Podcasts about fluoreszenz mikroskopie

Was wäre die Wissenschaft ohne Mikroskope? Durch die Fluoreszenz-Mikroskopie hat eine neue Ära der Forschung begonnen. Über dunkle Keller, Donuts und einen Nobelpreisträger, der die Grenzen des Sichtbaren immer weiter verschiebt. Hier entlang geht's zu den Links unserer Werbepartner: https://detektor.fm/werbepartner/spektrum-der-wissenschaft (00:00:00) Begrüßung (00:01:02) Forschung am Max-Planck-Institut Heidelberg (00:01:41) Funktionsweise Fluoreszenzmikroskopie (00:02:57) Natürliche Grenzen von Fluoreszenzmikroskopie (00:04:02) Wozu braucht es noch bessere Mikroskope? (00:06:01) Nobelpreisträger Stefan Hell und die STED- Mikroskopie (00:10:16) Kombination des STED-Verfahren mit anderen Verfahren (00:11:44) Aktuelle Forschung von Stefan Hell zu Proteinbewegungen (00:13:53) Entwicklungsstufe der aktuellen Forschung (00:14:57) Verfeinerung und Präzisierung des Verfahrens >> Artikel zum Nachlesen: https://detektor.fm/wissen/spektrum-podcast-fluoreszenz-mikroskopie

Was wäre die Wissenschaft ohne Mikroskope? Durch die Fluoreszenz-Mikroskopie hat eine neue Ära der Forschung begonnen. Über dunkle Keller, Donuts und einen Nobelpreisträger, der die Grenzen des Sichtbaren immer weiter verschiebt. Hier entlang geht's zu den Links unserer Werbepartner: https://detektor.fm/werbepartner/spektrum-der-wissenschaft (00:00:00) Begrüßung (00:01:02) Forschung am Max-Planck-Institut Heidelberg (00:01:41) Funktionsweise Fluoreszenzmikroskopie (00:02:57) Natürliche Grenzen von Fluoreszenzmikroskopie (00:04:02) Wozu braucht es noch bessere Mikroskope? (00:06:01) Nobelpreisträger Stefan Hell und die STED- Mikroskopie (00:10:16) Kombination des STED-Verfahren mit anderen Verfahren (00:11:44) Aktuelle Forschung von Stefan Hell zu Proteinbewegungen (00:13:53) Entwicklungsstufe der aktuellen Forschung (00:14:57) Verfeinerung und Präzisierung des Verfahrens >> Artikel zum Nachlesen: https://detektor.fm/wissen/spektrum-podcast-fluoreszenz-mikroskopie

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Einer lebenden Zelle bei der Arbeit zuzugucken, war bisher unmöglich. Das nötige Laserlicht, um die Zelle zu sehen, hat sie zugleich zerstört. Forschende in Jena haben eine Lösung gefunden - und werden dafür mit dem Zukunftspreis 2022 ausgezeichnet.Nordwig, Hellmuthwww.deutschlandfunk.de, Forschung aktuellDirekter Link zur Audiodatei

DNA wird seit einigen Jahren zur Herstellung von Strukturen mit Nanometer Präzision genutzt. Mittels der am häufigsten verwendeten Techniken, “Tile” und “ DNA Origami”, wurden verschiedenste DNA Objekte wie unter anderem DNA Kristalle, DNA Nanotubes, gebogene und verdrehte Zylinder und selbst komplexe 3D Strukturen hergestellt. Aufgrund der einzigartigen Kontrolle über die räumliche Anordnung von DNA Molekülen wird DNA Nanotechnologie heute in verschiedensten Forschungsgebieten wie struktureller Biologie, Nanomedizin, Einzel-Molekül Detektion oder Plasmon-Forschung verwendet. In dieser Arbeit wird systematisch die Biege-Steifigkeit (Persistenz Länge) von DNA Nanotubes (HX-Tubes) als Funktion des Umfangs untersucht. Dazu wurden mikrometer- weite thermische Nanotube Fluktuationen mittels Fluoreszenz Mikroskopie analysiert (A,B). Zusätzlich wurden intrinsische und thermische Nanotube Verdrehungen durch Anbindung von Gold-Nanopartikeln (AuNP) und Transmissions Elektronen Mikroskopie (TEM) sicht- bar gemacht (C). Aus diesen Messungen ergibt sich, dass die Peristenz Länge sich pro- portional zum Flächenträgheitsmoment des