Podcasts about kolokalisation

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Podosomen sind aktinreiche Adhäsionsstrukturen, die vor allem in monozytären Zellen, aber auch in dendritischen Zellen, Osteoklasten, Endothelzellen oder glatten Muskelzel-len vorkommen. In primären humanen Makrophagen gibt es zwei Subpopulationen von Podosomen: größere, hochdynamische Precursor in der Peripherie sowie kleinere, sta-bilere Podosomen im Zellzentrum. Die Regulation der Podosomendynamik in der Zell-peripherie erfolgt durch das Mikrotubuli-basierte Motorprotein KIF1C, wahrscheinlich durch den Transport von Regulationsfaktoren. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Ar-beit lag daher in der Identifizierung dieser Regulatoren. • Die Aufreinigung KIF1C-GFP positiver Vesikel mittels FACS ist grundsätzlich funk-tionell. Die Analyse zahlreicher Vesikel-assoziierter Proteine spricht weiter für die Hypothese, dass es sich bei der von KIF1C transportierten Fracht um vesikuläre Struk-turen handelt. Die Detektion zahlreicher unspezifischer Proteine zeigt jedoch auch, dass die Methode der Aufreinigung zukünftig noch verbessert werden muss. • RabGTPasen, die auch am Transport von Vesikeln beteiligt sind, haben oftmals eine ähnliche subzelluläre Lokalisation wie KIF1C. Vor allem zwischen Rab6a und KIF1C war ein häufiger und länger dauernder Kontakt in der Zellperipherie zu beobachten. Mittels GFP-Immunpräzipitation konnte eine Interaktion bestätigt werden. • Auf der Suche nach weiteren potentiellen Interaktionspartnern von KIF1C wurde das Protein HAX1 identifiziert. Sowohl in fixierten als auch in lebenden primären humanen Makrophagen konnte eine eindeutige Kolokalisation der Proteine in der Zellperipherie beobachtet werden. Bei Einsatz der Rigormutante von KIF1C (KIF1C-K103A) akku-mulierten beide Proteine am MTOC. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion zwi-schen KIF1C und HAX1 schließen. Das Motorprotein KIF9 lokalisiert vor allem an den stabileren Podosomen im Zentrum der Zelle. Bei der Ermittlung der Rolle von KIF9 hinsichtlich der Regulation dieser Po-dosomensubpopulation wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: • Knock-down von KIF9 reduziert die Anzahl der Podosomen und inhibiert bei noch bestehenden Podosomen den Abbau extrazellulärer Matrix. Für KIF9 konnte demnach nicht nur eine Beteiligung an der Podosomenregulation sondern auch eine Rolle im Matrixabbau zugewiesen werden. • KIF9-GFP positive Vesikel assoziieren mit Mikrotubuli und kontaktieren mehrere Podosomen nacheinander. Dies spricht für eine direkte Verbindung von KIF9-vermitteltem, mikrotubuli-basiertem Transport mit Podosomen, die durch KIF9 regu-liert werden. • Durch Immunpräzipitationsversuche wurden Hinweise gefunden, dass KIF9 mögli-cherweise in unterschiedlichen Spleißvarianten oder verschieden phosphorylierten Zu-ständen existiert. • Als Interaktionspartner für KIF9 konnte Reggie-1 identifiziert werden. Durch knock-down von Reggie-1 und auch Reggie-2 konnte diesen Proteinen eine Beteiligung am Abbau extrazellulärer Matrix zugeschrieben werden. Die Teilung der Podosomen-Precursor sowie Auflösung der regulären Podosomen sind grundlegende Vorgänge. Unterschiede in der molekularen Zusammensetzung der Podo-somen-Subpopulationen waren bisher allerdings unbekannt. • Supervillin konnte als erstes Protein identifiziert werden, das differentiell an die unter-schiedlichen Subpopulationen lokalisiert. Dies zeigt zum ersten Mal eine unterschiedli-che molekulare Zusammensetzung der Podosomen-Subpopulationen. • Podosomen reichern Supervillin an, bevor diese sich auflösen. Überexpression von GFP-Supervillin führte außerdem zu einem Verlust von Podosomen, wohingegen shRNA-basierter knock-down die Lebensdauer verlängerte. Supervillin scheint somit eine Rolle in der Regulation von Podosomen zu spielen. • Die Myosin IIA-Bindedomäne ist sowohl für die Anzahl der Podosomen als auch für die differentielle Rekrutierung an die unterschiedlichen Subpopulationen essentiell. • Supervillin steht mit Myosin IIA und der phosphorylierten leichten Kette von Myosin in Verbindung und koppelt kontraktiles Myosin an Podosomen, was deren Auflösung auslöst. • Durch siRNA-basierten knock-down konnte gezeigt werden, dass Supervillin erst zu-sammen mit Myosin IIA und/oder Gelsolin die Effektivität der Podosomen hinsichtlich Matrixabbau beeinflusst. Die Podosomenanzahl hingegen war nicht verändert.

