sie so fasziniert, dass die Büchse der Pandora trotzdem eine richtige Assoziation ist - und weshalb die somatische Medizin mit CRISPR/Cas noch einen weiten Weg vor sich hat.

So stoppst DU Fake-News; 18.03.1931: Erster Elektro-Rasierer kommt auf den Markt; Was ist der Unterschied zwischen Wind und Zug?; Irre! - Lautsprecher aus Papier; "Blastoide" - Bringen die Quasi-Embryonen neue Forschungsmöglichkeiten?; Wie speichern wir heute und morgen grüne Energie?; Die Stubenfliege ist wirklich liebenswert. Echt jetzt!; Was ist Histamin-Intoleranz?; Warum das Phytoplankton im Meer zu kämpfen hat; Plogging: Joggen und Müll sammeln; Moderation: Marija Bakker.

Lulu und Nana heißen die Zwillinge, die 2018 als erste Menschen mit genetischer Manipulation auf die Welt kamen. Der chinesische Genetiker He Jiankui hatte sich über ethische Grenzen hinweggesetzt und die Keimbahn der beiden Kinder verändert. Als Konsequenz daraus sollte eine internationale Expertenkommission die Risiken solcher Eingriffe abschätzen. Die Vorsitzende des Deutschen Ethikrates, Alena Buyx, ordnet die jetzt vorgelegten Ergebnisse ein.

Zu unsere Jubiläumsfolge präsentieren wir Euch ein spannendes Gespräch über Biochemie. Aber zunächst zu unseren fließigen Podcastern. Jeanette ist nach der Nacht des Wissens wieder in Helsinki und mitten im Semester, Zettelabgaben, Vorlesungen und selber unterrichten stehen auf dem Plan. Zwischendurch hat sie trotzdem noch Zeit einen Science Slam zu organisieren. In Göttingen ist das Semester grade zu Ende gegangen und Christoph muss Klausuren schreiben und andere Klausuren korrigieren. Unser heutiges Interview hat Jeanette am 24. Januar 2019 im biochemischen Institut der Univesität zu Kiel aufgenommen. Wir befinden uns quasi direkt im Labor und sprechen über eine Krankheit, die Freia erforscht. Bei dieser Krakheit handelt es sich um eine genetische Veränderung, bei der ein Rezeptor an der Außenseite einer Zelle verändert ist. Dieser Rezeptor ist ein Protein, das aus vielen Aminosäuren besteht. Ist der Patient nun von dieser Krankheit befallen, ändert sich dieser Rezeptor um eine Aminosäure und ein Signal von vielen kann nicht weiter in die Zelle geleitet werden. Auswirkung dieser Krankheit ist, dass sich die Schädelform ändert. Freia hat diese Krankheit für ihre Bachelorarbeit zunächst im Reagenzglas untersucht. Inzwischen hat die Arbeitsgruppe "Designmäuse" bekommen, die genau diesen Gendefekt aufweisen. Die Mäuse werden mit der Methode CRISPR/Cas bearbeitet und tragen dann diesen gendefekt in ihrer Keimbahn, d.h. sie geben sie an ihre Nachfahren weiter. Die gelieferten Designmäuse mussten zunächst charaktierisiert werden und dann vermehrt. Mit den Nachkommen werden dann die Experimente gemacht. So untersucht man in einem Mini-Computertomographen die Schädelform der Mäuse, man untersucht das Blut aus dem Herzen und weitere Organe. Wir freuen uns, wenn Ihr uns in den sozialen Medien folgt. Viel Spaß beim Hören und bis zum nächsten Mal!

