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Die Identifizierung unbekannter oder unvermuteter Viren in Probenmaterial stellt eine Herausforderung im Diagnostikalltag dar. Sequenzunabhängige molekulare Methoden können eine Ergänzung zu konventionellen Techniken bieten. Ziele dieser Arbeit waren die vergleichende Prüfung der sequence-independent single primer amplification (SISPA) und random-PCR als Vertreter sequenz-unabhängiger Methoden zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren und die Evaluierung ihrer Tauglichkeit als universell einsetzbare, schnelle, einfache und kostengünstige Alternativen für die Routinediagnostik. Als Modell diente das Equine Herpesvirus-1 (EHV-1), das in verschiedenen Probenmaterialien in ab-steigender Konzentration bei ansteigendem Fremd-DNA-Gehalt vorlag. Durch Schritte zur physikalischen und enzymatischen Virusanreicherung, sequenz-unabhängigen Amplifikation in Kombination mit der konventionellen Sanger-Sequenzierung und einem Datenbankabgleich sollte EHV-1 wiedergefunden werden. Trotz variabler Inhibition durch Gewebebestandteile stellte sich die Enzymbehandlung unter Einsatz einer geeigneten DNase als effektive Methode zur Elimination von Fremd-DNA heraus. Die Protektion viraler Nukleinsäuren durch Viruskapsid bzw. -hülle, die die Voraussetzung für eine erfolgreiche Durch-führung darstellte, konnte in verschiedenen Materialien gezeigt werden. Weiterhin wurde ein gradueller Verlust an viraler DNA im Verlauf beider Methoden festgestellt, der eine hohe Viruslast im Ausgangsmaterial nötig macht. Sowohl die SISPA als auch die random-PCR führten zu einem vergleichbaren Erfolg beim Virusnachweis in Zellkulturüberstand, infizierten Zellen und Lebergewebe, was für ihre Anwendbarkeit in zellarmen wie auch in zellreichen Proben spricht. Der entscheidende Faktor für den Erfolg beider Methoden schien dabei vor allem die Viruslast zu sein. Ein hoher Zellgehalt in der Probe beeinflusste die Methodik hin-gegen offenbar weniger stark. Der nachgewiesene sequenzunabhängige Charakter stellte aufgrund einer damit einhergehenden erhöhten Kontaminationsanfälligkeit einen Schwachpunkt in der Methodik der random-PCR dar. In dieser Arbeit ist es gelungen, SISPA und random-PCR erfolgreich zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren in Gewebe anzuwenden. Für die universelle Einsetzbarkeit zur Diagnostik unbekannter bzw. unvermuteter Viren sollten als nächstes geeignete Schritte der reversen Transkription und Zweitstrangsynthese erprobt werden.

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die histochemischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der Leber des Rindes mit modernen morphologischen Methoden näher zu untersuchen. Dabei sollte zugleich festgestellt werden, ob und in wie weit sich diese zwischen den einzelnen Leberlappen (Lobi hepatici) unterscheiden. Das Untersuchungsmaterial stammte von, als frei von pathologischen Befunden beurteilten Lebern frisch geschlachteter Rinder. Daraus wurden Präparate für konventionell lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen hergestellt. Als Grundlage für die konventionell lichtmikroskopischen Studien dienten Hämatoxylin-Eosin-, Masson-Goldner, Alcianblau 8GX- sowie PAS-gefärbte Schnitte. Bei den immunhistochemischen Analysen wurde der Nachweis von Zytokeratin 5, 8, 14, 18 und 19 sowie von Vimentin verfolgt. Bei den glykohistochemischen Untersuchungen kamen 14 verschiedene Lektine pflanzlicher Herkunft, deren Bindungsverhalten im Lebergewebe fluoreszenzmikroskopisch erfasst wurde zum Einsatz. Die ultrastrukturelle Analyse des Lebergewebes erfolgte transmissionselektronenmikroskopisch. Die Auswertung begann mit der konventionellen Lichtmikroskopie. Bereits die Analyse der HE-gefärbten Schnitte legte nahe, dass sich die Lobi hepatici mikroanatomisch nicht unterscheiden, was sich im Zuge der weiteren Analysen bestätigte. Die Färbung mit Alcianblau 8GX zeigte zudem zum einen das Vorkommen von Mastzellen