Podcasts about phagozyten

Die von intrinsichen renalen Zellen und infiltrierenden Leukozyten exprimierten Zytokine sind zentrale Vermittler entzündlicher Nierenerkrankungen. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ist ein solches proinflamatorisches Zytokin, das in der glomerulären Entzündungsreaktion involviert ist. Die funktionelle Rolle von TNF wurde in Tiermodellen der Glomerulonephritis belegt. Die biologischen Effekte von TNF werden durch die beiden funktionell eigenständigen TNF-Rezeptoren TNFR1 (CD120a) und TNFR2 (CD120b) vermittelt. Neuere Daten zeigen, dass in Modellen einer Immunkomplex-Glomerulonephritis wie der nephrotoxische Serumnephritis die beiden TNF-Rezeptoren in vivo unterschiedliche Funktionen bei der glomerulären Entzündung vermitteln können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass Tnfr1 und Tnfr2 unterschiedliche inflammatorische TNF-Effekte in Glomeruli vermitteln. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Expression und Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Maus-Glomeruli zu charakterisieren und die Tnfr-abhängig exprimierten Entzündungsmediatoren in Maus-Glomeruli zu identifizieren. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnten selektive, Tnfr-spezifische Therapien zur Hemmung der glomerulären Entzündungsreaktion entwickelt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit die funktionelle Rolle der beiden TNF-Rezeptoren im MRL/lpr-Mausmodell der Lupusnephritis untersucht, um eine selektive Tnfr-Blockade als mögliche Therapiestrategie zu charakterisieren. Hierfür war eine Rückkreuzung von Tnfr1- und Tnfr2-defizienten C57BL/6J-Mäusen in den MRL/lpr-Hintergrund erforderlich. Um TNF-Rezeptor-1- und 2-vermittelte inflammatorische Signalwege in Glomeruli zu identifizieren wurde die Expression und die Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Mausnieren, in isolierten Glomeruli ex vivo und murinen glomerulären Endothel- und Mesangialzellen in vitro untersucht. In normaler Mausniere konnte eine Tnfr1- und Tnfr2-mRNA- und Protein-Expressionen präferentiell in Glomeruli im Vergleich zum Tubulointerstitium nachgewiesen werden. Die Expression von beiden TNF-Rezeptoren und die TNF-induzierte Induktion von Tnfr2-mRNA-Expression wurde auch in vitro sowohl in murinen glomerulären Endothel- als auch Mesangialzelllinien bestätigt. Die prominente glomeruläre TNF-Rezeptor-Expression korrelierte mit einer konstitutiven glomerulären mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen wie Icam-1, Vcam-1, E- und P-Selektin und Chemokinen wie Ccl2, Ccl3 und Ccl5. Eine intraperitoneale TNF-Injektion induzierte die Expression dieser Mediatoren präferentiell in Glomeruli. Diese in vivo TNF-Exposition führte zu einer raschen glomerulären Akkumulation von Leukozyten einschließlich Neutrophilen und mononukleären Phagozyten, die mittels einer kompartimentspezifischer Durchflußzytometrie analysiert wurden. Um Tnfr-abhängige inflammatorische Effekte in intrinsischen glomerulären Zellen unabhängig von infiltrierenden Leukozyten zu untersuchen, wurde eine Microarray-Gene-Expressionsanalyse an intakten Glomeruli durchgeführt, die aus Wildtyp und Tnfr-defizienten Mäusen isoliert und anschließend mit TNF ex vivo stimuliert wurden. Die meisten TNF-Effekte wurden ausschließlich durch Tnfr1 vermittelt, unter anderem die induzierte mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen, proinflammatorischen Chemokinen, Komplement-Faktoren und proapoptotischen Molekülen. Im Gegensatz dazu fanden wir nur vier Tnfr2-abhängig exprimierte Gene, einschließlich einer kleinen GTPase der Rab-Familie (Rab6b). Diese Ergebnisse wurden durch quantitative RT-PCR-Analysen von