Die angesehene Zeitschrift "Science" hat ein biochemisches Verfahren zum Durchbruch des Jahres 2015 gewählt: CRISPR/Cas9. Es ermöglicht eine vergleichsweise einfache, schnelle und kostengünstige Veränderung von Genen. CRISPR/Cas9 verspricht, Medizin und Biotechnologie zu revolutionieren. Wie mit einer Schere lässt sich DNA gezielt an einer bestimmbaren Sequenz zerschneiden. Genabschnitte können entfernt, verändert, ausgeschaltet oder um neue Bausteine ergänzt werden. Es handelt sich um eine Art 'biologisches Textverarbeitungsprogramm', mit dem der Mensch künftig seine Existenz und die seiner Umwelt 'editieren' kann. Ein wahrhaft mächtiges Werkzeug. Sozusagen eine Fortsetzung der Evolution mit anderen Mitteln. Dass der Mensch an der Schwelle steht, die Evolution selbst in die Hand zu nehmen, anstatt ihr Spielball zu sein, schürt Hoffnung und gar Allmachtsphantasien bei den einen und Ängste bei vielen anderen. Immerhin hat das Verfahren nicht nur Auswirkungen auf die Lebewesen, sondern auf komplette Ökosysteme. Und im Falle des Menschen auf dessen Selbstverständnis, seine Werte und die sozialen Strukturen, in denen er lebt. Die Veränderung der menschlichen Keimbahn wird mit hoher Wahrscheinlichkeit auch in Zukunft sehr restriktiv gehandhabt werden, unter anderem deshalb, weil Veränderungen weitervererbt werden. Aber ein Tabu ist sie nicht mehr. In Großbritannien dürfen Wissenschaftler künftig das Erbgut menschlicher Embryonen gezielt verändern – wenn auch zunächst nur zu Forschungszwecken. Und chinesische Wissenschaftler haben bereits Genmanipulationen an Embryonen vorgenommen, um zu testen, ob sich eine genetisch bedingte Krankheit ausmerzen lässt, bei der zu wenig Hämoglobin, also der Farbstoff der roten Blutkörperchen, gebildet wird, ß-Thalassämie heißt sie. Von einer klinischen Anwendung ist das alles aber noch weit entfernt. Ängste gibt es viele: Sie reichen von der Gefahr des Missbrauchs durch eine sich selbst optimierende und ermächtigende Superelite bis hin zur Auslöschung der gesamten Menschheit durch 'Mutanten', die sich genetisch durchsetzen. Es ist durchaus sinnvoll, solche extremen Szenarien zu denken. Sie wirken aber auch unverhältnismäßig in einer Welt, in der jedes Jahr Millionen von Menschen an den Folgen des Alkohol- und Tabakkonsums oder durch Autounfälle sterben, weil sie eigenverantwortlich und relativ sorglos Risiken eingehen und eingehen dürfen. Verantwortung heißt genau das: Risiken bewusst und vernünftig einzugehen. Aber auch: Chancen zu nutzen. Und die sind immens und zahlreich. Stellen Sie sich die Zukunft vor, wenn CRISPR/Cas9 ausgereift ist: Zahlreiche genetische Erbkrankheiten sind ausgerottet Krebs und Aids sind heilbar, sogar verhinderbar Für den Menschen verträgliche Ersatzorgane können in Tieren gezüchtet werden Ertragreichere und robustere Pflanzen haben das Ernährungsproblem einer weiter gewachsenen Weltbevölkerung gelöst Der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft konnte dramatisch gesenkt oder gar gänzlich überflüssig werden Neue Enzyme haben die Biotreibstoff-Produktion revolutioniert Moskitos können Malaria und andere gefährliche Erreger nicht mehr übertragen Seit jeher ist es das Ziel des Menschen, sich und seine Lebensbedingungen zu verbessern. Dafür nutzen wir Wissenschaft und Technik und überschreiten dabei immer wieder Grenzen. Das ist in gewisser Weise auch eine Emanzipation von einer oft bedrohlichen Natur. Das kann man als menschlichen Übermut und einen nie enden wollenden Optimierungswahn bemängeln. Aber übersehen Sie bitte nicht, dass wir heute in einer weitaus besseren Welt