Podcasts about proteinstruktur

Hintergrund Die Schwangerschaft ist ein natürliches, erfolgreiches Modell immunologischer Toleranz [1]. Das Kind, dessen genetisches Material zu 50% allogen ist, wird während der Zeit seiner intrauterinen Entwicklung vom mütterlichen Immunsystem akzeptiert. Ein Zustand, der fundamentalen Regeln der Transplantationsimmunologie (Selbst-Fremd Erkennung) widerspricht. Beim Aufbau der fetomaternalen Grenzfläche wachsen fetale Zellen (sog. Trophoblasten) in die mütterliche Uterusschleimhaut ein, arrodieren mütterliche Blutgefäße und bilden in der reifen Plazenta die Auskleidung eines mütterlichen Blutsees [2]. Dieses trophoblastäre Synzytium ist also gleichermaßen fetales Epithel wie plazentares Endothel und interagiert mit mütterlichen Leukozyten [3]. Die Frage immunologischer Toleranz ist jedoch auch in der Kanzerogenese und in der Etablierung des Tumormikromilieus von entscheidender Bedeutung [4]. Die Entstehung und immunologische Etablierung eines malignen Tumors ist die gemeinsame Endstrecke eines letztendlich ungerichteten Prozesses. Die Charakteristika einer malignen Erkrankung sind daher in hohem Maße individuell. Ausdruck dessen ist die zunehmende Hinwendung zu individualisierten Krebstherapien (sog. targeted therapies) wie sie z.B. auch immuntherapeutische Ansätze darstellen [5]. Der spezifische Aufbau immunologischer Toleranz an der Tumor-Stroma Grenzfläche ist auf Grund der großen interindividuellen Unterschiede im humanen System nur schwer nachzuvollziehen. Demgegenüber verläuft der Aufbau des spezifischen immunologischen Mikromilieus an der fetomaternalen Grenzfläche entlang geordneter Bahnen, deren Erforschung allgemeine Prinzipien der Toleranzentwicklung im humanen System zu Tage fördern könnte. Das vorliegende Habilitationsprojekt widmet sich Mechanismen immunologischer Toleranz und ihrer Durchbrechung am Plazenta- und Tumor-Modell. Bisher bearbeitete Fragestellungen Dendritische Zellen (DC) besetzen eine zentrale Schaltstelle des Immunsystems und können einerseits antigenspezifische cytotoxische T-Zell Immunantworten induzieren, andererseits im steady state für immunologische Toleranz sorgen [6, 7]. Ihre Eigenschaft der spezifischen Immuninduktion prädestinieren DC für eine individualisierten Krebs-Immuntherapie, deren immunogene Eigenschaften wir in Zellkultur-Modellen beurteilen konnten [8]. Apoptose als der physiologische Zelluntergang induziert peripher (d.h. außerhalb lymphatischer Organe) vermittelt über DC immunologische Toleranz. Apoptotisch zu Grunde gegangene Zellen werden dabei von DC aufgenommen und so aufbereitet, dass ihre charakteristische Proteinstruktur von cytotoxischen T-Zellen erkannt wird. Zusätzliche Signale bestimmen nun, ob diesen T-Zellen angezeigt wird, die betreffende Proteinstruktur zu tolerieren oder dagegen eine Immunantwort zu induzieren [9, 10]. Eine solche Immunantwort ist hochspezifisch und bietet sich daher als targeted therapy in der Krebstherapie an [11]. Wir konnten in diesem Zusammenhang den Weg apoptotischen Tumormaterials in Zellkultur-DC genauer verfolgen und als Einflussfaktor der folgenden Immunantwort näher charakterisieren [12]. Neben der Charakteristik des aufgenommen Zellmaterials ist die Eigenart jener zusätzlichen Signale (den von P. Matzinger erstmals so genannten „Gefahrensignalen“) von entscheidender Bedeutung für die Immunantwort. Gefahrensignale sind immunologische Muster, die eine