im Bindegewebe der Rinderleber an und deutete zum anderen auf die Synthese und Sekretion von sauren Mucopolysacchariden, durch die insbesondere am Beginn des extralobulären Teils des Gallengangssystems gelegenen Epithelzellen hin. In der mit und ohne Amylasevorbehandlung durchgeführten PAS-Reaktion erwiesen sich darüber hinaus die Läppchenzentren als die Speicher des Leberglykogens, wobei deren Umfang in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation großen Schwankungen unterlag. Im Zuge der immunhistochemischen Studien konnte Zytokeratin 5 überhaupt nicht, und die Zytokeratine 8, 14, 18 und 19 nur in den Gallengangsepithelzellen nachgewiesen werden, wobei die einzelnen Zytokeratine nicht in allen Bereichen des Gallengangssystems, sondern nur in ganz bestimmten, für das jeweilige Zytokeratin individuell spezifischen Abschnitten deutlich in Erscheinung traten. Dieses Zytokeratin-Nachweismuster erlaubte unter Einbeziehung anatomischer, topographischer und morphologischer Gesichtspunkte eine Gliederung des Gallengangssystems in die überwiegend CK 8-positiven, zentralen Ductuli biliferi, die hauptsächlich CK 14-positiven, peripheren Ductuli biliferi sowie die, für die Verbindung zwischen dem intra- und extralobuären Teil des Gallengangssystems verantwortlichen, primär CK 18-positiven Ductus interlobulares biliferi kleinerer bis mittlerer Größe, und die von CK 19 dominierten Ductus interlobulares biliferi besonders großen Durchmessers. Diese sich unter Berücksichtigung des Zytokeratin-Nachweismusters ergebende Gliederung des intrahepatischen Gallengangssystems, spiegelte, mit Blick auf die Eigenschaften der einzelnen Zytokeratine, zugleich auch die embryologische Entwicklung des lichtmikroskopisch sichtbaren Teils des Gallenganssystems, beginnend mit den zentralen Ductuli biliferi bis hin zu den größten, am weitesten entwickelten Ductus interlobulares biliferi wieder. Das Auftreten der normalerweise außer für Basalzellen mehrschichtiger Epithelien nur noch für Zellarten mit mindestens bipotentem Potential typischen CK-14- Expression in den einschichtigen Gallengangsepithelien, ließ vermuten, dass auch die bovinen Gallengangsepithelzellen wenigstens zu einem gewissen Grad über bipotentes Potential verfügen. Vimentin war im gesamten Bindegewebe sowie im Endothel aller Blutgefäße nachweisbar. Im Rahmen der glykohistochemischen Untersuchungen zeigten das Endothel, insbesondere der Arterien und Sinusoide, im Vergleich zu den übrigen Strukturen des Lebergewebes den stärksten Besatz mit verschiedenartig gestalteten Glykanen. Dies war angesichts der zahlreichen Funktionen der Endothelzellen, wie etwa Aufrechterhaltung der Gewebestabilität, Mitwirkung an immunologischen Prozessen, Schaffung eines Gleichgewichtszustands zwischen Koagulation und Antikoagulation sowie Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, deren Erfüllung nur aufgrund der umfangreichen Glykokalix möglich ist, nicht überraschend. Darüber hinaus wurde eindeutig ersichtlich, dass die Zuckerketten der arteriellen, venösen und sinusoidalen Endothelzellen jeweils ganz individuell spezifische, sich von denen der anderen Gefäßarten gänzlich unterscheidende Glykane tragen, was sich darauf zurückführen ließ, dass die verschiedenen Gefäßarten verschiedene Aufgaben bevorzugt wahrnehmen. Neben den Endothelzellen stellten sich auch die Hepatozyten als Träger von verhältnismäßig vielen, verschiedenartig gestalteten Glykane dar, wobei sich deren Präsenz nicht nur auf die Glykokalix beschränkte, sondern sie auch im Golgi-Apparat, sowie im Zytoplasma selbst nachgewiesen werden konnten. Im letzten Fall bestand der Verdacht, dass es sich aufgrund des, durch die rein auf Con A begrenzte Bindungsaffinität angezeigten, hohen Mannosereichtums der Kohlenhydratstrukturen um die Glykane von lysosomalen Enzymen und von, vom Hepatozyten synthetisierten und zur Sekretion vorgesehenen Glykoproteinen und -lipiden handelte. Bei den Gallengangsepithelzellen als