Podcasts about cofilin

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.07.10.548429v1?rss=1 Authors: Warner, H., Franciosa, G., van der Borg, G., Faas, F., Koenig, C., de Boer, R., Classens, R., Maassen, S., Baranov, M., Mahajan, S., Dabral, D. D., Coenen, B., Bianchi, F., van Hilten, N., Risselada, H. J., Roos, W. H., Olsen, J., Querol Cano, L., van den Bogaart, G. V. Abstract: To mount an adaptive immune response, dendritic cells must process antigens, migrate to lymph nodes and form synapses with T cells. Critical to 3D migration and mechanosensing is the nucleus, which is the size-limiting barrier for navigation through gaps in the extracellular matrix. Here, we show that inflammatory activation of dendritic cells leads to the nucleus becoming spherically deformed, and enables dendritic cells to overcome the typical 2 to 3 micron pore limit for 3D migration. We show that the nuclear shape-change is partially attained through reduced cell adhesion, whereas improved migration through extracellular matrix is achieved through reprogramming of the actin cytoskeleton. Specifically we show that phosphorylation of cofilin-1 at serine 41 drives the assembly of a CofilinActoMyosin (CAM)ring proximal to the nucleus and enhances migration through 3D collagen gels. In summary, these data describe novel signaling events through which dendritic cells simultaneously deform their nucleus and enhance their migratory capacity; molecular events that may be recapitulated in other contexts such as wound healing and cancer. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

As discussed in previous episodes, the actin cytoskeleton is vital to allow cells to move. But what about the specifics? In this episode, we're going to be dissecting the lamellipodium- a meshwork actin structure that some cells use to move. Sources for this episode: 1) Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, and Walter (2008), Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition. Abingdon: Garland Science, Taylor and Francis Group LLC. 2) Berro, Michelot, Blanchoin, Kovar and Martiel (2007), Attachment Conditions Control Actin Filament Buckling and the Production of Forces. Biophysical Journal 92(7): 2546- 2558. 3) Kiuchi, Ohashi, Kurita and Mizuno (2007), Cofilin promotes stimulus-induced lamellipodium formation by generating an abundant supply of actin monomers. The Journal of Cell Biology 177(3): 465- 476. 4) ‘Mechanobiology Institute, Singapore', YouTube (2013), Arp2/3 complex mediated actin nucleation (online) [Accessed 23/11/2020]

Commentary by Dr. Valentin Fuster

The formation of neuronal networks depends on the proper development and targeting of the neurons within the network. One key challenge during the development of such networks is the correct cross linking of axons and dendrites. Only correct synapse formation between dendrites and axons will allow neurons to contribute to the entire network. Therefore further insights into axon targeting mechanisms will help to understand the underlying developmental processes and contribute to future cures for a number of related diseases. Generally, once a neuron forms an axon, it starts growing towards a certain “target zone”. The underlying axon targeting mechanisms are controlled by a large number of extracellular cues provided by the extracellular matrix and neighboring cells. Depending on the neuron type, axons travel different distances towards their future synaptic partner. During that journey the neurons, more specifically the growth cone, constantly comes into contact with guidance cues. The growth cone symbolizes the forefront of an axon and is responsible to integrate different guidance signals. Depending on their nature, they trigger the local assembly or disassembly of the cytoskeleton and ultimately force the axon to turn into a certain direction. Although different guidance cues activate different signaling pathways, all of these cascades will eventually converge down on the cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements and changes in actin dynamics within the growth cone will promote the turning of the entire axon. In a series of events different guidance cues, attractive and repulsive, will guide the growth cone to its respective target. In this study I used the olfactory system, more specifically the olfactory receptor neurons (ORNs), of Drosophila melanogaster to investigate the mechanisms of axon targeting. The olfactory system of the fruit fly proved to be a very powerful model organism for a number of reasons: First, the number of genetic tools available for Drosophila allows the manipulation of many cellular aspects. Second, ORNs have an extremely stereotyped targeting pattern that proved to be a good system to investigate axon targeting mechanisms. The work presented in this thesis studied the role of the highly conserved actin binding protein Psidin during the development and targeting of ORNs. Herein, I was able to demonstrate that Psidin uses two independent molecular mechanisms to control ORN targeting and survival. To elucidate Psidin’s role in the aforementioned processes, I analyzed two predicted null alleles psidin1 (Brennan et al., 2007) and psidin55D4 (Kim et al., 2011), and one hypomorphic allele psidinIG978 (this study). The new hypomorphic allele psidinIG978 was mapped during this study and found to have a single point mutation within Psidin’s coding region (E320K). The data shown in this study demonstrate that Psidin is required at two different time points during the development of the olfactory system. During ORN development, Psidin is required as non-catalytic part of the N-acetyltransferase complex (NatB) to ensure ORN survival. At later stages during development, Psidin functions as an actin binding protein to regulate actin dynamics to ultimately ensure proper ORN axon targeting. I was able to show for the first time that Psidin’s