Infektion oder Zellschädigung kennzeichnen und eine pathogen- und gewebsspezifische Immunreaktion nach sich ziehen. So konnten wir mit Adenosin-Triphosphat ein obligat intrazelluläres Molekül als ein solches Gefahrensignal charakterisieren [13]. An die Stelle der klassischen Unterscheidung zwischen Selbst- und Fremd tritt damit die Unterscheidung zwischen Gefahr und Nicht-Gefahr. Der Zustand der Nicht-Gefahr der sog. steady state wird in diesem Modell mit der Induktion einer gewebsspezifischen Toleranz andererseits jede Schädigung durch ein Pathogen durch eine auf Pathogen und Gewebe maßgeschneiderte Immunreaktion beantwortet. Das lokale Gewebe ist in diesem Modell Auslöser und Ziel der Immunantwort während im klassischen Selbst Fremd Modell das Immunsystem der Auslöser und das Gewebe lediglich das Zielorgan darstellt [14]. Bonney und Matzinger konnten im Maus-Modell zeigen, dass diese Unterscheidung zwischen intakter systemischer Immunantwort und lokaler Immuntoleranz auch auf das klassische Paradoxon der Fortpflanzung zutrifft [15]. Hieran anknüpfend konnten wir im humanen in vitro System Glycodelin, ein progesteronabhängiges Glycoprotein der fetomaternalen Grenzfläche, als einen solchen lokalen Faktor im Hinblick auf eine Toleranzinduktion in DC nachweisen [16]. Im Rahmen hypertensiver Schwangerschaftserkrankungen gelang es zudem erstmals, eine Rolle des Aktivierungszustandes dendritischer Zellen am Patientenmaterial zu zeigen [17]. In der Frühschwangerschaft konnten wir außerdem nachweisen, dass eine verminderte Expression von Glycodelin mit einem Abortgeschehen assoziiert ist [18]. Das ansonsten schwangerschaftsspezifische lokal immunsuppressive Glycodelin wird jedoch auch von gynäkologischen Tumoren im Rahmen der Karzinogenese zur lokalen Immunsuppression benutzt. Im Ovarialkarzinom konnten wir Glycodelin-abhängige Immunsupression auf Zellkultur-DC ebenso nachweisen wie eine Korrelation mit dem Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus als prädiktivem Faktor in histologischen Schnitten des Mammakarzinoms [19; 21] Eine der zentralen Aufgaben der fetomaternalen Grenzfläche ist die Trennung des mütterlichen und kindlichen Blutkreislaufes. Bei einem Leck dieser Trennung kann es zum Ausbluten des Feten in den Kreislauf der Mutter kommen. Mechanische Belastung wurde lange Zeit als ein Hauptriskofaktor für dieses seltene, jedoch in seinem Verlauf oftmals sehr dramatische Krankheitsbild gesehen. In einer Beobachtungsstudie konnten wir mit einem sehr sensitiven durchflußzytometrischen Testverfahren jedoch eine plazentare Entzündungsreaktion als bislang nicht beschriebenen Risikofaktor etablieren [22]. Ein lange Zeit mit besonderer Aufmerksamkeit verfolgter Risikofaktor einer fetomaternalen Transfusion Besonderes war die mechanische Belastung im Rahmen der sog. äußeren Wendung, bei der ein Kind am Ende der Schwangerschaft aus Beckenendlage durch Manipulation von außen in eine Schädellage gedreht wird, um eine vaginale Geburt aus Schädellage zu ermöglichen. Die Sicherheit des Kindes steht dabei naturgemäß an oberster Stelle. In einer klinischen Beobachtungs-Studien konnten wir mit einem sehr sensitiven durchflußzytometrischen Testverfahren dazu beitragen die Volumina der fetomaternalen Transfusion im Rahmen einer äußeren Wendung mit o.g. Testverfahren genauer zu quantifizieren und den Einfluss der mechanischen Belastung auf die fetomaternale Transfusion damit zu relativieren [23].

