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Die Mastitis des Rindes ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchwirtschaft. Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) zählen zu den wichtigsten Mastitiserregern, die jedoch zumeist sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. So verursacht E. coli hauptsächlich transiente, akute klinische Mastitiden, während S. aureus als bedeutendster Verursacher chronischer bis subklinischer Mastitiden mit persistierendem Verlauf angesehen wird. In den letzten Jahrzehnten wurde die Pathophysiologie der entzündeten Milchdrüse eingehend wissenschaftlich bearbeitet. Frühe Zeitpunkte einer intramammären Infek-tion, zu denen die Pathogene zwar bereits erkannt wurden, aber noch keine klinischen Symptomen in Erscheinung getreten sind, wurden bislang in vivo noch nicht untersucht. Zu den ersten wirtsseitigen Ereignissen nach dem Eindringen und Erkennen der Patho-gene zählen Veränderungen in der Abundanz von mRNA-Transkripten immun-relevanter Gene. Vertreter dieser differentiell exprimierten Gene gehören z.B. zu den Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Diese sollen es dem Wirt ermöglichen, eine adäquate Immunantwort zu initiieren, welche als entscheidend für den klinischen Verlauf der Erkrankung gilt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur Simulation der ersten 3 h nach dem Eindringen der Pathogene E. coli und S. aureus in das Euter etabliert. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Untersuchung von Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene nach unterschiedlich langer Erregerexposition (1-3 h) in verschiedenen Kompartimenten der Milchdrüse. Dabei wurden die Lokalisationen Zitzenzisterne (ZZ), Drüsenzisterne (DZ) und das ventrale Euterparenchym (EU) näher untersucht. Großes Augenmerk lag auf einer strengen Standardisierung der Versuchs-tiere, um die Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse sicherzustellen. Der Versuch umfasste 12 erstlaktierende Kühe der Rasse Holstein-Friesian mit makelloser Allgemein- und Eutergesundheit und einer Zellzahl < 50.000/ml Milch in allen 4 Eutervierteln. Bei den Tieren wurden 3 Euterviertel jeweils sequentiell über einen Zeitraum von 1, 2 und 3 h entweder mit 5*106 CFU E. coli1303 (n = 6) oder S. aureus1027 (n = 6) intrazisternal inokuliert. Ein Kontrollviertel blieb unbehandelt und diente der Ermittlung von Basisexpressionswerten. Mit Hilfe der unterschiedlich lange inokulierten Viertel konnte ein zeitlicher Verlauf der Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene extrapoliert werden. Wie erwartet traten innerhalb des dreistündigen Versuchszeitraumes keinerlei klinische Effekte bei den Versuchstieren auf. Die innere Körpertemperatur, der Leukozytengehalt im Blut, der SCC und verschiedene Milchinhaltsstoffe erfuhren keine Veränderungen, die auf die Pathogen-Exposition zurückzuführen waren. Durch wiederholte Unter-suchung von Milchproben im Versuchsverlauf wurde die bakterielle Vermehrung analysiert. Hierbei konnte eine Vervielfachung von E. coli um durchschnittlich das 30-fache festgestellt werden, wohingegen sich S. aureus innerhalb der ersten 3 h p. inoc. vergleichsweise schwach vermehrte (durchschnittlich 1,8-fach). Die beiden im Tiermodell verwendeten Bakterienstämme wurden parallel in vitro in Milch und in Nährmedium kultiviert, um deren Wachstum und Adaptationsfähigeit zu untersuchen. E. coli erreichte nach 14-stündiger Inkubation in Milch ein Maximum von 1,2*109 ± 2,5*108 CFU/ml (MW ± SD), während S. aureus mit 5,3*108 ± 8,9*108 CFU/ml (MW ± SD) eine deutlich schwächere und heterogenere Vermehrung