Obwohl seit der erstmaligen Beschreibung der Alzheimer-Erkrankung vor über 100 Jahren eine Vielzahl der ursächlichen histopathologischen Veränderungen und der beteiligten molekularen Mechanismen erforscht werden konnte, ist noch unklar, welche Faktoren die Spaltung des ß-Amyloid Vorläuferproteins (APP) beeinflussen und zu der pathologischen ß-Amyloid (Aß) Bildung und Aggregation führen. In zahlreichen Studien ergaben sich Hinweise, dass Cholesterin einen wichtigen Modulator der Alzheimer-Erkrankung darstellt. Zusammen mit Sphingolipiden bildet Cholesterin laterale Membrandomänen, sogenannte Lipid Rafts, die bei der Bildung der ß-Amyloid Plaques entscheidend beteiligt sein könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur dieser Domänen spezifisch verändert. Durch Transfektion mit dem Scavenger Rezeptor Klasse B Typ I (SR-BI) der die selektive Cholesterin- und Phospholipidaufnahme in die Zelle erhöht, wurden neue Lipid Rafts generiert und bestehende Domänen vergrößert. SR-BI induzierte eine Abnahme des von der α-Sekretase gespaltenen APP, sowie eine Zunahme des von der ß-Sekretase gespaltenen APP. Gleichzeitig kam es zu einem Anstieg der Menge des Aß-Peptids. Somit wurde gezeigt, dass ein Anstieg der Cholesterin-reichen Membrandomänen zu einer Abnahme der α-Sekretase Spaltung, einer Erhöhung der ß-Sekretase Spaltung und einer Zunahme der pathologischen ß-Amyloid Bildung führt. Während APP in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in DSM lokalisiert war, kam es durch die SR-BI Expression zu einer Translokation in DRM, die weitgehend Lipid Rafts repräsentieren. In den DRM konnte BACE damit mit APP interagieren. Um das subzelluläre Kompartiment zu identifizieren, an dem die APP-Spaltung stattfinden könnte, wurde mit Hilfe der Konfokalen Laserscanmikroskopie die intrazelluläre Verteilung von APP und BACE vor und nach SR-BI Expression untersucht. Nach SR-BI Transfektion war die Kolokalisation von APP und BACE in der Umgebung der Zellmembran deutlich verstärkt. Zusammen mit früheren Arbeiten lassen diese Ergebnisse vermuten, dass die verstärkte APP-Prozessierung durch Induktion Cholesterin-reicher Domänen vorwiegend submembranös (Early Endosomes) und auf der Ebene der Plasmamembran stattfindet. Ob eine medikamentöse oder diätetische Cholesterin-Reduzierung, die den Lipid Raft Anteil der Zelle senkt und somit die Interaktion von APP mit BACE verhindert, als Therapiemöglichkeit für die Alzheimer-Erkrankung in Frage kommt, bedarf noch weiterer intensiver Forschung.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.