previously reported function as actin binding protein in oocytes (Kim et al., 2011), is also true for neurons. The loss of Psidin leads to significantly reduced lamellipodia in growth cones of primary neurons in vitro. In agreement with Psidin’s role in actin dynamics is the finding that the parallel removal of the actin stabilizer Tropomyosin rescues the lamellipodia defect in psidin1 primary neurons. This strongly argues for Psidin being an actin destabilizing protein and antagonist of Tropomyosin. In general, psidin1 and psidin55D4 mutant axons showed severe mistargeting defects in vivo – e.g. defasciculation in Or59c and Or42a neurons or ectopic synapse formation in Or47a neurons. However, axons mutant for psidinIG978 displayed a less severe phenotype compared to the null alleles. In agreement with in vitro data, the parallel removal of Tropomyosin rescued the targeting defect in Or59c neurons in vivo. The growth cone and the lamellipodia are both important structures that keep axons responsive towards guidance cues. Therefore the lamellipodia reduction in psidin mutants is likely the cause for the observed targeting defects. Nevertheless, Psidin is required differentially among the ORN classes – the ones that project to dorsolateral or ventromedial glomeruli within the antennal lobe (AL) are more affected than centrally projecting classes. ORN classes that are more affected in psidin mutants have to turn upon entry of the AL. Therefore those classes (dorsolateral and ventromedial) have a higher requirement of Psidin, which has to maintain the lamellipodium, so that the axon can respond to cues in the first place. In addition, I overexpressed different isoforms of LimK and Cofilin to artificially create conditions that favor actin stabilization or destabilization. More generally, conditions that promoted actin destabilization and actin stabilization were able to rescue and aggravate the psidin1 phenotype, respectively. In addition to the targeting defect, psidin1 and psidin55D4 mutants showed a strong reduction in ORN cell numbers. In contrast, cell numbers were not affected in psidinIG978 mutant flies. Again, ORN classes were affected differently – e.g. Or42a neuron number was reduced by 83%, but Or59c number was only reduced by 46%. Indicating Psidin’s function in ORN survival, the expression of the anti-apoptotic protein p35 in psidin mutant neurons selectively rescued the cell number, but failed to rescue the targeting defects. Interestingly, the Psidin/Tropomyosin double mutant showed the opposite effect; here the targeting was rescued, but not the cell number. These findings gave strong indications that Psidin has two independent functions during ORN targeting and development. Psidin is predicted to be the non-catalytic part of the N-acteyltransferase complex B (NatB) in Drosophila (Brennan et al., 2007). Here, Psidin (non-catalytic) forms the NatB-complex together with dNAA20 (catalytic). This complex is thought to acetylate nascent protein chains N-terminally. In this study I demonstrated for the first time that both proteins interact in vivo and in vitro. Indicating that the NatB-complex is involved in ORN survival, the knock-down of dNAA20 in psidinIG978 mutants led to a reduction of ORN cell number that is reminiscent of the cell number in psidin1 or psidin55D4 background. At the same time, the knock-down of dNAA20 had no effect on the targeting of ORNs. Furthermore I was able to show that wild type Psidin and PsidinIG978 interact with dNAA20 at comparable levels in vitro. This is in agreement with the finding that the psidinIG978 allele selectively affects ORN targeting, but not ORN survival. In addition, I was able to map the interaction domain between Psidin and dNAA20. This revealed that the point mutation found in psidinIG978 is just outside of the minimal interaction domain. Deletion of the entire interaction domain led to a complete abolishment of the Psidin/dNAA20 interaction. Furthermore I was able to demonstrate that the interaction of Psidin and dNAA20 is regulated by the phosphorylation of a highly conserved serine residue (S678). Expression of the non-phosphorylatable Psidin isoform (S678A) rescued the targeting and cell number phenotype in vivo. Contrary expression of the phosphomimetic isoform (S678D) only rescued the targeting phenotype, but failed to restore ORN cell number in vivo. In line with this observation is the finding that the S678D isoform is unable to bind dNAA20 in vitro. At the same time the S678A isoform binds dNAA20 at normal levels in vitro. Taken together, the data presented in this work demonstrate that Psidin has two functions during the development and targeting of ORNs using two independent molecular mechanisms: First, during axon targeting Psidin is required as an actin destabilizing molecule and antagonist of Tropomyosin. Psidin maintains the lamellipodia size in growth cones and keeps the cytoskeleton in a dynamic and responsive state. This ensures that growing axons can respond properly to various guidance cues. Second, to ensure ORN survival, Psidin is required as non-catalytic part of the NatB-complex. Here, Psidin interacts with the catalytic subunit dNAA20. The formation of the NatB-complex is regulated by phosphorylation of a conserved serine. In its unphosphorylated state Psidin binds dNAA20 and ensures ORN survival, whereas phosphorylation causes the abolishment of this interaction which results in a reduction of ORN cell number. Concluding, this thesis unambiguously shows that Psidin is required at different time points during the formation of the olfactory system of Drosophila. It utilizes two different pathways to ensure (i) ORN survival as part of the NatB-complex and (ii) ORN targeting as actin binding protein. Due to its strong conservation in higher organisms, the here presented data provide important insights into the function of Psidin’s mammalian homologues.