weiterer Zellart, die über relativ zahlreiche, verschiedenartig strukturierte Glykane verfügt, traten diese ebenfalls nicht nur als Bestandteil der Glykokalix, sondern auch im Zytoplasma in Erscheinung. Die im Zytoplasma beobachteten, ebenfalls nur Con A-positiven und damit stark Mannose reichen Glykane ließen vermuten, dass auch die Gallengangsepithelzellen neben lysosomalen Enzymen zum Export vorgesehene Makromoleküle produzieren. Als derartige Makromoleküle kamen die bereits in der Färbung mit Alcianblau 8GX nachgewiesenen, sauren Mucopolysaccaride in Betracht. Sie könnten als Gallebeimengung ähnlich wie Phospholipide die Löslichkeit des zur Kristallisation neigenden Cholesterols erhöhen. Die, mit der Größenzunahme der Gallengänge korrelierende, zunehmende Reaktionsfreudigkeit der Epitheloberfläche implizierte eine, mit dem Übergang vom iso- zum hochprismatischen Epithel einhergehende, durch den Einbau weiterer Kohlenhydratmoleküle gekennzeichnete Weiterdifferenzierung der epithelialen Glykokalix. Sie dürfte durch Rezeptor-Liganden spezifische Erkennung zur Reabsorption vorgesehener Stoffe wesentlich an der, insbesondere im Anfangsteil des Gallengangssystems stattfindenden Modifikation der Primär- zur Sekundärgalle beteiligt sein. Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen, deren Schwerpunkt auf die Parenchymzellen sowie den Disse Raum gelegt wurde, stand der Speziesvergleich im Vordergrund. Dabei zeichnete sich die Leber des Rindes durch Hepatozyten mit sehr spärlichem Mikrovillibesatz, Endothelzellen mit besonders kräftigen, trabekulären von einer kontinuierlichen Basalmembran unterlagerten Fortsätzen, Ito-Zellen mit ebenfalls sehr starken Ausläufern und wenigen, aber sehr großen Fettropfen sowie einem, von Kollagenfibrillen und Mikrofilamenten nahezu völlig freien, Disse Raum aus.

Die Superparamagnetic Iron Oxides (SPIO)-verstärkte MRT der Leber wird als sinnvolle präoperative diagnostische Methode mit einer hohen Sensitivität und Spezifität für die Detektion von fokalen Leberläsionen angewendet. Mit der SPIO-verstärkten MRT ist aber prinzipiell auch eine Differenzierung zwischen benignen und malignen fokalen Leberläsionen möglich auf der Basis ihrer zellulären Zusammensetzung und Funktion (RES-Zellen in normalem Lebergewebe und in benignen Tumoren, keine RES-Zellen in malignen Tumoren). In früheren Studien wurden die Effekte von SPIO-Kontrastmitteln fast ausschließlich auf die Detektion von Läsionen sowie die Effekte in T2-gewichteten (w) Fast-Spin Echo (FSE) und T2*-w Gradienten Echo (GRE) Sequenzen beschränkt, da SPIO hauptsächlich die T2 / T2* - Zeiten verkürzen. Ferucarbotran ist ein relativ neu zugelassenes SPIO-Kontrastmittel, welches als intravenöser Bolus appliziert werden kann und sich durch eine geringe Nebenwirkungsrate vor allem im kardiovaskulären Bereich auszeichnet. Eine dynamische T1-w Perfusionsmessung nach der Bolusapplikation von Ferucarbotran könnte Informationen über die Vaskularisation solider Tumore in der Leber liefern. Die Möglichkeit der Charakterisierung von fokalen Leberläsionen mit Hilfe der dynamischen Ferucarbotran-verstärkten MRT wurde bereits in der Literatur angedeutet und typische Befunde konnten an einer begrenzten Anzahl von Fällen für einzelne fokale Leberläsionen gezeigt werden. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung der diagnostischen Effizienz des SPIO Kontrastmittel Ferucarbotran in T2-w FSE and T2*-w GRE Sequenzen zur Charakterisierung von fokalen Leberläsionen. Das zweite Ziel war es typische Anreicherungsmuster fokaler Leberläsionen in der dynamischen T1-w MRT mit 2D-GRE and 3D-GRE VIBE Sequenzen zu beschreiben. An einem 1.5 Tesla MRT-System wurden native und kontrastverstärkte T2-w FSE and T2*-w GRE Sequenzen 10 Minuten nach Bolusinjektion von 1.4 ml Ferucarbotran bei 68 Patienten durchgeführt. An einem 1.5 Tesla MRT-System wurden T1-w dynamische Bilder bei 23 Patienten mit einer 2D-GRE Sequenz und bei 37 Patienten mit einer 3D-GRE-VIBE