leben als noch vor 100 Jahren. Eben dem Fortschritt sei Dank. Es ist nur schwer vorstellbar, wie beschwerlich und kurz unser Leben noch wäre, hätten wir frühere Chancen nicht genutzt. Mit CRISPR/Cas9 steht uns eine weitere Technologie zur Verfügung, die uns buchstäblich zu Entscheidungen zwingt. Sie zwingt uns dazu, souveräner Gestalter unserer Zukunft zu sein - und sei es durch die Entscheidung, diese Technologie explizit nur begrenzt oder gar nicht zu nutzen. Vielleicht entscheidet sich der Mensch aber auch, sie nicht nur im Kampf gegen Krankheiten, sondern auch als Enhancement-Technologie einzusetzen, um seine physischen und kognitiven Fähigkeiten zu verbessern und ein gesünderes und längeres Leben zu führen. Das sind unbändig starke Bedürfnisse, die zu befriedigen sich manche Leute heute schon viel Geld kosten lassen. Die, die es haben. Wäre es nicht besser, wenn diese Möglichkeiten praktisch jedem zur Verfügung stünden? Mit CRISPR/Cas9 und ähnlichen Verfahren können wir schicksalhaften Krankheiten ein Ende bereiten, unsere Felder pestizidfrei machen und vieles mehr. Allein schon diese Aussichten sind es wert, die Diskussion um Gentechnologien nicht hysterisch und dogmatisch, sondern besonnen und nutzenorientiert zu führen. Die besondere Herausforderung besteht darin, dass wir komplexe Systeme nie vollständig beherrschen können. Wenn wir es uns aber gänzlich verbieten, müssten wir nach dem gleichen Prinzip auch die meisten Medikamente verbieten. Und jetzt? Schauen Sie genau hin. Vielleicht arbeiten Sie in einer Branche, die noch nicht erkannt hat, dass und wie sie mit weißer, grüner oder roter Gentechnologie die Probleme ihrer Kunden besser lösen und ihre Wünsche besser erfüllen kann. Zu Wohle Ihrer Kunden und damit Ihres Unternehmens. Am Ende dürften – wie so oft – die Vorteile sehr willkommen und die Gefahren weitestmöglich beherrschbar sein.

Gene nach Wahl und Wunsch, bei Bakterien, Pflanzen Tieren, Menschen? Die menschliche Keimbahn gezielt verändern, Gene ausschalten, die krank machen? Warum nicht? Eine rasante Dynamik entwickelt sich in den Forschungslabors rund um den Globus, dank neuer molekularer Werkzeuge wie der Gen-Schere CRISPR/Cas 9 werden die Grenzen des Machbaren immer weiter verschoben. Aber in der Öffentlichkeit blieb es lange erstaunlich ruhig. Jetzt fordern Wissenschaftler, auch in Deutschland neu über Forschung an Embryonen zu diskutieren. In den USA wird schon nicht mehr über das Ob, sondern über das Wie und Wann von Eingriffen in die menschliche Keimbahn debattiert. Auch ethische Stellungnahmen haben eine Halbwertszeit, sagen manche Philosophen. Andere halten dagegen, wir sollten ethische Debatten nicht auf Auseinandersetzungen über Verfahren reduzieren, sondern neu darüber nachdenken, in was für einer Gesellschaft wir leben wollen.

Genomchirurgie, der gezielte Eingriff in unser Erbgut, ist mit der Entdeckung neuer Werkzeuge wie der Genschere CRISPR/Cas in greifbare Nähe gerückt. Bei einer Befruchtung im Reagenzglas könnte man theoretisch im Erbmaterial eines zukünftigen Kindes Korrekturen vornehmen, Veränderungen, die dann von Generation zu Generation weitergegeben würden. Entsprechende Experimente mit menschlichen Embryonen, die in Deutschland verboten wären, sind anderswo längst im Gange. Auch wenn die Forschung bisher nur im Labor stattfindet: für immer mehr Wissenschaftler scheint ein gezielt genetisch verändertes Baby zwar momentan noch nicht möglich, aber für die Zukunft keineswegs ausgeschlossen zu sein. Was wollen Forscherinnen und Forscher mit ihren Experimenten erreichen, wie weit dürfen sie gehen?