The protein phosphatase activity of PTEN impairs macrophage phagocytosis of a fungal pathogen by promoting actin depolymerization.

Cofilin severs the ties between cytokinetic nodes Cytokinetic nodes are precursor structures that assemble into the actomyosin contractile ring that separates daughter cells in cytokinesis. Chen and Pollard describe how the actin-severing protein cofilin promotes the rapid formation of a complete contractile ring by limiting the actin-based connections between individual nodes. This biosights episode presents the paper by Chen and Pollard from the October 31, 2011, issue of The Journal of Cell Biology, and includes an interview with authors Qian Chen and Tom Pollard (Yale University, New Haven, CT). Produced by Caitlin Sedwick and Ben Short. Subscribe to biosights via iTunes or RSS View biosights archive The Rockefeller University Press biosights@rockefeller.edu

Die akute Pankreatitis beginnt in den exokrinen Azinuszellen des Pankreas und wird durch verschiedene, bisher nicht vollständig geklärte, intrazelluläre Vorgänge ausgelöst. Das Hormon Cholezystokinin stimuliert Signaltransduktionskaskaden, welche über eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts zu einer akuten Organentzündung führen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein über das Enzym RhoA vermittelter intrazellulärer Signalweg zu Aktin-bindenden Proteinen im Pankreas diese Reaktion hervorruft und durch Cholezystokinin reguliert werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bringen den Nachweis der Existenz der im Folgenden beschriebenen Signaltransduktionskaskade in exokrinen Azinuszellen: RhoA führt über eine Aktivierung von ROCK II zu einer Phosphorylierung der Zieluntereinheit MYPT1 der Myosinphosphatase und somit zu einer Hemmung des Gesamtenzyms. Dadurch transloziert die sowohl in der Zytosol- als auch in der Zytoskelettfraktion vorkommende, unphosphorylierte Form MYPT1 vollständig ins Zytosol. Die Myosinphosphatase führt zu einer Dephosphorylierung der MLC von Myosin. Die fast vollständig in der Zytoskelettfraktion exprimierte phosphorylierte Form pMLC transloziert im dephosphorylierten Zustand ins Zytosol. Durch die Interaktion mit MYPT1 kann MLC zu einer Aktinmyosinkontraktion und somit zu einer Reorganisation des Aktinzytoskeletts führen. Über alternative Signalwege bewirkt RhoA eine Aktivierung von mDia, welches mittels Profilin zu einer Aktinpolymerisation führt. Über ROCK II wird eine Aktivierung der LIMK durch RhoA vermittelt. Dadurch wird Cofilin vermehrt phosphoryliert, wodurch die Depolymerisation der Aktinfilamente gehemmt wird. Durch eine dosis- und zeitabhängige Stimulation mit physiologischen und supraphysiologischen Dosierungen Cholezystokinin wird der Signalweg über RhoA gehemmt. Dadurch kann eine Kontraktion des Aktinzytoskeletts stattfinden und es zu einer Fusion von Vesikeln und zu einer Inhibierung des regulären Sekretionsmechanismus der Pankreaszellen kommen. Da die Hemmung von Aktin-modulierenden Proteinen eine bedeutende Rolle bei der Organfunktion und Entwicklung der akuten Pankreatitis spielt, trägt diese Arbeit dazu bei, sowohl die physiologischen als auch die pathophysiologischen Vorgänge innerhalb der Azinuszellen näher zu charakterisieren. Dies könnte zu einem besseren Verständnis der dieser Erkrankung zugrundeliegenden Mechanismen führen und somit einen therapeutischen Ansatz bei der akuten Pankreatitis darstellen.

