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Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Expression des astrozytenspezifischen Enzyms Glutaminsynthetase in Ergänzung zum gliaspezifischen Marker Repo, um Gliazellen, die mit der embryonalen Entwicklung des Zentralkomplexes in Schistocerca gregaria assoziiert sind, zellulär und molekular zu charakterisieren. Der Zentralkomplex ist ein modulares System neuropiler Strukturen im Mittelhirn aller Insekten, und ist in vielen Verhaltensvorgängen wie Laufen, Fliegen, Stridulation und Ernährung involviert. In der Heuschrecke entwickeln sich die Neuropile des Zentralkomplexes im Laufe der Embryogenese und sind zum Zeitpunkt des Schlüpfens funktionsfähig. Trotz großer Kenntnisse neuronaler Aspekte über die Entwicklung des Zentralkomplexes verbleibt die Funktion der Gliazellen unklar. In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster des astrozytenspezifischen Enzyms Glutaminsynthetase (GS) und des gliaspezifischen Homöobox Gens reversed polarity (repo) in Kombination mit der negativen Expression des neuron-spezifischen Markers Meerrettich Peroxidase (HRP) zur Identifizierung glialer Zellen benutzt. Doppelfärbungen zeigen, dass alle GS-positiven Zellen, die mit dem Zentralkomplex assoziiert sind, gleichzeitig Repo-positiv sind. Zum ersten Mal konnte ich durch diese Kombination nicht nur Zellkörper, sondern auch Projektionen (Gliapodien) der Gliazellen sichtbar machen. Während der Embryogenese, also noch vor der Entwicklung des Zentralkomplexes, formen Gliazellen eine zusammenhängende Population, die aus der Pars intercerebralis in die Region der Faserbündel einwandert. Anschließend verteilen sich die Gliazellen neu und umhüllen jedes der einzelnen Module des Zentralkomplexes. Innerhalb der einzelnen Neuropile des Zentralkomplexes sind keine glialen Zellkörper zu finden. Rekonstruktionen einzelner Zellen zeigen Populationen von Gliazellen, die ausgedehnte umhüllende Projektionen um die Neuropile des Zentralkomplexes, wie den Zentralkörper, senden, während eine andere Population von Gliazellen säulenartige Verzweigungen in den Zentralkörper hinein projiziert. Solche Verzweigungen in den Modulen des Zentralkomplexes sind erst nach Fertigstellung der Neuroarchitektur zu erkennen. Daher kann man annehmen, dass diese Verzweigungen auf ein zuvor entstandenes Gerüst von Neuronen oder Tracheen projizieren. Höchstwahrscheinlich sind diese Gliaprojektionen in die Transmitterregulation innerhalb des Neuropils involviert. Da Gliazellen weitreichende Projektionen (Gliapodien) in und um die Mittelhirnneuropile senden, wurden in gefrorenen Hirnschnitten intrazelluläre Injektionen durchgeführt um zu erforschen, ob diese Gliazellen ein zelluläres Netzwerk via Zellkopplung im Verlauf der Embryogenese bilden. Färbungen individueller Zellen, die an vier unterschiedlichen Injektionsstellen um den Zentralkörper lokalisiert sind, zeigen eine Population gekoppelter Zellen, deren Anzahl und räumliche Verteilung stereotypisch für jeden der Injektionspunkte ist. Darüber hinaus sind sie sowohl bei 70%igem wie auch bei einem embryonalen Entwicklungsstand von 100% miteinander vergleichbar. Anschließende immunhistochemische Experimente bestätigen, dass es sich bei den gekoppelten Zellen um astrozytenähnliche Gliazellen handelt. Durch Hinzufügen von n-Heptanol in das Puffermedium wurde die Zellkopplung verhindert. Da die Zellkopplung auch ohne direkten intersomalen Kontakt auftritt, könnten die erheblichen Verzweigungen der Gliapodien, die sich im Laufe der Embryogenese ausbreiten, involviert sein. Durch die Datenerhebung aller Injektionspunkte kann darauf geschlossen werden, dass die Gliazellen, welche den Zentralkörper umrunden, ein Netzwerk gekoppelter Gliazellen bilden, das als Positionierungssystem der sich entwickelnden Neuropile des Zentralkomplexes dient.