TNF-stimulierten Glomeruli und primären Mesangialzellen bestätigt. Weitere Untersuchungen zeigten allerdings auch einen Beitrag von Tnfr2 bei der gesteigerten glomerulären Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokine nach Stimulation mit niedrigen TNF-Konzentrationen auf. Im Gegensatz zur Wildtyp-Kontrolle fehlte in TNF-stimulierten Tnfr1-defizienten Glomeruli die Sekretion verschiedener proinflammatorischer Chemokine beinahe vollständig. Interessanterweise war die Proteinexpression auch in Tnfr2-defizienten Glomeruli signifikant herunterreguliert. Folglich sind die meisten inflammatorischen TNF-Effekte in Glomeruli via Tnfr1 durch die induzierte Expression von proinfammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmolekülen und Chemokinen vermittelt. Darüber hinaus dürfte Tnfr2 zu dieser inflammatorischen Antwort beitragen, wenn Glomeruli niedrigen TNF-Konzentrationen ausgesetzt sind. Ferner scheint Tnfr2 posttranskriptionell die Chemokinsekretion in Glomeruli nach einer TNF-Exposition zu beeinflussen, möglicherweise durch die Tnfr2-abhängig exprimierte Rab GTPase Rab6b, die am intrazellulären Transport und der Sekretion von inflammatorischen Molekulen beteiligt sein könnte. In Bezug auf Tnfr-spezifische, anti-inflammatorische Therapien weisen die hier präsentierten Ergebnisse somit darauf hin, dass eine selektive Tnfr1-Blockade eine glomeruläre, insbesondere durch Granulozyten und Makrophagen vermittelte Entzündung verbessern könnte, möglicherweise bei geringer Hemmung immunregulatorischer und antimikrobieller Funktionen von TNF, die redundant durch Tnfr2 vermittelt werden könnten. Dagegen erscheint aufgrund der erhobenen Daten im MRL/lpr-Mausmodell eine Blockade von TNF oder beider Rezeptoren bei der Lupusnephritis, in der glomeruläre Neutrophileninfiltrate keine entzündliche Rolle spielen, weniger erfolgversprechend. Gleichzeitig weisen die vorliegenden Ergebnisse auf eine immunsuppressive, die systemische Immunreaktivität beim SLE begrenzende Funktion von Tnfr2 hin.

Die Krankheitsentität Lupus erythematodes in ihren verschiedenen Unterformen beschreibt eine autoimmunologische Systemerkrankung der Haut und des Gefäßbindegewebes. Für ihre Ätiopathogenese scheinen bestimmte Umweltfaktoren wie Infektionen, Medikamente, Chemikalien oder UV-Strahlung verantwortlich zu sein, die im Zusammenspiel mit einer gleichzeitig vorhandenen genetischen Disposition eine Veränderung in der Regulation der Immunantwort bewirken. Die daraus resultierende Störung der Selbst- und Fremderkennung äußert sich in einer überschießenden Produktion von Autoantikörpern, nicht-organspezifischen Komplementbindungsreaktionen und einer verminderten zellulären Immunität. Endgültig sind die Entstehungsmechanismen, die letztlich zu einem Verlust der Selbsttoleranz führen, in ihrer Komplexität bisher nicht aufgeklärt. Für die genetische Prädisposition zur Entwicklung einer Autoimmunreaktion scheinen verschiedene Kandidatengene von besonderer Bedeutung zu sein. Um die Vermutung zu bestätigen, dass eine Fehlfunktion der Apoptose maßgeblich an der Ätiopathogenese des Lupus erythematodes beteiligt ist, versucht die aktuelle Forschung, einen direkten Zusammenhang der Apoptose-induzierenden Gene, wie Fas, FasL, bcl-2 und DNAse1 mit einer gesteigerten Suszeptibilität für Autoimmunerkrankungen nachzuweisen. Inwieweit immungenetische Variationen auf Einzelnukleotidebene die unterschiedlichen Ausprägungsformen einer Autoimmunreaktion beeinflussen können und sich im klinischen Bild einer Erkrankung widerspiegeln, ist dabei von besonderem Interesse. Ziel dieser Arbeit war, aus der Untersuchung eines funktionellen Einzelnukleotidpolymorphismus in der Promotorregion des