zeigte. Im Anschluss an diese Vorinkubation in Vollmilch wurde untersucht, ob sich die Pathogene an das spezifische Wachstumsmedium Milch anpassen konnten. Nach Umsetzen in frische Vollmilch zeigten die Pathogene jedoch kein verbessertes und beschleunigtes Wachstum im Vergleich zu in standardisiertem Medium vorkultivierten Bakterien. Um die Vergleichbarkeit mit früheren Experimenten sicherzustellen, wurden E. coli und S. aureus deshalb mit Nährmedium für die in vivo-Versuche präpariert. Drei Stunden nach Inokulation des ersten Euterviertels wurden die Tiere getötet und Gewebeproben innerhalb von 20 min aus den drei zu untersuchenden Lokalisationen (ZZ, DZ, EU) der einzelnen Euterviertel gewonnen. Die Proben wurden unmittelbar nach Entnahme in Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei -80°C tiefgefroren. Im Rahmen weiterer Untersuchungen fand dann die mRNA-Extraktion sowie die Analyse der Transkript-Abundanzen entzündungsrelevanter Kandidatengene (IL6, TNF, CXCL8, CCL20, S100A9, LAP, LCN2, MX2 und CYP1A1) mittels qRT-PCR statt. Die Auswahl geeigneter Gene erfolgte sowohl anhand eines orientierenden Vorversuchs in vivo als auch anhand bekannter, in vergleichbaren in vitro-Experimenten regulierten Genen der Milchdrüsenepithelzelle. Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsänderungen nach Kontakt mit E. coli deutlich stärker und homogener ausfielen als nach Kontakt mit S. aureus. Bereits nach 1-stündiger Erregerexposition konnten signifikante Steigerungen der mRNA-Expression einiger Gene verzeichnet werden. Dies galt vor allem für die Chemokine CCL20 und CXCL8 sowohl nach Exposition mit E. coli, als auch mit S. aureus. Für die Zytokine IL6 und TNF konnte eine rasche mRNA-Expressionssteigerung nach 1-stündiger intramammärer Inokulation von E. coli nachgewiesen werden, während eine Regulation im Euter mit S. aureus inokulierter Tiere erst nach 2 h und vergleichsweise schwächer eintrat. Die antibakteriell wirkenden Faktoren S100A9 und LAP waren den Chemo-kinen und Zytokinen zeitlich nachgeschaltet, wurden aber nur nach Exposition mit E. coli deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu in vitro-Untersuchungen mit Milch-drüsenepithelzellen konnte für die Gene LCN2, MX2 und CYP1A1 keine nennenswerte Regulation nach Inokulation mit E. coli und S. aureus festgestellt werden. Des Weiteren fiel auf, dass die untersuchten Kandidatengene invariant stärker in ZZ und DZ heraufreguliert wurden, als im EU. Meist ähnelten sich ZZ und DZ in Stärke und Verlauf der Expressionsänderung. Im ventralen Euterparenchym dagegen konnte nach Inokulation von E. coli nur für die Gene IL6, TNF, CXCL8 und S100A9 eine vergleichsweise schwache, aber statistisch signifikante Steigerung der mRNA-Expression aufgezeigt werden. Nach Inokulation mit S. aureus konnte in dieser Lokalisation keine Hochregulation der untersuchten Kandidatengene festgestellt werden. Das in dieser Arbeit etablierte Tiermodell zeigt erstmalig in vivo die frühe patho-genspezifische und kompartimentabhängige Regulation immunrelevanter Gene im Eutergewebe der Milchkuh auf. Es bietet damit eine gute Basis für holistische Ansätze zur Untersuchung sehr früher Ereignisse bei der Wirt-Pathogen-Interaktion. Mittelfristig soll hiermit aufgeklärt werden, welche wirts- und pathogenseitigen Mechanismen zur Entstehung akuter und chronischer Mastitiden führen und welche Faktoren persistente Infektionen der Milchdrüse fördern oder verhindern. Detaillierte Kenntnisse über solche frühen Ereignisse ebnen den Weg, Ansätze für eine verbesserte Mastitis-Diagnostik, -Prophylaxe und -Therapie bei der bovinen Mastitis zu finden.