The activation of platelets is a central step during the physiological process of hemostasis and its understanding may lead us to control the pathophysiological process of intra-arterial thrombus formation and vascular occlusion, which can cause acute coronary syndrome and myocardial infarction. One of the important aspects of platelet activation is to understand the dynamic regulation and rearrangement of the cytoskeleton after stimulation. The morphological and functional changes of platelets require a drastic remodeling of the actin cytoskeleton regulated by numerous actin-binding proteins and signaling molecules such as the family of Rho-GTPases. The small GTPase Rho can regulate several aspects of cellular function, predominantly through its downstream effector Rho-kinase. One of the well established Rho-kinase-mediated signaling pathways is the phosphorylation of myosin light chain (MLC) and its counteracting MLC phosphatase. Rho-kinase regulates a second pathway that involves activation of LIM-kinases (LIMKs) and subsequent phosphorylation and inactivation of cofilin, an actin dynamizing protein. Dephosphorylation and activation of cofilin lead to severing and depolymerization of existing actin filaments. The signaling pathway Rho-kinase/LIMKs/cofilin phosphorylation during platelet activation and the question, how the phosphorylation of cofilin affects the actin dynamics underlying platelet activation, has not previously been studied. The physiological agonist thrombin and the pathophysiological relevant agonist lysophosphatidic acid (LPA), which is the main platelet-activating lipid in atherosclerotic plaque, were used as platelet stimuli to address these questions. It was found that the activation of Rho-kinase is important for an increase in F-actin content underlying Ca2+-independent platelet shape change. The activation of Rho-kinase was found to be upstream to secretion and integrin IIbβ3 activation. The rapid activation of Rho-kinase during secretion leads to a further increase in F-actin content as compared to shape change. It was observed that LPA-stimulated dense granule secretion is mainly regulated by Rho-kinase, whereas secretion induced by thrombin was only in part Rho-kinase-dependent. Together, these results show that Rho-kinase regulates the F-actin increase underlying shape change and secretion, but it is not directly involved in aggregation. This study for the first time demonstrates that platelet expresses only LIMK-1 and not LIMK-2. LIMK-1 can be activated by Rho-kinase as well as by p21-activated kinases (PAKs). Our study shows that LIMK-1 activation was mainly Rho-kinase dependent in LPA- and thrombin-stimulated platelets. Although, PAK-1/2 activation was observed during LPA-stimulated platelet shape change, PAKs are unlikely to be involved in LIMK-1 activation in these cells. Like Rho-kinase activation, it was also found that LIMK-1 activation was independent and upstream of integrin IIbβ3 activation. Surprisingly, the activation of LIMK-1 failed to increase cofilin phosphorylation during shape change induced by LPA as well as by thrombin. Inhibition of the Rho-kinase/LIMK-1 pathway unmasked cofilin dephosphorylation suggesting that during shape change the simultaneous activation of a cofilin phosphatase counteracts the effect of LIMK-1 for phosphorylating cofilin. During secretion and aggregation induced by LPA and thrombin, cofilin was rapidly dephosphorylated and subsequently rephosphorylated; the latter phase was due to Rho-kinase/LIMK-1 activation. After stimulation with LPA and thrombin under conditions, where platelet aggregation could not occur, the kinetics of cofilin de- and rephosphorylation were unperturbed indicating their independence of integrin IIbβ3 engagement. Furthermore, the results clearly showed that cofilin dephosphorylation is also independent and upstream of secretion, since the onset of cofilin dephosphorylation was as rapid as secretion in thrombin-stimulated platelets and also occurred in the absence of dense granule secretion in LPA (10 µM)-stimulated platelets. Since the kinetics of cofilin phospho-cycle was similar during secretion and platelet aggregation in LPA- and thrombin-stimulated cells, I propose a general two-step regulatory process for cofilin phospho-cycle underlying primarily secretion, and subsequently platelet aggregation: dephosphorylation by a cofilin phosphatase and then rephosphorylation by the Rho-kinase/LIMK-1 pathway. Our results showing that only dephosphorylated (activated) cofilin binds with F-actin support previous observations that the state of cofilin phosphorylation determines its association with F-actin. The effect of Y-27632 in resting platelets showing a reduction in cofilin phosphorylation, and an increase of F-actin content and cofilin association