Gens für den Fas-Rezeptor abzuleiten, ob eine Assoziation zwischen dem programmierten Zelltod und der Krankheit Lupus erythematodes in ihren Subtypen besteht. Die Suche nach Hinweisen auf einen Zusammenhang mit einer gesteigerten Lichtempfindlichkeit sowie einem bestimmten Autoantikörperprofil im Serum sollte dabei im Mittelpunkt stehen. Der Bildung von Autoantikörpern beim Lupus erythematodes scheint ein vermehrter Anfall von zirkulierenden Zellkernantigenen durch vermehrten Zelluntergang durch Apoptose sowie eine ungenügende Beseitigung des apoptotischen Zellmaterials durch Phagozyten zu Grunde zu liegen. Auch die Entwicklung einer gesteigerten Lichtempfindlichkeit ist über diesen Mechanismus zu verstehen. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen einen direkten Zusammenhang der Erkrankung Lupus erythematodes mit dem A-homozygoten Genotyp im untersuchten Fas-Gen-Promotor-Einzelnukleotidpolymorphismus vermuten. Bei genauerer Differenzierung des Patienten-kollektivs nach den einzelnen Lupussubtypen zeigte sich, dass diese Assoziation sich im Besonderen auf den systemischen Lupus erythematodes bezieht. Dadurch wird die Annahme bekräftigt, dass der programmierte Zelltod maßgeblich zur Induktion einer Autoantikörperproduktion beiträgt, die gerade bei der systemischen Form des Lupus erythematodes das klinische Ausmaß bestimmt. Unabhängig von der jeweiligen Lupuserkrankungsform ergab diese Arbeit weiterhin ein signifikant gehäuftes Vorkommen des Genotyps AA bei Patienten mit einem positiven Ro-Autoantikörpertiter. Dadurch wird ein direkter Zusammenhang zwischen der Bildung von Autoantikörpern gegen Ro-Ribonukleoproteine und der A-Homozygotie des untersuchten Fas-Gen-Promotor-Einzelnukleotidpolymorphismus wahrscheinlich. Eine mögliche Assoziation zwischen dem programmierten Zelltod und einer gesteigerten Lichtempfindlichkeit bei Patienten mit Lupus erythematodes kann in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Es bleibt weiteren Studien in der Zukunft überlassen, diese Ergebnisse durch Untersuchung eines deutlich größeren Patientenkollektivs zu relativieren und neue Ansatzpunkte zur vollständigen Aufklärung der Ätiopathogenese der Autoimmunreaktion bei Lupus erythematodes zu finden.

Bisher wird in der Literatur keine standardisierte tierexperimentelle Methode beschrieben, mit der in der Frühphase der Knochenheilung ausreichend interfragmentäres Gewebevolumen für die histologische, biochemische oder immunocytochemische Analyse gewonnen werden kann. Es wird ein entsprechend variiertes Distanzosteosynthesemodell vorgestellt, das aus dem Frakturbereich der Kaninchentibia ausreichend Gewebe für differenzierte Analysen liefert. Mit guter Vaskularität, hoher Knochenappositionsrate sowie schneller Zellproliferation und –differenzierung scheint der Kaninchenknochen für relativ begrenzte Untersuchungszeiträume und für Fragestellungen zur Frühphase der Knochenheilung besonders geeignet. Untersuchungen an diesem Modell zum qualitativen und quantitativen Nachweis unterschiedlicher Zellen im interfragmentären Raum zu verschiedenen Zeitpunkten der Frakturheilung werden beschrieben, besondes berücksichtigt dabei neuropeptidpositive Nervenfasern, vor allem das Calcitonin gene-related peptide (CGRP). Daten und Fakten zu Vorkommen, Verteilung, Struktur, Sequenz und Biochemie des Peptids, wie sie die aktuelle internationale Literatur dokumentiert, ergänzen den experimentellen Teil der Arbeit. An der Tibia von insgesamt 30 Tieren wurde – in einem standardisierten operativen Verfahren – ein definierter interfragmentärer Raum geschaffen. Nach Ablauf des vorgesehenen Beobachtungszeitraumes erfolgte die Tötung der Tiere vor Entnahme des