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des kürzlich identifizierten Polymorphismus im Gen der Rezeptortyrosinkinase FGFR4 (fibroblast growth factor receptor 4) im besonderen Hinblick auf seine Zusammenhänge mit der humanen Tumorpathogenese näher untersucht. Es handelt sich dabei um eine Keimbahnmutation, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 (Arg388) und somit zu einer veränderten Proteinstruktur in der Transmembrandomäne des Rezeptors führt. Zuvor publizierte Studien, die Tumore verschiedener Organsysteme mit Fokus auf den FGFR4 Polymorphismus untersuchten, postulieren einen Zusammenhang zwischen der Rezeptormutation und seinem Einfluss auf die Tumorprogression und das Metastasierungspotential. Um diesen Einfluss der Mutation in unserem Tumorkollektiv zu untersuchen, führten wir bei Tumorproben von 301 Patienten, die an einem Plattenepithelkarzinom aus dem Bereich des Oropharynx litten, eine Genotypisierung mittels RFLP-PCR sowie immunhistochemische Untersuchungen durch, um die Expressionsstärke des FGFR4 feststellen zu können. Dabei zeigte sich, dass der FGFR4 in 34% der Fälle in heterozygoter oder homozygoter mutierter Form im Kollektiv vorliegt. Das entspricht einer Allelfrequenz für das Arg388 von 0.2. Die Verteilung der Rezeptorexpression im Kollektiv war weitgehend gleichmäβig verteilt. Um die Auswirkungen der durch die Untersuchungen gewonnenen Parameter auf die Tumorpathogenese festzustellen, wurden sie mit einem umfassenden Datensatz, der aus den Patientenakten gewonnen wurde, korreliert. Statistische Untersuchungen wiesen keine signifikanten Zusammenhänge zwischen dem FGFR4 Genotyp und der Tumorprogression oder einem gesteigertem Metastasierungspotential nach. Auch die in anderen Organsystemen zuvor festgestellte verringerte rezidivfreie Überlebenszeit bei Vorliegen des Arg388 Allels konnte in dem Kollektiv dieser Studie nicht reproduziert werden. Bezüglich der Rezeptorexpression ergaben unsere Untersuchungen Hinweise auf einen Überlebensvorteil bei starker FGFR4 Expression. Signifikante Zusammenhänge zwischen Rezeptorexpression und Tumorgröβe oder Tumorprogression konnten jedoch nicht nachgewiesen werden und decken sich mit den Ergebnissen von Streit et al. Somit können wir die bereits mehrfach postulierte Perspektive nicht stärken, den FGFR4 als Prädiktor oder prognostischen Parameter bei Krebserkrankungen zu deklarieren.

Bei diffusen Magenkarzinomen treten in 50% aller Fälle Mutationen im Gen für das Adhäsionsmolekül E-Cadherin auf. Bei einem Fünftel dieser Mutationen ist Exon 9 deletiert, was die Expression einer mutationsspezifischen Proteinstruktur zur Folge hat (d9-E-Cad). Gegen diese tumorspezifische Bindungsstelle wurde ein monoklonaler Antikörper entwickelt(d9MAk). Dieser Antikörper wurde mit Wismut-213 (Bi-213) gekoppelt, einem hochenergetischen alpha-Emitter mit einer Reichweite von 80 µm im Gewebe, einem hohen linearen Energietransfer von 100 keV/µm und einer Halbwertszeit von 45,6 min. Um das therapeutische Potential des lokoregional applizierten Bi-213-Immuinkonjugats bei disseminierter Tumorzellaussaat gegen die Nebenwirkungen auf den Organismus beurteilen zu können, wurde ein Modell der Peritonealkarzinose bei Nacktmäusen durch intraperitoneale Inokulation von humanen