In einer kontrollierten prospektiven klinisch-experimentellen Untersuchung wurden 24 MNC-Apheresen an 24 freiwilligen gesunden Spendern durchgeführt, das gewonnene Zellkonzentrat portioniert und gezielt mit jeweils einem von fünf häufigen Kontaminationskeimen von Blutprodukten kontaminiert: Escherichia coli, Candida albicans, Staphylokokkus aureus, Koagulase-negative Staphylokokken und Pseudomonas aeruginosa. Dabei wurden zur Inokulation erregerabhängig sepsisähnliche Konzentrationen zwischen zehn hoch minus zwei und zehn hoch drei KBE/ml verwendet. Ein Teil der Proben wurde unter Zusatz von 10 % DMSO kryokonserviert und in der flüssigen Phase von flüssigem Stickstoff bei – 196 ° C gelagert. Von nicht kontaminierten unbehandelten Kontrollen, inokulierten Apheresatproben und gezielt kontaminierten und anschließend kryokonservierten und wiederaufgetauten Proben wurden Blutkulturen in BACTECTMPLUS Aerobic/F* und PLUS Anaerobic/F* Kulturfläschchen angefertigt und zur Untersuchung im BACTEC 9240 Gerät von BECTON DICKINSON in die Mikrobiologie eingesandt. Von positiven Blutkulturen wurden zur Bestätigung des Ergebnisses und zur Isolierung und Identifizierung des Keimes Subkulturen auf Blutagar angefertigt. Die Kryokonservierung zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Viabilität von Mikroorganismen im Apheresat: alle verwertbaren, gezielt kontaminierten Versuchsansätze wiesen nach Kryokonservierung weiterhin Keimwachstum auf. Lediglich bei Escherichia coli konnte, bei Verwendung einer sehr kleinen Inokulationsmenge (zehn hoch minus zwei KBE/ml) zur Kontamination, in drei kryokonservierten und wieder aufgetauten Apheresaten kein Erreger mehr isoliert werden. Da aber bei Verwendung dieser niedrigen Verdünnungsstufe bereits in fünf von zwölf Positivkontrollen kein Wachstum von E. coli nachzuweisen war, dürfen diese Proben nicht in die Auswertung eingehen. Es gibt zu viele Einflussfaktoren auf den Keimnachweis in Blutkulturen, als dass hier von einer Abtötung von E. coli durch den Prozess der Kryokonservierung und des Wiederauftauens ausgegangen werden darf. Als klinisch zuverlässige Maßnahme zur nachträglichen Erzielung von Keimfreiheit bei vorliegender Kontamination eines Aphereseproduktes eignet sich die Kryokonservierung deshalb nicht.

Bei diffusen Magenkarzinomen treten in 50% aller Fälle Mutationen im Gen für das Adhäsionsmolekül E-Cadherin auf. Bei einem Fünftel dieser Mutationen ist Exon 9 deletiert, was die Expression einer mutationsspezifischen Proteinstruktur zur Folge hat (d9-E-Cad). Gegen diese tumorspezifische Bindungsstelle wurde ein monoklonaler Antikörper entwickelt(d9MAk). Dieser Antikörper wurde mit Wismut-213 (Bi-213) gekoppelt, einem hochenergetischen alpha-Emitter mit einer Reichweite von 80 µm im Gewebe, einem hohen linearen Energietransfer von 100 keV/µm und einer Halbwertszeit von 45,6 min. Um das therapeutische Potential des lokoregional applizierten Bi-213-Immuinkonjugats bei disseminierter Tumorzellaussaat gegen die Nebenwirkungen auf den Organismus beurteilen zu können, wurde ein Modell der Peritonealkarzinose bei Nacktmäusen durch intraperitoneale Inokulation von humanen Magenkarzinomzellen mit d9-Cad-Expression entwickelt. Sonographie