Podcasts about zytokin

Positive Gefühle führen zu einem niedrigeren Pegel von proinflammatorischen Zytokinen (Botenstoffe der Immunzellen, die nicht nur Entzündungen und Müdigkeit verursachen können, sondern auch -wenn dauernd erhöht- Diabetes, Depression, Herz-Kreislauferkrankungen…).  Die Psychologin Stellar hat mit ihren Kollegen niedrigere Pegel von Interleukin 6 – ein proinflamm. Zytokin- bei der Empfindung, insbesondere, dieser pos. Emotionen: Ehrfurcht (im Sinne von Staunen – Englisch „Awe“), Zufriedenheit, Stolz, Freude.  Auch Fibromyalgie wird vom Empfinden positiver Emotionen positiv beeinflusst.Hier unten findest du die Links zu beiden spannenden Studien.Hast Du Fragen? Rückmeldungen? Wünschst du dir, dass wir über ein bestimmtes Thema sprechen, liegt dir etwas besonders am Herzen? Ich freue mich auf deine Nachricht, hier unten, oder auf www.sanalucia.de/anfrage Studien – zum Nachlesen: https://www.researchgate.net/publication/262812369_Virtual_Reality_for_the_Induction_of_Positive_Emotions_in_the_Treatment_of_Fibromyalgia_A_Pilot_Study_over_Acceptability_Satisfaction_and_the_Effect_of_Virtual_Reality_on_Mood Stellar, J. E., John-Henderson, N., Anderson, C. L., Gordon, A. M., McNeil, G. D., & Keltner, D. (2015, January 19). Positive Affect and Markers of Inflammation: Discrete Positive Emotions Predict Lower Levels of Inflammatory Cytokines. Emotion. Advance online publication. http://dx.doi.org/10.1037/emo0000033 Motto: Was ein Mensch an Gutem in die Welt hinausgibt, geht nicht verloren. Albert Schweitzer Musik: musicfox.com

Unsere Körperabwehr soll uns vor dem neuen Coronavirus schützen. Bei schwerstkranken Covid-19-Patienten tut sie jedoch oft das genaue Gegenteil: Es gerät außer Kontrolle. Welche Rolle das Immunsystem für die verschiedenen Verläufe bei Kindern und Alten spielt, und was das dann für mögliche Impfstoffe bedeutet.

Fri, 11 Mar 2016 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19244/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19244/1/Meyer_Christian.pdf Meyer, Christian