Scharf und gezielt wie mit einem Skalpell lassen sich mit der molekularen Gen-Schere Veränderungen im Erbgut vornehmen. Und dazu noch einfach und kostengünstig. Wir werfen einen Blick auf den Forschungsalltag mit der Gen-Schere an den Universitäten Frankfurt, Freiburg und Bonn. Und die beiden Erfinderinnen der Genschere, Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna erzählen, wie sie gemeinsam den Durchbruch erreicht haben und warum sie beide entschieden dagegen sind, dass ihr molekularbiologisches Skalpell auf die Keimbahn des Menschen angesetzt wird.

Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse tragen aus dem Blickwinkel der Evolutionsbiologie zu unserem Verständnis der Regulation von Genexpression bei. Ich verwende einen bestens bekannten Modellorganismus, die Fruchtfliege Drosophila melanogaster, nicht nur als Objekt der Beobachtung, sondern auch als ein genetisches Manipulationswerkzeug, und untersuche drei verschiedene Aspekte des Prozesses, durch den die in der DNA gespeicherte Information förmlich „entfesselt“ oder umgesetzt wird zu biologischem Sinn, letztlich also zu Form und Funktion. In Kapitel 1 zeige ich zunächst, dass eine Inaktivierung des X-Chromosomes (und somit Genregulation auf chromosomaler Ebene) in der männlichen Keimbahn von D. melanogaster stattfindet. Im Gegensatz zur X-Inaktivierung in weiblichen Säugetieren, wo dies in den somatischen Zellen als Mechanismus zur Dosiskompensation auftritt, ist diese Art der Inaktivierung auf die Spermatogenese beschränkt und wurde wahrscheinlich während der Genomevolution als eine Möglichkeit etabliert, schädliche Auswirkungen in Zusammenhang mit Sexualantagonismus zu umgehen. Durch P-Element-vermittelte Keimbahntransformation erhielt ich fast 50 unabhängige Insertionen eines testisspezifischen Reportergenkonstrukts und untersuchte die dazugehörigen Reportergenaktivitäten durch Messung der Enzymaktivität und durch quantitative RT-PCR. Autosomale Insertionen dieses Konstrukts zeigten das erwartete Muster hoher männchen- und testisspezifischer Expression. Insertionen auf dem X-Chromosom zeigten dagegen wenig bzw. gar keine Expression des Transgens. Da die X-chromosomalen Insertionen die euchromatischen Abschnitte des Chromosoms abdeckten (bestimmt durch inverse PCR), konnte eine systematische Bevorzugung bestimmter Regionen bei Insertionen, die ein Fehlen von Expression auf dem X-Chromosom hätte erklären können, ausgeschlossen werden. Der Effekt scheint eine globale Eigenschaft des X-Chromosomes zu sein. Lediglich die Testisspezifität des transgenen Konstrukts ist für das Erscheinen des Effekts erforderlich, was somit eine Selektionshypothese für die X-Inaktivierung erhärtet sowie einige Beobachtungen erklären könnte, die im Zusammenhang mit der Verteilung von im Männchen und Testis exprimierten Genen im Drosophila-Genom gemacht wurden. In Kapitel 2 untersuche ich dann mutmaßliche cis-regulatorische Sequenzen und ihr Vermögen, allelspezifische Genexpression zu steuern. Nachdem Microarray-Studien umfangreiche Variabilität im Primärmerkmal Genexpression in unterschiedlichsten Taxa aufgedeckt haben, ist eine naheliegende Frage, mit der sich Evolutionsbiologen konfrontiert sehen, die nach der dieser Variabilität zugrunde liegenden genetischen Quelle. Neben epigenetischen Mechanismen gibt es einen Disput darüber, ob regulatorische Sequenzen nahe des exprimierten Gens (cis-Faktoren) und anderswo im Genom kodierte Faktoren (trans-Faktoren) einen qualitativ und quantitativ unterschiedlichen Beitrag zur Variabilität der Genexpression liefern. Hierzu wählte ich ein Gen von