und Kernspintomographie zeigten für die Visualisierung abdominaler Tumormanifestation und posttherapeutischer Tumorregression eine unzureichende Auflösung, während die In-vivo-Fluoreszenzanalyse "Optical Imaging" für diese Anwendungen erste, viel versprechende Ergebnisse lieferte. Diese Darstellungsmethode könnte in weiteren Studien für die Peritonealkarzinose optimiert werden. Mittels Biodistributionsstudien wurde die spezifische Bindung des Bi-213-d9MAk an den Tumor sowie die Verteilung im Organismus im Vegleich zu einem unspezifischen Kontrollantikörper untersucht. Die Bioverteilung zeigte neben einer hochspezifischen Bindung des Bi-213-d9MAk in Tumoren mit d9-E-Cad-Expression niedrige Konzentrationen des Radioimmunkonjugates im Blut und in den Organen. Bei vorliegendem Aszites blieb ein Großteil des Bi-213-d9MAk abdominal retiniert. Die Überlebenszeiten der Tiere nach Inokulation von 1x10E7 Tumorzellen wurden in Abhängigkeit von der applizierten Aktivität des Bi-213-d9MAk in verschiedenen Peritonealkarzinosestadien erfasst. Die mittlere Überlebenszeit von Tieren, die intraperitoneal mit 7,4 MBq Bi-213MAk am Tag 1 nach Tumorzellinokulation therapiert wurden, war mit 232 Tagen etwa zehnmal länger als jene von untherapierten Kontrolltieren, die bereits 24 Tage nach Tumorzellinokulation Aszites, große Tumormassen oder Tumokachexie zeigten. Bei spezifischer Therapie am Tag 8 nach Tumorzellinokulation, also bei fortgeschrittenem Karzinosestadium, verlängerte sich das Überleben der Mäuse auf 187 Tage. Der Unterschied im mittleren Überleben der Tiere nach Applikation von spezifischem Bi-213-d9MAk bzw. von unspezifischem Radioimmunkonjugat war nur bei Therapie am Tag 8 nach Tumorzellinokulation signifikant, da auch unspezifische Radioimmunkonjugate injiziert am Tag 1 nach Tumorzellinokulation deutliche Therapieerfolge bewirkten. Eine i.p. applizierte Aktivität von 22,2 MBq (600 µCi) führte etwa 180 Tage p.i. zu chronischem Nierenversagen. Ohne Nierenprotektion durch kationische Aminosäuren stellt die Niere somit das dosislimitierende Organ bei der Therapie mit Bi-213-d9MAk dar. Die Bewertung von Veränderungen der Tiergewichte ergab keinen toxischen Einfluss von 7,4 MBq (200 µCi) Bi-213-d9MAk auf den Säugetierorganismus. Die Leukozytenzahlen zeigten eine Abnahme in Abhängigkeit von der applizierten Aktivität, erholten sich aber innerhalb von 30 Tagen. Die Häufigkeit chromosomaler Aberrationen erhöhte sich mit zunehmender Aktivität bis 24 h nach Injektion des Bi-213-d9MAk. Zu späteren Zeitpunkten waren keine chromosomalen Aberrationen mehr nachweisbar. Das Radioimmunkonjugat Bi-213-d9MAk eignet sich nach den Resultaten dieser Studie hervorragend für die lokoregionale Anwendung bei disseminierter Tumorzellaussaat im Abdominalraum als Folge primären Magenkarzinoms mit Expression der d9-Mutante des E-Cadherins. Hohe therapeutische Effizienz, insbesondere bei Vorliegen von kleinen Tumorzellaggregaten und Einzelzellen, und niedrige Toxizität zeichnen das neue Radiopharmakon aus. Der therapeutische Einsatz des Bi-213-d9MAk empfiehlt sich besonders perioperativ bei Resektion eines soliden Magenkarzinoms zur Prophylaxe der Peritonealkarzinose aufgrund traumatischer Tumorzelldissemination.