Die von intrinsichen renalen Zellen und infiltrierenden Leukozyten exprimierten Zytokine sind zentrale Vermittler entzündlicher Nierenerkrankungen. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ist ein solches proinflamatorisches Zytokin, das in der glomerulären Entzündungsreaktion involviert ist. Die funktionelle Rolle von TNF wurde in Tiermodellen der Glomerulonephritis belegt. Die biologischen Effekte von TNF werden durch die beiden funktionell eigenständigen TNF-Rezeptoren TNFR1 (CD120a) und TNFR2 (CD120b) vermittelt. Neuere Daten zeigen, dass in Modellen einer Immunkomplex-Glomerulonephritis wie der nephrotoxische Serumnephritis die beiden TNF-Rezeptoren in vivo unterschiedliche Funktionen bei der glomerulären Entzündung vermitteln können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass Tnfr1 und Tnfr2 unterschiedliche inflammatorische TNF-Effekte in Glomeruli vermitteln. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Expression und Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Maus-Glomeruli zu charakterisieren und die Tnfr-abhängig exprimierten Entzündungsmediatoren in Maus-Glomeruli zu identifizieren. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnten selektive, Tnfr-spezifische Therapien zur Hemmung der glomerulären Entzündungsreaktion entwickelt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit die funktionelle Rolle der beiden TNF-Rezeptoren im MRL/lpr-Mausmodell der Lupusnephritis untersucht, um eine selektive Tnfr-Blockade als mögliche Therapiestrategie zu charakterisieren. Hierfür war eine Rückkreuzung von Tnfr1- und Tnfr2-defizienten C57BL/6J-Mäusen in den MRL/lpr-Hintergrund erforderlich. Um TNF-Rezeptor-1- und 2-vermittelte inflammatorische Signalwege in Glomeruli zu identifizieren wurde die Expression und die Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Mausnieren, in isolierten Glomeruli ex vivo und murinen glomerulären Endothel- und Mesangialzellen in vitro untersucht. In normaler Mausniere konnte eine Tnfr1- und Tnfr2-mRNA- und Protein-Expressionen präferentiell in Glomeruli im Vergleich zum Tubulointerstitium nachgewiesen werden. Die Expression von beiden TNF-Rezeptoren und die TNF-induzierte Induktion von Tnfr2-mRNA-Expression wurde auch in vitro sowohl in murinen glomerulären Endothel- als auch Mesangialzelllinien bestätigt. Die prominente glomeruläre TNF-Rezeptor-Expression korrelierte mit einer konstitutiven glomerulären mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen wie Icam-1, Vcam-1, E- und P-Selektin und Chemokinen wie Ccl2, Ccl3 und Ccl5. Eine intraperitoneale TNF-Injektion induzierte die Expression dieser Mediatoren präferentiell in Glomeruli. Diese in vivo TNF-Exposition führte zu einer raschen glomerulären Akkumulation von Leukozyten einschließlich Neutrophilen und mononukleären Phagozyten, die mittels einer kompartimentspezifischer Durchflußzytometrie analysiert wurden. Um Tnfr-abhängige inflammatorische Effekte in intrinsischen glomerulären Zellen unabhängig von infiltrierenden Leukozyten zu untersuchen, wurde eine Microarray-Gene-Expressionsanalyse an intakten Glomeruli durchgeführt, die aus Wildtyp und Tnfr-defizienten Mäusen isoliert und anschließend mit TNF ex vivo stimuliert wurden. Die meisten TNF-Effekte wurden ausschließlich durch Tnfr1 vermittelt, unter anderem die induzierte mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen, proinflammatorischen Chemokinen, Komplement-Faktoren und proapoptotischen Molekülen. Im Gegensatz dazu fanden wir nur vier Tnfr2-abhängig exprimierte Gene, einschließlich einer kleinen GTPase der Rab-Familie (Rab6b). Diese Ergebnisse wurden durch quantitative RT-PCR-Analysen von TNF-stimulierten Glomeruli und primären Mesangialzellen bestätigt. Weitere Untersuchungen zeigten allerdings auch einen Beitrag von Tnfr2 bei der gesteigerten glomerulären Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokine nach Stimulation mit niedrigen TNF-Konzentrationen auf. Im Gegensatz zur Wildtyp-Kontrolle fehlte in TNF-stimulierten Tnfr1-defizienten Glomeruli die Sekretion verschiedener proinflammatorischer Chemokine beinahe vollständig. Interessanterweise war die Proteinexpression auch in Tnfr2-defizienten Glomeruli signifikant herunterreguliert. Folglich sind die meisten inflammatorischen TNF-Effekte in Glomeruli via Tnfr1 durch die induzierte Expression von proinfammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmolekülen und Chemokinen vermittelt. Darüber hinaus dürfte Tnfr2 zu dieser inflammatorischen Antwort beitragen, wenn Glomeruli niedrigen TNF-Konzentrationen ausgesetzt sind. Ferner scheint Tnfr2 posttranskriptionell die Chemokinsekretion in Glomeruli nach einer TNF-Exposition zu beeinflussen, möglicherweise durch die Tnfr2-abhängig exprimierte Rab GTPase Rab6b, die am intrazellulären Transport und der Sekretion von inflammatorischen Molekulen beteiligt sein könnte. In Bezug auf Tnfr-spezifische, anti-inflammatorische Therapien weisen die hier präsentierten Ergebnisse somit darauf hin, dass eine selektive Tnfr1-Blockade eine glomeruläre, insbesondere durch Granulozyten und Makrophagen vermittelte Entzündung verbessern könnte, möglicherweise bei geringer Hemmung immunregulatorischer und antimikrobieller Funktionen von TNF, die redundant durch Tnfr2 vermittelt werden könnten. Dagegen erscheint aufgrund der erhobenen Daten im MRL/lpr-Mausmodell eine Blockade von TNF oder beider Rezeptoren bei der Lupusnephritis, in der glomeruläre Neutrophileninfiltrate keine entzündliche Rolle spielen, weniger erfolgversprechend. Gleichzeitig weisen die vorliegenden Ergebnisse auf eine immunsuppressive, die systemische Immunreaktivität beim SLE begrenzende Funktion von Tnfr2 hin.