D. melanogaster, das nachweislich konsistente Expressionsunterschiede zwischen afrikanischen und nicht-afrikanischen („kosmopolitischen“) Stämmen zeigt, und klonierte die entsprechenden stromaufwärts flankierend gelegenen Teile jeweils in ein bakterielles Reportergenkonstrukt, um – nach erfolgreicher Integration ins Fruchtfliegengenom – direkt die von ihnen gesteuerte Auswirkung auf die Genexpression zu vergleichen. Der beobachtete Effekt war klein, jedoch signifikant, und zeigte sich nur in transgenen Fliegen, die ein X-Chromosom des afrikanischen Ausgangsstammes besaßen. Dies legt den Schluss nahe, dass zusätzlich zu den cis-regulatorischen Faktoren auch noch trans-Faktoren (vor allem auf dem X-Chromosom) zu dem zwischen den Stämmen beobachteten Expressionsunterschied beitragen. Letztendlich untersuche ich in Kapitel 3 das Phänomen des Codon bias durch seinen Zusammenhang mit Genexpression. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes werden viele der proteinogenen Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert. Dies ermöglicht es, synonyme Codons in einer kodierenden Gensequenz auszutauschen, ohne dabei die Aminosäurensequenz des kodierten Polypeptids zu verändern. Ob dies Konsequenzen für die produzierte Proteinmenge hat (Translationseffizienz) ist Gegenstand dieses Kapitels. Ich verglich dabei die von zwei Allelen des Gens Alkoholdehydogenase (Adh) (von D. melanogaster) vermittelte Enzymaktivität direkt miteinander, welche sich in sieben Leucin-Codons unterschieden. Es ergab sich nahezu kein Unterschied in der ADH-Enzymaktivität, obwohl eines der Allele aus gänzlich optimalen Leucin-Codons bestand und das andere sieben suboptimale Leucin-Codons enthielt. Da Letzteres die Wildtypform von Adh war, legen die Ergebnisse den Schluss nahe, dass das Adh-Gen in seiner Leucin-Codonzusammensetzung (und vielleicht auch in seiner Codonzusammensetzung allgemein) bereits ausreichend optimiert ist. Weitere Versuche, die Zahl der optimalen Leucin-Codons zu erhöhen, können sogar einen Negativeffekt hinsichtlich der Enzymproduktion haben; dies möglicherweise aufgrund einer Sättigung des tRNA-Pools und/oder der Konsequenzen veränderter mRNA-Sekundärstrukturen.

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.

Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde zum ersten Mal die Keimbahn eines Käfers erfolgreich genetisch transformiert. Der von uns zu diesem Zweck in Zusammenarbeit mit Ernst Wimmer entwickelte Transformationsmarker 3xP3-EGFP hat inzwischen sein Potential als spezies-unabhängiges Markergen auch in weiteren Invertebraten-Spezies unter Beweis gestellt und damit das Spektrum transformierbarer Taxa beträchtlich erweitert. In Tribolium konnten Transformationsereignisse mit 3xP3-EGFP für drei verschiedene Transposons - Hermes, Minos und piggyBac - erzielt werden. Die Effizienz betrug dabei 1,4% (Hermes), 11,4% (Minos) bzw. 56% (piggyBac) der fertilen G0 und gehört damit zu den höchsten Werten, die in der Literatur für Insekten berichtet wurden. Bei Minos konnte die Effizienz durch die Verwendung von Transposase mRNA statt einem DNA Helper-Plasmid weiter auf 32,4% gesteigert werden. Für piggyBac und Minos wurde ferner in Zusammenarbeit mit anderen Labors gezeigt, daß es sich bei den meisten Transposoninsertionen um unabhängige Einzelintegrationen handelt, die auf verschiedene Chromosomen verteilt sind und stabil weitervererbt werden. Die Größe zusätzlich transferierter Fremd-DNA kann dabei bei piggyBac mindestens bis zu 9,5 kb betragen. Schließlich konnte noch ein piggyBac Element durch Helperinjektion mit einer Rate von 28,1% remobilisiert