jeweiligen Präparates. Nach Freilegen der Osteosynthese wurde im interfragmentären Raum ein definiertes 3mm dickes zylinderförmiges Segment entnommen und fixiert; außerdem wurden jeweils osteotomienah und –fern zwei weitere Gewebeproben aus dem Markraum der Tibia isoliert. Die anschließenden Untersuchungen im gewonnenen Material umfaßten mikroskopische Analysen der Morphologie von Hämatom, Fibringerüst, Granulationsgewebe während unterschiedlicher Phasen der Frakturheilung, die immunocytochemische Darstellung neuropeptidpositiver Fasern und mikroskopische qualitative und quantitative Analysen neuropeptidpositiver Fasern zu den gewählten Zeitpunkten. Bei den nach 5 Tagen getöteten Tieren fanden sich in den untersuchten Präparaten vor allem ein konsolidiertes Frakturhämatom. Ein feines Fibrinnetz war in den Randgebieten des interfragmentären Raumes zu sehen. Gefäßlakunen, Kapillaren und Mineralisationsinseln waren nicht erkennbar. In der zweiten Tiergruppe konnte gezeigt werden, daß nach 10 Tagen der Abbau schollig zerfallener Erythrozyten durch Phagozyten weiter vorangeschritten war; Der Zellgehalt verringerte sich insgesamt zugunsten einer beginnenden Faserbildung. Das Fibrinnetz hatte weiter zugenommen und zeigte vereinzelt Septen; Am 15. Tag postop. war das Fibrinnetz nicht mehr erkennbar, stattdessen neu entstandenes Bindegewebe, Gefäßstrukturen und vereinzelte Mineralisations-inseln. Perivaskulär, an den Gefäßsinusoiden und begleitend zu Precursorzell-ansammlungen ließen sich frühestens am 10. und spätestens am 15. Tag nach der Osteotomie mit Hilfe immunocytochemischer Verfahren neuropeptidpositive Fasern nachweisen. In diesen Untersuchungen konnte CGRP im Gegensatz zu bisher durchgeführten Versuchen unterschiedlicher Autoren erstmals schon in der Frühphase der Frakturheilung nachweisen werden. Dies ist von besonderer Bedeutung, da die Innnervation des Knochens ein hochentwickeltes regulatorisches Element repräsentiert, das sowohl lokale Anforderungen registriert wie auch durch Freisetzung aktiver Neuropeptide den gesamten Knochenstoffwechsel unmittelbar beeinflußt. Wie aus früheren Studien hervorgeht, sind Neuropeptide dort zahlreich vorhanden, wo hohe Knochenstoffwechselraten zu verzeichnen sind. Außerdem sind sie häufig in unmittelbarer Nähe von Blutgefäßen konzentriert. Die Beobachtung, daß CGRP während der frühen Frakturheilung hauptsächlich in der Nähe von Blutgefäßen auftritt, legt den Schluß nahe, daß es durch seine bekannten vasodilatierenden Eigenschaften den Blutfluß in die verletzte Region verstärkt und so die Knochenheilung unterstützt. Experimentelle Untersuchungen zeigen, daß neurale Einflüsse auf den Knochen von Neuropeptiden vermittelt werden. Wie alle regulativen Proteine und Faktoren agieren Neuropeptide über Second-messenger-Systeme und können auch in niedrigen Konzentrationen das Remodeling beeinflussen. Durch ihre sensorische Funktion nehmen Nervenfasern mechanische Ansprüche wahr und setzen im weiteren Verlauf Neuropeptide frei. Sie sind in der Lage, die Lücke zwischen systemischen und primär lokalen regulativen Elementen zu füllen. Grundsätzlich ist die Selbstheilung des Knochens durch die Größe des Defekts limitiert. Meist sind chirugische Interventionen nötig und die unterschiedlichsten Hilfsmittel unumgänglich. In jüngster Zeit sind v.a. Knochenersatzmaterialien von zunehmender Bedeutung. Ihre Zukunft scheint in der Entwicklung osteoinduktiver Implantate zu liegen. Auch unter diesem Aspekt gewinnt unser Distanzosteosynthesemodell besondere Bedeutung. Der große interfragmentäre Raum bietet optimale Bedingungen für gezielte Untersuchungen, die zur Weiterentwicklung von Knochen-ersatzmaterialien führen können.