Die akute postoperative Endophthalmitis stellt eine seltene, aber die Funktion und die Integrität des Auges bedrohende Komplikation nach ophthalmochirurgischen Eingriffen, meist Katarakt-Operation, dar. Häufig wird Staphylococcus epidermidis nachgewiesen. Für die Visusprognose entscheidend sind eine prompte Diagnose und schnellstmögliche Therapieeinleitung, um eine rasche Beseitigung der Erreger und Suppression der Immunantwort zu erreichen. Für die gezielte Therapie einer Staphylococcus epidermidis-assoziierten Endophthalmitis ist die Identifikation des entsprechenden Resistenzspektrums von besonderer Bedeutung, da in letzter Zeit zunehmend Resistenzentwicklungen dieser Spezies beobachtet wurden. Der genaue Zusammenhang zwischen Virulenz und Antibiotikaresistenzmuster der koagulasenegativen Staphylokokken ist bisher unklar. Unsere Hypothese, die auf dem klinischen Eindruck bei der Versorgung von Endophthalmitis-Patienten in unserer Klinik basiert, besagt, daß resistente Keime einen schwereren Krankheitsverlauf der Endophthalmitis induzieren, und dieser somit auf einer höheren Pathogenität dieser Erreger beruhen könnte. Es liegen bisher keine Daten über das funktionelle und histopathologische Erscheinungsbild einer experimentellen Endophthalmitis in Abhängigkeit von den Resistenzcharakteristika der jeweiligen Erreger vor. In der vorliegenden Arbeit wurden in einem Tiermodell Unterschiede im klinischen und funktionellen Verlauf sowie im histopathologischen Bild einer experimentellen Endophthalmitis untersucht, die durch antibiotisch unterschiedlich empfindliche Staphylococcus epidermidis-Stämme hervorgerufen wurden. Die Beobachtung des klinischen Verlaufs der Endophthalmitis ergab keine deutlichen Unterschiede im Schweregrad der Erkrankung bezüglich des vorderen Augenabschnitts. Jedoch konnten in Hinblick auf den Zeitpunkt der Funduseintrübung Differenzen zwischen den einzelnen experimentellen Guppen aufgezeigt werden. Im Verlauf der experimentell induzierten Endophthalmitis kam es bei den partiell- und multiresistenten Staphylococcus epidermidis-Stämmen zu einem früheren Zeitpunkt zu einer stärker ausgeprägten Entzündung und zu einer früheren Eintrübung des Glaskörperraumes durch Infiltration bis hin zum Verlust des roten Fundusreflexes als bei den vollempfindlichen Staphylococcus epidermidis-Stämmen. 12 Stunden nach Inokulation der Bakterien zeigte sich in den mit partiellresistenten Staphylococcus epidermidis-Stämmen infizierten Augen ein im Vergleich zur normalen Netzhautfunktion signifikant erniedrigtes ERG. Die mit vollsensiblen und multiresistenten Stämmen inokulierten Endophthalmitis-Augen waren dieser Gruppe hinsichtlich des Erhalts der Netzhautfunktion signifikant überlegen. 30 Stunden nach Infektion konnte lediglich in den mit vollsensiblen Bakterien inokulierten Augen eine elektroretinographische Antwort der Netzhaut registriert werden. Die histopathologische Analyse trug zu der klinischen und funktionellen Beobachtung bei, daß hinsichtlich des Entzündungsgrades aller untersuchten Gewebe des Auges ein milderes Bild der Endophthalmitis in den mit vollempfindlichen Keimen infizierten Augen und eine deutlichere Desintegration der anatomischen Strukturen in den mit resistenten Staphylococcus epidermidis-Stämmen infizierten Augen resultierte. Aus dem Vergleich der klinischen, histopathologischen und elektrophysiologischen Daten ergibt sich der Eindruck, daß in einem experimentellen Tiermodell einer nicht therapierten Endophthalmitis Resistenzen bei Staphylococcus epidermidis mit einem schwereren Krankheitsverlauf assoziiert sind. Die Studie zeigt, daß antibiotisch vollempfindliche Keime einen milderen Verlauf der Entzündung induzieren als partiell- und multiresistente Stämme von Staphylococcus epidermidis. Somit scheint die Schlußfolgerung gerechtfertigt, daß die spezifische Virulenz von Staphylococcus epidermidis mit dem Antibiotikaresistenzspektrum der einzelnen Stämme korreliert werden kann.