werden. Zusammen mit der Anfälligkeit für enhancer trap Effekte können daher mit diesem System alle relevanten Transposon-basierenden Techniken zur funktionellen Genomanalyse angewandt werden. Als erste praktische Anwendung wurden D. melanogaster Sequenzen für anteriore und posteriore mRNA-Lokalisierung (bicoid-3’UTR und oskar-3’UTR), sowie ein bicoid-abhängiger Minimalpromotor in Tribolium eingeführt. Allerdings konnten durch diese Ansätze keine Komponenten oder Mechanismen eines ggf. konservierten maternalen Systems nachgewiesen werden. Ein Konstrukt mit 5,2 kb der upstream Sequenzen von Tc’hunchback mit lacZ als Reportergen war hingegen in der Lage, das endogene hunchback-Muster größtenteils nachzubilden. Das frühere Ergebnis von Christian Wolff mit Tc’hunchback in Drosophila, wonach dieses Fragment alle wesentlichen regulatorischen Elemente enthält, konnte daher in transgenen Käfern bestätigt werden. Zusätzlich zu dem als sehr riskant eingestuften Transformations-Projekt wurde parallel ein weiteres Projekt durchgeführt, die Analyse der homöotischen Mutanten wurm und überlänge. In beiden Mutanten ist vor allem die Identität der posterioren Segmente ab A9 verändert. In wurm sind die Segmente A9-A11 nach A8 transformiert und die telsonalen Anhänge Urogomphi und Pygopodien fehlen. In überlänge ist nur A9 wie A8 ausgebildet und demzufolge nicht mit dem Telson fusioniert. Es fehlen nur die Urogomphi. überlänge bildet zusätzlich ein ektopisches Stigma im ersten thorakalen Segment. Es wurde gezeigt, daß es sich bei den betroffenen Genen um zwei verschiedene Loci handelt, die beide nicht im homöotischen Komplex liegen. Obwohl der Phänotyp von wurm weitgehend der RNAi-Phänokopie von Abdominal-B entspricht, konnte also keiner dieser beiden Loci einem bekannten Hox-Gen zugeordnet werden. Als mögliches Kandidatengen für diese Loci wurde daher das Tribolium-Homolog des regionsspezifischen homöotischen Gens spalt kloniert. Die Expression von spalt entspricht weitgehend der von Dm’spalt, mit einer anterioren und einer posterioren Domäne, einer dorsalen Expression an den seitlichen Rändern des Keimstreifs, sowie einem komplexen Muster im Nervensystem. Mit Hilfe der kürzlich entwickelten Technik der parentalen RNAi wurde die Funktion dieses Gens untersucht. In sal–– Phänokopien finden sich, wie in Drosophila, anteriore und posteriore Veränderungen von Segmentidentitäten. So wird das abdominale Segment A9 in Richtung anteriore abdominale Segmente transformiert. Dadurch tritt ein zusätzliches Stigma auf und die Pygopodien gehen verloren, das Segment fusioniert aber weiterhin mit dem Telson. Im Gegensatz zu Drosophila wird aber anterior nicht das Labium verändert, sondern die Identität der Maxille wird partiell in Richtung Mandibel transformiert: statt dem Enditen der Maxille wird ein mandibel-ähnlicher Zahn gebildet. Damit kommt offenbar auch spalt nicht als Locus in Frage, der in wurm oder überlänge seine Funktion verloren hat. Möglicherweise spielen diese beiden Loci eine Rolle als den HOX-Genen übergeordnete regulatorische Gene, oder als Co-Faktor von Abd-B. Damit sind wurm und überlänge als interessante (und aus Drosophila nicht bekannte) Spieler im homöotischen System der Insekten identifiziert, was weitere Untersuchungen als sehr lohnend erscheinen läßt. Vor allem aber hat dieses Teilprojekt die Evolution des spalt-Gens erhellt, das in weniger abgeleiteten Insekten offenbar eine essentielle Rolle bei der Spezifizierung von Mandibel versus Maxille spielt. Diese Funktion ist in Drosophila vermutlich im Zuge der Reduktion der Mandibel verloren gegangen.