Die HCN Kanäle spielen als molekulare Basis des Ih Stroms eine bedeutende Rolle bei der Entstehung rhythmischer Erregungen. Die HCN Familie der Säugetiere besteht aus vier Mitgliedern (HCN1-HCN4), die in unterschiedlichem Ausmass in verschiedenen Regionen von Herz und Gehirn exprimiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Bildung von Heteromeren zwischen den einzelnen Isoformen, die Glycosylierung der Kanäle und deren Funktion, die Modulation durch cAMP, die Aktivierung in Bezug auf Kinetik und Spannungsabhängigkeit, sowie die Rolle von HCN Kanal-Genen im Rahmen von genetischen Erkrankungen untersucht. Sowohl im Mausgehirn wie auch in HEK Zellen können die HCN Kanal-Untereinheiten miteinander interagieren. Im Mausgehirn wurde die Heteromerisierung von HCN1 und HCN2 durch Ko-Immunpräzipitation nachgewiesen. Durch konfokalmikroskopische Studien an EGFP- bzw. RFP-markierten HCN Isoformen in HEK Zellen konnte für alle HCN-Zweierkombinationen ausser mHCN2 mit mHCN3 eine Kolokalisation im Bereich der Plasmamembran beobachtet werden. Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch Ko-Immunpräzipitation. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte verifiziert werden, dass mHCN2 und mHCN3 nicht interagieren. Die HCN Kanäle werden in vivo (Mausgehirn) und in vitro (HEK Zellen) N-glycosyliert. Am Beispiel des mHCN2 wurde die physiologische Relevanz dieser posttranslationalen Modifikation untersucht. Ein mutanter, unglycosylierter mHCN2 Kanal wird nicht mehr zur Plasmamembran transportiert und generiert keinen charakteristischen Einwärtsstrom mehr. Nach Koexpression mit hHCN4 ist die Membranständigkeit dieser Mutante wieder gegeben, sowie auch die Kolokalisation der beiden Kanäle. Im Gegensatz hierzu konnte mHCN3 den unglycosylierten mHCN2 nicht zur Zellmembran transportieren, da zwischen den beiden Kanälen ganz offensichtlich keine Bindung bestehen kann. Die für die Bindung von cAMP an den mHCN2 Kanal essentielle Aminosäure Arginin 591 wurde durch gerichtete Mutagenese und Patch-Clamp-Untersuchungen identifiziert. Der Ersatz des Arginin 591 führt zu mHCN2 Kanälen, die bei Anwesenheit von cAMP nicht mehr wie der Wildtyp Kanal eine Verschiebung der halbmaximalen Aktivierung zu positiveren Potentialen zeigen. Durch elektrophysiologische Charakterisierung von verkürzten mHCN2 Kanälen und Chimären aus mHCN1 und mHCN2 konnten den Unterschieden in Aktivierungskinetik und Spannungsabhängigkeit der HCN Isoformen konkrete Kanalteile zugeordnet werden. Für die Geschwindigkeit der Aktivierung sind die Kernregion und ein Stück des C-Terminus verantwortlich, während der C-Terminus die Spannungsabhängigkeit bestimmt. Die genomische Analyse des HCN2 von Cayman Ataxie-Patienten, die zerebrale Dysfunktionen ähnlich denen von HCN2-knockout Mäusen zeigen, ergab keine Unterschiede im Vergleich zu einem gesunden Probanden. Eine Mutation im HCN2 Gen als Ursache der Cayman Ataxie kann somit ausgeschlossen werden, es besteht jedoch die Möglichkeit einer Störung der Proteinsynthese oder posttranslationaler Modifikationen. Auch bei zwei Patienten, die an familiär bedingtem Sick Sinus Syndrom leiden, konnte die Ursache der Erkrankung nach genomischer Sequenzanalyse nicht durch einen Defekt des HCN2 Gens oder des HCN4 Gens erklärt werden.