Sat, 30 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13318/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13318/1/Hainke_Susanne.pdf Hainke, Susanne dd

Sat, 12 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12978/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12978/1/Hoeksma_Antje.pdf Hoeksma, Antje

Sat, 24 Jul 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14771/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14771/1/Walsch_Florian.pdf Walsch, Florian Markus

Trotz verbesserter Therapiemöglichkeiten ist die Prognose beim Fibrosarkom der Katze noch immer ungünstig. In der vorliegenden Arbeit sollte die Verträglichkeit eines neuen Therapieansatzes zur Behandlung des felinen Fibrosarkoms untersucht werden. Verwendet wurde ein nonviraler Gentransfer mittels Magnetofektion, um eine Transfektion mit dem felinen Zytokingen GM-CSF zu erreichen. Ziel der durchgeführten Phase-I-Studie war die Festlegung einer maximalen tolerierten Dosis. In die prospektive Dosis-Eskalations-Studie wurden Katzen, die definierte Einschlusskriterien erfüllten, aufgenommen. Die Steigerung der Dosis des Plasmids, das für feGM-CSF kodiert, erfolgte in vier festgelegten Schritten (50, 250, 750 und 1250 µg Plasmid). Jeweils vier Katzen wurden in eine Dosisgruppe aufgenommen. Die Plasmide wurden in wässriger Lösung in einem 1:1-Verhältnis mit magnetischen Nanopartikeln gemischt, die zur besseren Bindung an die DNA mit Polyethylenimin beschichtet waren. Die Plasmidlösung mit einem Volumen von 500 µl wurde intratumoral injiziert. Danach wurde durch Applikation eines Neodymium-Eisen-Bor-Magneten auf das Tumorgebiet ein Magnetfeld für die Dauer einer Stunde angelegt. Durch diese Magnetofektion wurde die Transfektion auf das Tumorgebiet beschränkt, sowie die Effektivität des Gentransfers verbessert. Das Behandlungsprotokoll umfasste zwei intratumorale Injektionen an den Tagen -14 und -7 sowie die großräumige en-bloc-Resektion des Fibrosarkoms an Tag 1. Eine Kontrollgruppe bestehend aus vier Katzen wurde ohne Zusatztherapie einer Operation unterzogen. Aus ethischen Gründen wurde dabei auf eine Verzögerung der chirurgischen Entfernung durch Placebo-Applikationen im Zeitraum von 14 Tagen verzichtet. Eine Untersuchung auf mögliche auftretende Toxizitäten erfolgte an den Tagen -7, 0, 14, 45, 90 und 180. Zwei weitere Untersuchungen an den Tagen 270 und 360 dienten zur Kontrolle auf Rezidiv- und Metastasenbildung. Aufgetretene klinische oder hämatologische Toxizitäten wurden anhand eines speziellen Nebenwirkungskatalogs (VCOG-CTCAE-Tabelle) erfasst und in Korrelation zur durchgeführten Therapie gestellt, um über eine Zuordnung als Nebenwirkung entscheiden zu können. Ein statistischer Vergleich erfolgte für die Parameter Körpergewicht, Leukozytenzahl und das Differentialblutbild zwischen Kontrollkatzen, behandelten Katzen und den Katzen der verschiedenen Dosisgruppen. Sieben weitere Katzen wurden mit derselben Gentherapie mit humanem GM-CSF behandelt, bei denen der Expressionsachweis von huGM-CSF mittels ELISA in den Zellkulturüberständen der angezüchteten Tumore gelang. In den ersten drei Dosisgruppen traten keine schwerwiegenden Nebenwirkungen auf. Da bei drei der vier Katzen der höchsten Dosis leichte Nebenwirkungen beobachtet wurden, wurden zwei weitere Katzen mit der höchsten Dosis behandelt. Dabei traten jedoch keine Toxizitäten auf, so dass die Dosis von 1250 µg für feGM-CSF kodierendes Plasmid als sichere, gut verträgliche Dosis für nachfolgende Phase-II-Studien festgelegt werden konnte. Auch die beobachteten Ergebnisse bezüglich Rezidivrate sind als sehr viel versprechend einzustufen.