In der vorliegenden Arbeit wurden die Grundlagen für die Zwei-Photonen-Endomikroskopie untersucht. Die Herausforderung liegt in der Miniaturisierung der Technik der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um auch endoskopisch in vivo hochauflösende Bilder von Gewebestrukturen und Zellen zu erhalten. Im Gegensatz zur Gewebeentnahme bei einer Biopsie ist dieses optische Verfahren minimal-invasiv. Damit ist eine Vorab Untersuchung des Gewebes möglich, die die Diagnostik unteranderem von bösartigen Gewebestrukturen präzisieren könnte. Die konfokale Endoskopie bietet bereits mit einem vergleichbaren Verfahren die Möglichkeit einer optischen Biopsie an der Oberfläche, z.B. an verschiedenen Schleimhäuten. Aufgrund der Gewebestreuung ist die Eindringtiefe des Lichts dabei aber auf wenige Mikrometer begrenzt. Diese Einschränkung könnte durch die bereits in der Zwei-Photonen-Mikroskopie gezeigte größere optische Eindringtiefe durch die Zwei-Photonen-Endomikroskopie verbessert werden. In dieser Arbeit wurde ein Femtosekundenlaser durch Glasfasern geleitet und am distalen Ende mit Hilfe einer Mikrooptik fokussiert. Dazu wurde ein Aufbau basierend auf Faserbündeln gewählt. Die einzelnen Faserkerne des Glasfaserbündels wurden mit einem Galvanometer-Scanner abgerastert und die dazugehörige detektierte Fluoreszenz punktweise zu einem Bild zusammengesetzt. Zur Kompensation der zeitlichen Verbreiterung der Pulse wurde ein Gitterkompressor aufgebaut. Mit diesem Aufbau wurden Zwei-Photonen-Fluoreszenz Aufnahmen von fluoreszenzstarken Proben durch ein Faserbündel ermöglicht. Diese Arbeit zeigt die Machbarkeit der Zwei-Photonen-Endoskopie und zeigt Möglichkeiten zur Optimierung, um zukünftig auch einen klinischen Einsatz zu ermöglichen. Mit der verwendeten Mikrooptik wurde eine zelluläre Auflösung von (3,5 ± 0,3) μm lateral und (5,3 ± 0,1) μm axial erreicht. Durch die Verwendung eines Referenzsystem aus Mikroskopobjektiven im Austausch der Mikrooptik konnte gezeigt werden, dass vor allem die laterale Auflösung noch verbessert werden konnte. Entscheidend ist hierfür eine hohe distale numerische Apertur. Der zukünftige Einsatz von verbesserten Mikrooptiken kann somit die Auflösung noch erhöhen. Aktuelle Forschungsergebnisse legen nahe, dass diese zukünftig auch kommerziell erhältlich sein könnten. Zusätzlich wurde eine variable Fokussiereinheit auf Basis eines Drahts aus einer Formgedächtnislegierung (Nitinol) realisiert. Damit konnte der Abstand zwischen Mikrooptik und Gewebeoberfläche verstellt werden. Durch Applikation eines maximalen Stromes bis zu 385mA kontrahiert der Nitinoldraht um ca. 1,8%. Ab dem minimalen Aktivierungsstrom von 330 mA konnte ein linearer Zusammenhang zwischen der Stromstärke und der Verschiebung beobachtet werden. Eine Änderung der Stromstärke in Schritten von 16–12 mA. ermöglicht eine Verschiebung von 20–10 μm. Eine Herausforderung ist die Erzeugung und Detektion der Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe zur Erzeugung von aussagekräftigen Zwei-Photonen-Bildern. Die Leistungsverluste der Laserenergie im Anregungsweg und die Verluste des Fluoreszenzsignals im Detektionsweg müssen hierfür möglichst gering gehalten werden. Die größten Verluste im Anregungsweg gibt es durch den Gitterkompressor, durch die Fasereinkopplung und durch die Mikrooptik. Trotzdem ist die hier erreichte Gesamttransmission von 18% (λ0 = 800 nm) ohne Gitterkompressor vergleichbar mit der erster Zwei-Photonen-Mikroskope. Durch Optimierung einzelner Komponenten, vor allem des Gitterkompressors und der Mikrooptik, ist zukünftig eine bessere Transmission möglich. Die Erzeugung von Zwei-Photonen-Fluoreszenzsignalen wird auch durch die Pulsverbreiterung innerhalb des Faserbündels verringert. Sowohl lineare als auch nichtlineare Effekte verbreitern spektral und zeitlich die Pulse. Die Untersuchung dieser Effekte konnte zeigen, dass mit Hilfe eines Gitterkompressors die zeitliche Pulsdauer am Faserausgang bis auf ca. 10 fs wiederhergestellt werden konnte und damit die Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung verbessert werden konnte. Trotzdem konnten bereits bei den hier verwendeten Leistungen (5–65 mW) auch nichtlineare Effekte beobachtet werden. Dazu kommt, dass bei höheren Laserintensitäten keine Transmission mehr möglich ist und die Eigenfluoreszenz der einzelnen Fasern des Faserbündels die Fluoreszenzsignale aus dem Gewebe überlagert. Zur Beseitigung der hier gezeigten Limitierungen durch die Mikrooptik und durch das Faserbündel sind weitere Optimierungen nötig um den Einsatz eines Zwei-Photonen-Endoskops in vivo zu ermöglichen. Durch den nichtlinearen Zusammenhang zwischen der Photonenintensität und der Fluoreszenzanregung sind diese Limitierungen gravierender als bei einer normalen Fluoreszenzanregung. Eine Reduzierung der Spitzenintensitäten der Laserpulse bei einem gleichzeitigen Erhöhen der Laserrepetitionsrate könnte zukünftig die nichtlinearen Effekte reduzieren und die effektive Laserleistung am Faserausgang erhöhen.