Nanotube Querschnitts verhält, intrinsische Verdrehungen nur auftreten, wenn sie durch die DNA Sequenzen vorgegeben sind und dass thermische Verdrehungen u ̈ber sehr viel kürzere Distanzen als die Persistenz Länge auftreten. Des weiteren wurde ein DNA Nanotube Elastizitäts-Modell hergeleitet, das Ver- formungen von doppelstängiger DNA sowie von Cross-Overn berücksichtigt und gezeigt, dass alle Messungen in guter Übereinstimmung mit dem Modell sind. Um ein besseres Verständnis für den Zusammenhang zwischen Persistenz Länge und dem Aufbau von DNA Nanotubes auf der Ebene einzelner DNA Moleküle zu gewinnen wurden die thermischen Verbiegungen von verschiedenen sechs-Helix-Tubes mit unterschiedlichen DNA Architekturen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Anordnen von mehreren Cross-Overn innerhalb einer Tube Querschnittsfläche sowie die Verringerung der Dichte von DNA Cross-Overn die Persistenz Länge verringert. Die Ergebnisse werden im Rahmen des zuvor hergeleiteten Elastizitäts Modell diskutiert. Es wurden verschiedene Strategien zur Herstellung von gebogenen und verdrehten DNA Nanotubes entwickelt. Biegung und Drehung wurden durch gezielte Einfügung oder Auslassung von Basenpaaren, speziell programmierten Faltungswegen, oder spezielle Anordnung von komplementären DNA Sequenzen innerhalb der Nanotubes kontrolliert. Nanotube Konturen wurden mittels TEM, Rasterkraftmikroskopie (AFM), UV-Absorption, sowie stochastischer optischer Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) charakterisiert. Die Mes- sungen zeigen, dass gebogene Nanotubes meist geschlossene Ringe bilden und Nanotubes mit Biegung und Drehung helix-förmig sind (D). Es wird gezeigt, dass Anbindung des organischen Farbstoffs Cy3 an einen oder mehrere DNA Stränge der HX-Tubes ebenfalls zur Ausbildung von Helix-förmigen Nanotubes führt (E). Ganghöhe und Radius der Nanotubes mit Cy3 Anbindung wurden systematisch in Abhängigkeit der Cy3-Bindungsposition gemessen und das Ergebnis mit einem einfachen Cy3-DNA Bindungsmodell verglichen. Des weiteren wurden die optischen Eigenschaften von Cy3 Moleku ̈len, gebunden an HX-Tubes mittels Fluoreszens-Polaristations-Mikroskopie (FPM) und Fluoreszenslebensdauer Messungen untersucht. Es wurde ein Zusammenhang zwischen Anisotropie (gemessen mittels FPM) und der Orientierung der Cy3 Dipol Achse hergeleitet. Die beobachtete Anisotropie entspricht in diesem Modell einem Winkel von ca. 60° zwischen Cy3-Dipol und DNA Achse. Es wird gezeigt, dass die Ausbildung von fluoreszenten Silber Clustern, bestehend aus wenigen Atomen (Ag-DNA) innerhalb von einzelsträngigen “DNA hairpins” an der Oberfläche von DNA Nanotubes stattfinden kann (F). DNA Nanotubes mit Ag-DNA Clustern sind fluoreszent und konnten mittels Fluoreszenz Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Als Nebenprodukt der Ag-DNA Synthese wurde Aggregation von DNA Nanotubes beobachtet. Es wurden zwei neue Methoden zur Weiterentwicklung der DNA Origami Methode untersucht: 1) Kristallisierung von rechteckigen DNA Origami Strukturen zu 1D Ketten und 2D Gittern (G) und 2) Anbindung von “Tiles” an einer DNA origami “Schablone”. Die Faltungs-Ausbeute beider Strategien wurde mittels Gel Elektrophorese, TEM und AFM charakterisiert. Schließlich wird im letzten Kapitel eine Sammlung von Matlab Programmen vorgestellt, die benutzt wurden um DNA Nanotube Kontouren automatisch aus Bild Daten auszulesen, Persistenz Länge zu bestimmen, polarisierte Fluoreszenz Bilder auszuwerten und DNA Sequenzen zu generieren.