Sequenz akquiriert. Die endgültige Diagnose der 68 Patienten, bei denen T2-w FSE/ T2*-w GRE Sequenzen durchgeführt wurden war Hepatozelluläres Karzinom (HCC, n=29), Lebermetastasen (n=15), Cholangiozelluläres Karzinom (CCC, n=2), Hämangiom (n=6), Leberzelladenom (n=5), Fokal Noduläre Hyperplasie (FNH, n=3) und Zysten (n=8). Die endgültige Diagnose der 60 Patienten, bei denen eine T1-w dynamische Ferucarbotran-verstärkte MRT durchgeführt wurde war HCC (n=25), Lebermetastasen (n=14), CCC (n=2), Hämangiom (n=6), Leberzelladenom (n=3), FNH (n=3) and Zysten (n=7). In den T2-w FSE und T2*-w GRE Bildern wurde das Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) und das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis basierend auf Signalintensitätsmessungen in den fokalen Läsionen und dem Leberparenchym durchgeführt. Der prozentuale Signalverlust (PSIL) der verschiedenen fokalen Läsionen von der nativen zur kontrastverstärkten T2-w FSE –Sequenz wurde errechnet. Eine qualitative Auswertung der Bildqualität sowie der Abgrenzbarkeit der Läsionen im Vergleich zwischen kontrastverstärkten T2-w FSE und kontrastverstärkten T2*-w GRE Bildern erfolgte. In den T1-w dynamischen Bildern wurden Signalintensitätsmessungen im Leberparenchym, den Lebergefäßen und in fokalen Leberläsionen vorgenommen um SNR und CNR zu errechnen. Das mittlere SNR von soliden benignen Läsionen zeigte einen Abfall in der T2-w FSE Sequenz von 34.1 vor auf 21.0 (p

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Auswirkung des Befalls mit Plerocercoiden des Hechtbandwurms (Triaenophorus nodulosus) auf den Flussbarsch im Bodensee-Obersee. Im Literaturteil wird das Untersuchungsgewässer, der Bodensee vorgestellt und die Entwicklung des Barschertrags in den letzten Jahrzehnten aufgezeigt. Die Biologie des Hechtbandwurms und die Veränderungen der Leber und des Blutbildes des zweiten Zwischenwirts beim Befall mit Hechtbandwurmlarven werden beschrieben. Es folgt ein Rückblick auf die Befallssituation mit Plerocercoiden von T. nodulosus beim Flussbarsch im Bodensee-Obersee in vergangenen Jahren. In eigenen Untersuchungen wurden insgesamt 1858 Flussbarsche an verschiedenen Probestellen am Bodensee-Obersee beprobt. 95,9 % der mehrsömmrigen Barsche waren mit 4,98 Zysten und/oder freien Plerocercoiden befallen. Bei den einsömmrigen Barschen wiesen nur 33,6 % der Barsche einen Befall mit 1,98 Zysten/Plerocercoiden auf. Befallsrate und –intensität waren nicht abhängig von Standort, Saison oder Geschlecht der Barsche, stiegen aber mit zunehmendem Alter der Fische an. Neuinfektionen mit frei im Lebergewebe wandernden Plerocercoiden wurden ganzjährig bei 5 % der Barsche nachgewiesen. Barsche, die mit enzystierten und/oder freien Plerocercoiden des Hechtbandwurms befallen waren, wiesen eine höhere makroskopische und histologische Leberschädigung auf als unbefallene Barsche. Die Leberschädigung war unabhängig von Standort und Geschlecht der Barsche und stieg in den Sommermonaten und mit zunehmendem Alter der Barsche an. In 25 % der Zysten in den Barschlebern war das Plerocercoid durch die Wirtsreaktion erfolgreich eliminiert worden. Weder Befallsintensität noch Leberschädigung hatten einen negativen Effekt auf Totallänge und Gewicht der Barsche. Die Leberschädigung beeinflusste jedoch das relative Gonadengewicht der Barschrogner negativ. Außerdem sank bei den Barschen mit zunehmender Leberschädigung die Erythrozytenzahl, während die Leukozytenzahl anstieg. Bei infizierten einsömmrigen Barschen war der relative Anteil der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten erniedrigt. Die Reoligotrophierung des Bodensee-Obersees als Ursache für den hohen Befall der Barsche mit Hechtbandwurmlarven wird diskutiert. Trotz des starken Befalls mit Plerocercoiden von T. nodulosus und trotz der negativen Auswirkungen auf Leber, Blutparameter und Gonadengewicht sind die Barsche im Bodensee-Obersee derzeit in einem besseren Allgemeinzustand als vor fünf Jahren.