In der Einleitung wird die pathologische Anatomie und Physiologie der Speiseröhrenachalasie nach den bis heute vorliegenden Untersuchungsbefunden wiedergegeben. Der derzeitige Stand des histologischen Aufbaus der normalen Speiseröhrenwand wird beschrieben. Nach einer ausführlichen Darlegung der bereits in der Literatur vorhandenen mikroskopischen und submikroskopischen Untersuchungsergebnisse der Speiseröhrenwand bei der Achalasie wird an Hand von 6 eigenen Fällen pathohistologisch die Art der qualitativen und quantitativen Veränderungen des intramuralen Nervensystems der Speiseröhre insbesondere des Speiseröhrenabschnitts unterhalb der Dilatation in Verbindung mit den Veränderungen der übrigen Strukturelemente der Speiseröhrenwand in diesem Bereich geprüft und beschrieben. Diese Untersuchungen an Gewebsstücken aus dem Übergangsbereich Oesophagus - Magen führten zu folgendem Ergebnis: Die Mukosa aus dem Übergangsbereich Oesophagus - Magen eines Achalasiefalles bietet keinen Anhalt für ausgeprägte entzündliche Veränderungen. Die Längs- und Ringmuskelschicht der Tunica muscularis im Übergangsbereich Oesophagus - Magen weist in allen 6 Fällen eine deutliche Hypertrophie,leichte Dissoziation der Muskelfasern und Vermehrung des Bindegewebes zwischen denselben auf. In 2 von 6 Fällen finden sich kleine ovale bis runde Infiltrate polymorphkerniger Leukozyten in den Muskelfaser-bündeln. Bei einigen Fällen sind zwischen den Muskelfaser-bündelchen vereinzelt Erythrozyteninfiltrate zu beobachten. Im Stratum intermusculare der Tunica muscularis lassen sich teils oedematöse Dissoziation, teils Vermehrung des Bindegewebes oder Sklerose in allen Fällen nachweisen. 2 der 6 Fälle zeigen um die Gefässe sowie diffus im Bindegewebe verstreut Ansammlungen polymorphkerniger Leukozyten. In einem Teil der Fälle sieht man eine vermehrte Vascularisation des intermuskulären Bindegewebes und Verdickung der Gefäßwände. Gelegentlich kann man auch Erythrozyteninfiltrate nachweisen, die wie jene im Bereich der Tunica muscularis sicher bei der Praeparatexcision entstanden sind. In einigen Fällen sind vereinzelt leicht gequollene Achsenyzlinderbruchstuecke eingestreut. Umgeben von diesen Bindegewebsverhältnissen besteht bei den meisten Ganglionanschnitten mehr oder weniger deutliche Kern- bzw. Zellzunahme pro Flächeneinheit, die zum größten Teil auf das Auftreten und die Dichte von Zellen mit spindelförmigen, längsovalen, runden und polymorphen Kernanschnitten und zum geringsten Teil auf Rundzellinfiltrate zurückzuführen ist. Die Zunahme der Zellen mit spindelförmigen, längsovalen, runden und polymorphen Kernen pro Flächeneinheit der im Schnitt getroffenen Ganglien trägt proliferativen Charakter. Die Ganglionanschnitte zeigen teilweise das Bild der Vernarbung, in einigen Fällen das Bild der Dissoziation. Nur ein Teil der im Schnitt getroffenen Ganglien enthält Ganglienzellen,sie können sogar vollkommen fehlen. Auch in Bezug auf den ganglienzellhaltigen Ganglionanschnitt lässt sich eine Verminderung in der Anzahl der Ganglienzellen feststellen. Die Ganglienzellen zeigen teils normales Aussehen, teils pathologische Veränderungen im Sinne feinkörniger oder grobkörniger Zellschwellung mit ganz vereinzelter Hauptdendritenschwellung oder im Sinne einer Kolliquationsnekrose. Ferner lassen sich an den Stellen zugrunde gegangener Nervenzellen Hüllzellknötchen nachweisen. Gelegentlich findet man in den Ganglionanschnitten neuromartige Proliferation praeganglionärer Nervenfasern. In den Anschnitten primärer extraganglionärer Faserstränge treten vorwiegend Zellen mit spindelförmigen und polymorphen Kernen auf. Bei einzelnen primären Faserbündeln kann man eine Dissoziation oder Schwellung derselben beobachten. In einzelnen Fällen besteht körniger oder vakuoliger Zerfall der in die Remak'schen Fasern eingeschmiegten Achsenzylinder. Bei