Für das Überleben von Bacillus subtilis ist eine verlässliche Überwachung der Integrität der Zellhülle essentiell, um diese zu schützen und bei Schäden adäquat zu reagieren. Neben den ECF � Faktoren spielen Zwei-Komponenten-Systeme (2KS) in der Zellhüllstressantwort von B. subtilis eine zentrale Rolle. Eines dieser Systeme, das LiaRS- 2KS reagiert auf eine große Anzahl verschiedener Zellwand-Antibiotika sowie andere zellhüllstress-auslösende Substanzen. Die zelluläre Funktion und Rolle des Lia-Systems konnte bisher nicht genau definiert werden. In der hier vorliegenden Dissertation wurde das Lia-System erstmals hinsichtlich seiner funktionalen Rolle in B. subtilis untersucht. Im ersten Teil der Ergebnisse wurde eine detaillierte Analyse der LiaR-vermittelten Zellhüllstressantwort in B. subtilisvorgenommen. Transkriptom-Studien dienten zur Identifizierung des LiaR-Regulons. Hierbei wurde die Genexpression des Wildtyps mit zwei Mutanten, die den „ON“ (�liaF) und „OFF“ (�liaR) Zustand des Lia-Systems repräsentierten, verglichen. Von den dabei identifizierten drei potentiellen LiaR-Zielloci (liaIH, yhcYZ-ydhA, ydhE) konnten durch anschließende Folgeuntersuchungen nur die Gene liaI und liaH als in vivo relevante Zielgene für LiaR verifiziert werden. Umfangreiche phänotypische Analysen zeigten, dass �liaIH-Mutanten nur schwach sensitiv auf einige Antibiotika sowie oxidativen Stress reagierten. Ebenso vermittelt eine Überexpression von LiaH in einer �liaF-Mutante keine Resistenz gegenüber stressauslösenden Substanzen. LiaH gehört zur Familie der Phagenschock-Proteine. Weitere Mitglieder dieser Familie sind PspA aus Escherichia coli und Vipp1 aus Arabidopsis thaliana, die große oligomere Ringstrukturen bilden. Die strukturelle Untersuchung von LiaH ergab, dass auch dieses Protein große Ringe bildet (>1MDa). Der zweite Ergebnisteil befasst sich mit der Untersuchung der Stimuluswahrnehmung der Zellhüllstress-detektierenden Systeme in B. subtilis. Die Zellhüllstressantwort auf das Antibiotikum Bacitracin wurde hierbei mittels �-Galaktosidase-Assay sowie Western Blot- Analyse erforscht. Das Bce-System reagiert dabei am stärksten und spezifischsten auf Bacitracin-Stress. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der ABC-Transporter BceAB essentiell für die Stimuluswahrnehmung ist und dass das Bce-System an sich eine Resistenzdeterminante in B. subtilis darstellt. Das Lia-System hingegen wird erst bei höheren Bacitracin-Konzentrationen induziert. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Bce-System Bacitracin direkt wahrnimmt (drug sensing) und das LiaSystem in indirekter Weise auf Zellhüllstress ausgelöst durch Bacitracin reagiert (damage sensing). Im dritten Teil der Ergebnisse wurdendie zelluläre Lokalisation von LiaI, LiaH und LiaG sowie die Beziehung der Proteine untereinander mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und biochemische Ansätze untersucht. Die Membranproteine LiaI und LiaG sind unter Stressbedingungen in der Zellmembran lokalisiert. LiaH, ein cytoplasmatisches Protein verändert unter Stressbedingungen seine Lokalisation vom Cytoplasma an die Membran. Die Funktion von LiaH scheint sich also an der Zellmembran zu vollziehen, wobei LiaI als Interaktionspartner identifiziert wurde. Da in einer �liaI-Mutante LiaH unter Stressbedingungenebenfallsnoch an die Zellmembran assoziert ist, wurde nach weiteren Interaktionspartnern von LiaH gesucht. Eine umfangreiche bacterial-two-hybrid-Analyse ergab, dass sowohl LiaH als auch LiaI und LiaG in ein Interaktionsnetzwerk eingebettet sind, in welchem das bisher uncharakterisierte Protein YvlB eine Schlüsselrolle spielt.Die ebenso in dieses Netzwerk involvierten Proteine YjoB, DnaK und