with F-actin suggested that LIMK-1-mediated cofilin phosphorylation reduces the F-actin content and cofilin association with F-actin in resting platelets. In contrast, during shape change, cofilin that showed no change in its phosphorylation was rapidly associated with the actin cytoskeleton. The maximal cofilin association with actin cytoskeleton occurred before the maximal F-actin increase, suggesting that cofilin association with F-actin might regulate the turnover and actin polymerization during platelet shape change. It is an open question, whether cofilin is locally dephosphorylated before binding to F-actin during shape change. Previous studies in other cells could correlate cofilin dephosphorylation (activation) with the depolymerization of F-actin. However, in our studies cofilin dephosphorylation during the initial phase of thrombin-induced secretion (up to 30 seconds) was associated with a large increase of F-actin and a high amount of cofilin association with F-actin. Cofilin rephosphorylation after 30 seconds did not decrease F-actin content and cofilin association with F-actin. Together, in activated platelets the association of cofilin with F-actin and the F-actin increase do not simply correlate to the cofilin phosphorylation state: it seems to be more complex. It is assumed that the cofilin phosphorylation and actin dynamics are regulated in specific compartments during platelet activation. The rapid cofilin dephosphorylation in platelets was mediated by an okadaic-acid insensitive phosphatase. The activation of the cofilin phosphatase seemed to be regulated at least in part by an increase in intracellular Ca2+ and by PI3-kinase. Cofilin de- and rephosphorylation occurring upstream of secretion and platelet aggregation suggests that the enzymes regulating the cofilin phospho-cycle could be potential targets for the development of anti-thrombotic drugs.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Glucocorticoidresistenz ist ein Phänomen, das bei vielen Krankheiten eine wichtige Bedeutung hat. Insbesondere wird vermutet, dass ihr eine kausale Rolle bei depressiven Erkrankungen zukommt. In den meisten Fällen kommt die Resistenz durch eine Fehlfunktion des Glucocorticoidrezeptors zustande. Deswegen ist es von grossem Interesse, den Signalweg dieses Rezeptors im Detail zu verstehen. In der Vergangenheit wurde viel zum Verständnis beigetragen, unter anderem indem eine Reihe von GR-Regulatoren identifiziert und deren Wirkungsmechanismus aufgeklärt wurde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Faktoren zu finden, die in die GR-Signaltransduktion verwickelt sind. Dazu wurde ein funktioneller Screen durchgeführt, der darauf beruhte, GC-resistente Zellen herzustellen, diese mit responsiven Zellen zu vergleichen und damit Kandidaten zu identifizieren, die möglicherweise die GR-Funktion regulieren. Für die Herstellung hormonresistenter Zellen wurde eine humane Zelllinie hergestellt, die in Anwesenheit von Hormon nicht überleben kann; diese wurde zufallsverteilt mutiert und in GC-haltigem Medium selektiert. Drei hormonresistente Klone konnten die Selektion überleben, einer davon wurde im Detail charakterisiert, dessen Proteinexpressionsmuster mittels 2D-Gelektrophorese mit derjenigen der Ausgangszelllinie verglichen und die unterschiedlich exprimierten Faktoren mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Dies führte zur Identifikation von vier Kandidaten: Thioredoxin, hsp27, Reticulocalbin und Cofilin 1, deren Wirkung auf den GR in verschiedenen Zelllinien getestet wurde. Während die ersten drei keinen Einfluss auf den GR hatten, konnte Cofilin als neuer GR-Inhibitor etabliert werden. Cofilin ist gut untersucht als Depolymerisierungsfaktor des Actin-Cytoskeletts, eine Rolle im Signalweg des GRs oder eines anderen Transkriptionsfaktors war bis jetzt jedoch nicht bekannt. Es zeigte sich, dass seine inhibitorische Wirkung auf den GR von seiner Funktion in der Actin-Regulation abhängig war, und ausserdem, dass Cofilin eine Veränderung der intrazellulären Rezeptorverteilung vor Hormongabe bewirkte. In nachfolgenden Experimenten wurde gefunden, dass sowohl die chemische Zerstörung des Actin-Cytoskeletts wie auch die direkte Erhöhung des Anteils an freiem Actin zur GR-Inhibierung und veränderten Rezeptorverteilung führt. Des Weiteren wurde entdeckt, dass erhöhte Mengen an freiem Actin den bekannten GR-Inhibitor c-Jun induzieren, wodurch folgendes Modell aufgestellt wurde: Cofilin erhöht durch seine Actin-Depolymerisierungsfunktion freies Actin, damit wird über einen noch unbekannten Mechanismus c-Jun induziert, welches wiederum den GR inhibiert. Damit wurde über einen zellulären genetischen Screen Cofilin 1 als ein neuer GR-Regulator identifiziert und nachfolgend der inhibierende Wirkungsmechanismus von Cofilin aufgeklärt.