einem Fall last sich eine Infiltration polymorphkerniger Leukozyten innerhalb des Anschnitts eines primären Faserstrangs nachweisen. Ferner wird an 4 Kaninchen experimentell die Frage geprüft, ob durch die therapeutische Dehnung der unteren Speiseröhre und der Kardia Zerreißungen der Muskelwand und damit Veränderungen an ihren nervösen Elementen entstehen können, welche möglicherweise das histologische Untersuchungsergebnis beeinflussen. Dabeihaben die histologischen Untersuchungen der Praeparate aus dem untersten Oesophagus und dem Übergangsbereich Oesophagus - Magen vor und nach der Dehnungsbehandlung bei Kaninchen folgendes ergeben; Das durch experimentelle Dehnung erzeugte histologische Bild gleicht doch in keinem Fall den pathohistologischen Befunden von nicht gedehnten Frühfällen der Achalasie und von Achalasiefällen bei denen das Praeparat erst nach Dehnungsbehandlung bei einer später durchgeführten Operation entnommen wurde. Es ist daher anzunehmen, dass eine vorausgegangene therapeutische Dehnung des untersten Oesophagus und des Übergangsbereichs Oesophagus - Magenbei der Achalasie das pathohistologische Geschehen nur geringfügig beeinflussen wird. Aus den in der Literatur vorliegenden und eigenen histologischen Befunden,die in den einzelnen Wandschichten und Wandabschnitten der an Achalasie erkrankten Speiseröhre erhoben worden sind, lässt sich das folgende pathohistologische Gesamtbild ableiten: In der Tunica mucosa, Tunica submucosa, Tunica muscularis und besonders im Stratum intermusculare sind bei der Achalasie von den ersten Krankheitstagen an entzündliche Prozesse nachzuweisen, denen Veränderungen und Zerstörungen einzelner Gewebselemente folgen. Es werden einerseits das Muskelgewebe und das interstitielle Bindegewebe, andererseits die Nervenstrukturen der Oesophaguswand betroffen. Als Endzustand findet man eine ausgesprochene Sklerose oder wenigstens eine Vermehrung des Bindegewebes in der Submukosa, zwischen den Muskelbündeln, den einzelnen Muskelzellen und im Stratum intermusculare. Ferner wird Hypertrophie, Atrophie, hyaline Degeneration, Nekrose oder Verkalkung der Muskelfasern beobachtet. Im submikroskopischen Bild bestehen nur mehr restliche Kontakte zwischen den einzelnen glatten Muskelzellen durch Protoplasmabrücken und Membrankontakte. Zudem kommt es zu ausgedehnter Vakuolisierung des Zytoplasmas glatter Muskelzellen. Im Bereich der Ganglien kommt es zu degenerativen Veränderungen an den Ganglienzellen (Zellschwellung, Hauptdendriten-schwellung, Kolliquationsnekrose), wobei die Veränderungen bis zum restlosen Ausfall der Ganglienzellen (Hüllzellknötchenbildung) reichen können. Eine Neuropilemstruktur ist in letzterem Falle innerhalb des Ganglion nicht mehr nachweisbar. Sie wird durch Narbengewebe in Form von proliferierenden Zellen mit spindelförmigen, ovalen,runden und polymorphen Kernen ersetzt. Vereinzelt kann man in den Ganglien neuromartige Proliferation präganglionärer Nervenfasern erkennen. Die primären extraganglionären Faserstränge zeigen gelegentlich Dissoziation oder Schwellung und in einzelnen Fällen körnigen und vakuoligen Zerfall der Nervenfasern. Für die Megaoesophagusfälle im Rahmen der Chagaskrankheit kann die Ätiologie der pathohistologischen Veränderungen als geklärt gelten. Die entzündlichen Prozesse und die Plexuszerstörung im Bereich der ganzen Speiseröhrenwand lassen sich bei der Chagaskrankheit auf das Neurotoxin bzw. die toxischen Zerfallsprodukte des Trypanosoma cruzi zurückführen. Bei den Megaoesophagus- bzw. Achalasiefällen, die nicht mit einer Chagaserkrankung in Verbindung gebracht werden können und bei denen noch keine Toxine anderer Krankheitserreger oder andere Ursachen für die pathohistologischen Veränder-ungen des Plexus und anderer Elemente der Speiseröhrenwand ermittelt wurden, bleibt die Erstursache weiterhin unbekannt.