HtpG üben als Proteasen/Chaperone Funktionen in der Faltung und Degradierung von Proteinen aus. Ein Zusammenspiel des Lia-Systems und des Schlüsselproteins YvlB mit den Proteasen/Chaperonen als Reaktion auf Zellhüllstress ist denkbar. Die Phagenschock-Homologe PspA in Streptomyces lividans und E. coli üben einen erheblichen Einfluss auf die Proteinsekretion sowie die elektronenmotorische Kraft der Zelle aus. Daher wurde im letzten Teil der Ergebnisse die Rolle von LiaH in der Proteinsekretion sowie im Energiestoffwechsel näher analysiert. Ein Einfluß des Lia- Systems in der Aufrechterhaltung der elektronenmotorischen Kraft der Zelle konnte nicht bestätigt werden. Durch die Analyse des Sekretoms in B. subtilis konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Proteom einer �PliaI-liaIH-Mutante im Vergleich zum Wildtyp signifikante Veränderungen in der Komposition aufwies.So wurde im Sekretom der �PliaIliaIH- Mutante vor allem das Zellwand-assoziierte Protein WapAidentifiziert, welches im Wildtyp oder in einer �liaF-Mutante nicht auftrat. Das Lia-System beeinflußt somit auch die Proteinsekretion von B. subtilis, wobei die molekularen Mechanismen noch unbekannt sind.

Hintergrund Humane mesenchymale Stammzellen sind ein viel versprechendes Ziel für die ex vivo Gentherapie, und Lentiviren sind exzellente Vehikel für den Gentransfer in hMSCs, da sie hohe Transduktionsfrequenzen mit langfristiger Genexpression erreichen. Dennoch könnte die Seneszenz von hMSCs die therapeutische Anwendung, infolge von zeitaufwendiger Zellselektion und Virus Titration, limitieren. Diese Arbeit beschreibt optimierte Protokolle für hoch effizienten ex vivo lentiviralen Gentransfer in hMSCs und eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zu bestimmen. Methoden EGFP wurde als Markergen/-protein verwendet, um verschiedene lentivirale Expressionsvektoren herzustellen. Die Produktion von Lentiviren wurde mit verschiedenen Verpackungssystemen getestet. Der Prozentsatz transduzierter Zellen wurde durch Polybrene und Blasticidinselektion erhöht. hMSCs von verschiedenen Spendern wurden mittels PCR und Western Blot analysiert. Regulierte Genexpression wurde durch Herstellung eines Tet-On selbstregulierten Expressionsvektors erreicht. Mit einem p24 ELISA-Test wurden übrig gebliebene virale Partikel im Zellkulturüberstand detektiert. Die Effizienz des lentiviralen Gentransfers wurde mittels Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet und mittels qRT-PCR und FACS-Analyse quantifiziert. Die lentiviralen Titer wurden mit qRT-PCR der exprimierten Transgene bestimmt. Die hMSC Differenzierung wurde histologisch untersucht. Ergebnisse Selbstinaktivierende lentivirale Vektoren der dritten Generation zeigten hoch effizienten Gentransfer in hMSCs bei der Verwendung von Polybrene. Die Blasticidinselektion hat den Prozentsatz der transgenen Zellen weiter erhöht unter Selektion von Zellen die mehrere Transgenkopien tragen. Die positiven Effekte von Polybrene und der Blasticidinselektion sind nicht von hMSCs eines speziellen Spenders abhängig. Präzise Regulation der Genexpression wurde durch Herstellung eines selbstregulierten Tet-On-Expressionssystems erreicht. Keine viralen Antigene wurden im Zellkulturüberstand nach aufeinander folgenden Medienwechseln detektiert, was auf die Abwesenheit von infektiösen Partikeln nach einigen Tagen hindeutet. In dieser Arbeit wurde ein starker linearer Zusammenhang zwischen der Virusverdünnung und der Stärke der Transgenexpression mittels qPCR Analysen beobachtet, wodurch die Virustitration durch Quantifizierung der Transgenexpression ermöglicht wird. Abschließend wurde durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung gezeigt, dass