Das Gen des Selenoproteins PHGPx war in der Arbeitsgruppe im Verlaufe einer Expressionsklonierung als antiapoptotisches Gen für Burkitt-Lymphom-Zellen kloniert worden. Die Komplexität der kotranslationalen Inkorporation von Selenocystein, welches bei Selenoenzymen Teil des reaktiven Zentrums ist, limitiert die Überexpression und erschwert die funktionelle Analyse der Selenoproteine sowohl in vitro als auch in vivo. Die PHGPx und das ebenfalls Selenocystein-abhängige mitochondriale Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System sind bei der Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die in der mitochondrialen Atmungskette erzeugt werden. Im Gegensatz zur PHGPx vermittelt die Thioredoxin- Reduktase ihre Schutzfunktion vor oxidativem Stress über Thioredoxin-abhängige Peroxidasen, die sogenannten Peroxiredoxine. Aufgrund einer möglichen Redundanz beider Systeme sollten beide Gene in Mäusen gezielt zerstört und bei Bedarf doppel-knock-out-Tiere erzeugt werden. Da das Fehlen der funktionellen, mitochondrialen Thioredoxin-Reduktase möglicherweise nicht mit dem Leben vereinbar ist, wurden Mäuse unter Verwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems etabliert, bei welchen das Gen zunächst aktiv ist. Die Inaktivierung der Thioredoxin-Reduktase 3 erfolgte durch Einkreuzen von transgenen Mäusen, die die Cre-Rekombinase in allen Geweben exprimieren. Die aus dieser Verpaarung abstammenden, heterozygoten knock-out-Mäuse zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp. Erste Ergebnisse zeigen, dass homozygote TR3 knock-out-Mäuse wahrscheinlich embryonal oder perinatal letal sind. Bei der Inaktivierung des PHGPx-Gens in Mäusen wurden zwei Strategien verfolgt. Die lacZ knock-in-Strategie sollte ermöglichen, die Gewebeexpression der PHGPx zu studieren. Die konditionale knock-out-Strategie wurde parallel verfolgt, weil zu Beginn der Arbeit nicht abzusehen war, ob homozygote PHGPx knock-out-Mäuse lebensfähig sind oder ob Probleme mit der männlichen Fertilität zu erwarten sind. Schon lange war bekannt, dass die PHGPx im Hoden hoch exprimiert ist. Wie sich dann im Laufe dieser Arbeit herausstellte, handelte es sich bei dem konditionalen PHGPx knock-out ebenfalls um einen direkten knock-out. Durch die beabsichtigte konditionale knock-out-Strategie wurde ein Spermienkern-spezifisches, alternatives Exon des PHGPx-Gens zerstört. Diese neue Form der PHGPx wurde kloniert, das Hoden-spezifische Expressionsmuster und die Kernlokalisation des alternativenExons durch GFP-Fusionsproteine gezeigt. Geleitet von den in dieser Arbeit und von Ursini et al. (1999) beschriebenen neuen Funktionen der PHGPx in der Spermatogenese und den vergeblichen Versuchen, das veränderte PHGPx-Allel in Mäusen in die Keimbahn zu bekommen, wurden die Hoden und Spermien von den PHGPx- Chimären analysiert. Die Analyse der Chimären zeigte einen Phänotyp der partiellen Hodenatrophie und schweren Missbildungen der Spermien, der dem von Selendefizienten Nagetieren sehr ähnlich ist. Die bei diesen Chimären beobachtete Haploinsuffizienz führte zu der Entscheidung, die konditionale knock-out-Strategie für PHGPx zu ändern. Letztendlich gelang es, mit der neuen konditionalen knock-out- Strategie Keimbahntransmission zu erhalten. Dadurch wurde nicht nur das gesteckte Ziel, ein Maus knock-out-Modell für die PHGPx zu etablieren, erreicht, sondern es wurden viele zusätzlich wichtige neue Erkenntnisse über die Struktur und Funktion der PHGPx in der Spermienreifung gewonnen. Die Cre-vermittelte Inaktivierung des konditionalen PHGPx-Allels wird in Kürze erwartet.