Magenkarzinomzellen mit d9-Cad-Expression entwickelt. Sonographie und Kernspintomographie zeigten für die Visualisierung abdominaler Tumormanifestation und posttherapeutischer Tumorregression eine unzureichende Auflösung, während die In-vivo-Fluoreszenzanalyse "Optical Imaging" für diese Anwendungen erste, viel versprechende Ergebnisse lieferte. Diese Darstellungsmethode könnte in weiteren Studien für die Peritonealkarzinose optimiert werden. Mittels Biodistributionsstudien wurde die spezifische Bindung des Bi-213-d9MAk an den Tumor sowie die Verteilung im Organismus im Vegleich zu einem unspezifischen Kontrollantikörper untersucht. Die Bioverteilung zeigte neben einer hochspezifischen Bindung des Bi-213-d9MAk in Tumoren mit d9-E-Cad-Expression niedrige Konzentrationen des Radioimmunkonjugates im Blut und in den Organen. Bei vorliegendem Aszites blieb ein Großteil des Bi-213-d9MAk abdominal retiniert. Die Überlebenszeiten der Tiere nach Inokulation von 1x10E7 Tumorzellen wurden in Abhängigkeit von der applizierten Aktivität des Bi-213-d9MAk in verschiedenen Peritonealkarzinosestadien erfasst. Die mittlere Überlebenszeit von Tieren, die intraperitoneal mit 7,4 MBq Bi-213MAk am Tag 1 nach Tumorzellinokulation therapiert wurden, war mit 232 Tagen etwa zehnmal länger als jene von untherapierten Kontrolltieren, die bereits 24 Tage nach Tumorzellinokulation Aszites, große Tumormassen oder Tumokachexie zeigten. Bei spezifischer Therapie am Tag 8 nach Tumorzellinokulation, also bei fortgeschrittenem Karzinosestadium, verlängerte sich das Überleben der Mäuse auf 187 Tage. Der Unterschied im mittleren Überleben der Tiere nach Applikation von spezifischem Bi-213-d9MAk bzw. von unspezifischem Radioimmunkonjugat war nur bei Therapie am Tag 8 nach Tumorzellinokulation signifikant, da auch unspezifische Radioimmunkonjugate injiziert am Tag 1 nach Tumorzellinokulation deutliche Therapieerfolge bewirkten. Eine i.p. applizierte Aktivität von 22,2 MBq (600 µCi) führte etwa 180 Tage p.i. zu chronischem Nierenversagen. Ohne Nierenprotektion durch kationische Aminosäuren stellt die Niere somit das dosislimitierende Organ bei der Therapie mit Bi-213-d9MAk dar. Die Bewertung von Veränderungen der Tiergewichte ergab keinen toxischen Einfluss von 7,4 MBq (200 µCi) Bi-213-d9MAk auf den Säugetierorganismus. Die Leukozytenzahlen zeigten eine Abnahme in Abhängigkeit von der applizierten Aktivität, erholten sich aber innerhalb von 30 Tagen. Die Häufigkeit chromosomaler Aberrationen erhöhte sich mit zunehmender Aktivität bis 24 h nach Injektion des Bi-213-d9MAk. Zu späteren Zeitpunkten waren keine chromosomalen Aberrationen mehr nachweisbar. Das Radioimmunkonjugat Bi-213-d9MAk eignet sich nach den Resultaten dieser Studie hervorragend für die lokoregionale Anwendung bei disseminierter Tumorzellaussaat im Abdominalraum als Folge primären Magenkarzinoms mit Expression der d9-Mutante des E-Cadherins. Hohe therapeutische Effizienz, insbesondere bei Vorliegen von kleinen Tumorzellaggregaten und Einzelzellen, und niedrige Toxizität zeichnen das neue Radiopharmakon aus. Der therapeutische Einsatz des Bi-213-d9MAk empfiehlt sich besonders perioperativ bei Resektion eines soliden Magenkarzinoms zur Prophylaxe der Peritonealkarzinose aufgrund traumatischer Tumorzelldissemination.