96 Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden stellt ein relevantes klinisches Problem nach Lebertransplantation und Leberteilresektion sowie nach hämorrhagischem Schock dar. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, daß Thrombozyten an der Ausbildung des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens beteiligt sind. Bislang liegt jedoch keine Studie vor, in welcher die Mechanismen der Interaktion von Thrombozyten mit dem postischämischen hepatischen Endothel in vivo analysiert wurden. Insbesondere ist nicht geklärt, inwiefern diese Interaktion die Induktion und den Schweregrad des hepatozellulären Schadens beeinflußt. Ziele der Studie waren daher (1) die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion nach hepatischer I/R mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie systematisch in Abhängigkeit von der Ischämie- und Reperfusionszeit quantitativ zu analysieren, (2) zu untersuchen, welche Mechanismen die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion in der Leber vermitteln und (3) zu analysieren, welchen Einfluß diese Interaktion auf den Ischämie-Reperfusionsschaden der Leber hat. An einem etablierten murinen Modell der warmen hepatischen Ischämie-Reperfusion wurde die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion mittels intravitaler Videofluoreszenzmikroskopie untersucht. Thrombozyten wurden von separaten syngenen Spendertieren isoliert, ex vivo mit Rhodamin-6G markiert, intravenös zu den jeweiligen Reperfusionszeitpunkten appliziert und bezüglich ihrer Interaktion mit dem Endothel der hepatischen Mikrogefäße quantitativ analysiert. Zur begleitenden Analyse des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens wurden die sinusoidale Perfusionsrate, die Aktivität der Leberenzyme GOT/GPT im Serum und die Apoptosemarker Caspase-3- Aktivität und Anzahl TUNEL-positiver Zellen im Lebergewebe bestimmt. Durch Verwendung P-Selektin-defizienter Tiere (sowohl Thrombozytenspender als auch Thrombozytenempfänger) wurde die Rolle von endothelialem vs. thrombozytärem PSelektin für die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion untersucht. Des weiteren wurde versucht, durch Applikation eines Fibrinogen-Antikörpers die differentielle Bedeutung von Thrombozyten im Vergleich zu Leukozyten an der Ausbildung des Organschadens der Leber nach I/R in vivo aufklären. Es konnte gezeigt werden, daß hepatische Ischämie-Reperfusion eine Interaktion von Thrombozyten mit dem Endothel in präsinusoidalen Arteriolen, Sinusoiden und postsinusoidalen Venolen induzierte. Das Ausmaß dieser Interaktion war von der Ischämiedauer abhängig, während hingegen die Reperfusionsdauer keinen wesentlichen Einfluß hatte. Die vermehrte Thrombozytenadhäsion ging mit einem signifikanten Anstieg des mikrovaskulären und zellulären Organschadens einher. Untersuchungen an P-Selektin-defizienten Tieren demonstrierten, daß das endotheliale und nicht das thrombozytäre P-Selektin das Rollen und die nachfolgende Adhärenz von Thrombozyten in Arteriolen und Venolen der Leber vermittelte. Darüberhinaus war der postischämische Organschaden in P-Selektin-defizienten Tieren signifikant reduziert. Mittels der Blockade von Fibrinogen während der Reperfusionsphase konnte gezeigt werden, daß Fibrin(ogen) die postischämische Thrombozytenadhäsion vermittelte, an der Leukozytenadhärenz jedoch nicht beteiligt war. Die selektive Hemmung der Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion führte zu einer signifikanten Reduktion des mikrovaskulären Schadens sowie der Apoptoseinduktion in der Leber nach Ischämie- Reperfusion. Somit demonstriert diese Studie erstmals in vivo, daß den Thrombozyten bei der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens eine wichtige Bedeutung zukommt.