transduzierte hMSCs ihren Stammzellcharakter beibehalten haben und dass die Transgenexpression durch die Differenzierung nicht beeinflusst wurde. Schlussfolgerungen Die Quantifizierung der Transgen-Kopienanzahl durch qRT-PCR ist eine schnelle und verlässliche Methode, um den funktionellen lentiviralen Titer nach dem ex vivo Gentransfer in hMSCs zu bestimmen. Die in dieser Arbeit optimierte und charakterisierte Methode für die effiziente lentivirale Transduktion von humanen mesenchymalen Stammzellen, in Verbindung mit regulierbarer Transgenexpression, ist ein sicheres, verlässliches und leistungsstarkes Verfahren und bildet eine aussichtsreiche Grundlage für zukünftige Gentherapie und Tissue Engineering Anwendungen in hMSCs.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Vektor (pGrec) zur Messung der homologen Rekombination (HR) in mitotischen Säugerzellen kloniert und etabliert. pGrec enthält eine HR-Kassette mit zwei Allelen des GFP (green fluorescent protein)-Gens, die durch differentielle Mutagenese inaktiviert wurden. Diese Allele können nur durch HR zu einem Wildtyp-Allel rekonstituiert werden, dessen zelluläre Expression mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachweisbar ist. Die Detektion mittels Durchflusszytometer erlaubt es, seltene GFP+-Zellen zu isolieren und als rekombinante Subklone zur weiteren molekularbiologischen, biochemischen und zellulären Analyse zu etablieren. Das pGrec-HR-Meßsystem wurde an zwei isogenen Zellpärchen angewendet. Nach chromosomaler Integration in die Nager-Zelllinien V79B und deren mutierte Variante CL-V4B (Rad51C(-/-) (Godthelp et al., 2002)) konnte die vermutete Störung der HR in den Rad51C-defizienten CL-V4B-Zellen (Masson et al., 2001; Takata et al., 2001; French et al., 2002; Godthelp et al., 2002) eindeutig nachgewiesen werden: Im Vergleich zur Wildtyp-Zelllinie V79B ist die intrachromosomale Rekombinationsfrequenz der HR-Kassette in der Rad51C-Mutante statistisch signifikant erniedrigt (6-fach). Ebenso scheint die Rate der homologen Rekombination in Fluktuations-Analysen reduziert zu sein (2,7-fach). Somit konnte erstmalig direkt eine Beteiligung von Rad51C an HR gezeigt werden, deren Störung mit der Mutagenüberempfindlichkeit (MMS) und chromosomalen Instabilität von CL-V4B-Zellen korreliert. Kultivierte Zellen von A-T-Patienten sind charakterisiert durch chromosomale Hyper-Rekombination (Meyn, 1993; Luo et al., 1996). Das pGrec-System wurde in AT-Zellen auf seine Anwendbarkeit zur Messung extrachromosomaler Rekombination getestet, um ungleiche Einflüsse der Chromatinstruktur an einem spezifischen Integrationsort zu umgehen. Das Zellpärchen AT-pEBS (Atm(-/-), transfiziert mit leerem Kontroll-Vektor) und AT-YZ (Atm(-/-), ATM ektopisch komplementiert (Ziv et al., 1997)) wurde mit der für humane Zellen episomalen Version des pGrec-Vektors transfiziert. Die Rekombinationsrate in zwei untersuchten Subklonen der AT-pEBS-Zelllinie war im Vergleich zu zwei AT-YZ-Subklonen statistisch signifikant erhöht (34 - 43-fach). Somit wäre erstmals eine Hyperrekombination von AT-Zellen auch in episomalen Loci gezeigt. Die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz ergab jedoch, dass diese in der Gesamtpopulation ATM-komplementierter AT-Zellen erhöht zu sein scheint (6-fach). Mögliche Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedenen experimentellen Ansätzen in den AT-Zelllinien erhalten wurden, werden diskutiert. Das pGrec-System ist als leicht modifizierbarer Vektor konzipiert und somit prinzipiell in allen Säugerzellen anwendbar. Insgesamt stellt pGrec also ein sehr sensitives und nützliches Werkzeug zur Charakterisierung von HR auf molekular-biologischer, biochemischer und zellulärer Ebene dar.