The prognosis for cats with fibrosarcoma is still poor as the treatment options existing to date do not lead to satisfying results. After sole surgical removal of the tumor, up to 70 % of the cats develop local recurrences. Even with adjuvant radiation and/or chemotherapy, the recurrence rate can just be reduced to at most 40 %. In the present work an alternative treatment method in terms of neoadjuvant immunostimulatory gene therapy should be established. Via plasmids, three feline cytokine genes were transferred into the tumor. The plasmids coded for feIL-2, feIFN-γ and feGM-CSF. Using magnetofection, gene transfer should be optimized. The aim of this clinical dose escalation study was to define a well tolerated dose, which can be tested for its efficacy in a subsequent phase-II trial. Therefore the cats were examined at defined time points for treatment-related toxicity up to 180 days after surgery. Two more check-ups on day 270 and 360 after surgery were performed to elongate the observation period for local recurrences. Prerequisite for a cat’s admission to the study was the localization of the fibrosarcoma (primary tumor or recurrence) on the trunk. The tumor had to be excised in one setting without limb amputation. Affected cats were neither allowed to be pretreated with chemo-, radiation- or gene therapy nor with corticosteroids within the past six weeks. Further exclusion criteria were hints for metastases or other severe illnesses which reduce life expectancy to less than one year. Due to the potential teratogenic effect of the expressed cytokines, pregnancy had to be ruled out. Only cats with histopathologically confirmed fibrosarcoma continued the study after surgery. As this was a scientific study with a drug not registered yet, written informed consent from the owners was a prerequisite for the participation of each cat. Four treatment groups with defined dose escalation were prospectively fixed. The dose of the feline cytokines was 15, 50, 150 and 450 µg per plasmid in group I, II, III and IV. The initial dose (3 x 15 µg) was oriented to the total dose for small oral melanomas in dogs (400 µg) established by DOW et al. and is 1/10 of it. Plasmids as non-viral vectors were chosen for several reasons. Their handling is not liable to such strict regulations as the potentially more dangerous viral vectors. Their production is simple and affordable. They induce fewer side effects than viral vectors. Therefore plasmids are more suitable for application in veterinary clinical practice. Equal amounts of the plasmids were brought into 0.9 % saline. The positively charged magnetic nanoparticles were brought into solution with aqua for injections and were mixed with the plasmid formulation in a 1:1 ratio. This formulation had a total volume of 500 µl and was injected twice intratumorally in weekly intervals. Transfection was enhanced and targeted to the tumor area by the application of a neodymium-iron-boron magnet for the duration of 60 minutes. One week after the second application, wide en-bloc resection of the tumor was performed. Four cats were assigned to each treatment group. As questionable toxicity occured in group IV, four more cats were added to this group. A control group also consisting of four cats received surgery without neoadjuvant therapy. For ethical reasons, the application of empty plasmids was avoided so that in this group surgery could be performed without delay. Medical care of all the cats was carried out by the same team of internists, anesthetists and surgeons. Clinical and laboratory parameters were evaluated according to the VCOG-CTCAE system. All adverse events were registered, classified with severity grades and correlated to treatment. Plasma samples of all cats up to 14 days after surgery were examined for the existence of feGM-CSF and feIFN-γ with commercially available ELISA kits. Statistical analyses were performed comparing the treatment groups themselves as well as treatment groups and the control group regarding body weight, white blood cells and differential blood counts. Only one cat out of group IV showed adverse events during the neoadjuvant treatment period, which were classified as grade 3 and which were probably correlated to treatment (correlation grade 4). For this reason four more cats were treated with the highest dose. None of these cats showed side effects that could be correlate to treatment. The occurrence of early recurrences in four cats of group IV was outstanding, but of course, the expressiveness of this statement is low regarding the small group sizes. However it is known that biological drugs, especially IL-2, often do not have a linear dose-response profile. Therefore the optimal effective dose lies within a strictly defined area and is probably lower than the maximal tolerated dose. The highest applied dose which is 450 µg per plasmid was defined as a well tolerated dose. It can be safely tested for its efficacy in a subsequent phase-II trial. Because of the reflections mentioned above it would undoubtedly be convenient to test the third dose (150 µg per plasmid) in parallel for its effectiveness.

Thu, 20 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8234/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8234/1/Raziorrouh_Bijan.pdf Raziorrouh, Bijan

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel, welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF, bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne (A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin. Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw. mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten. Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U. eine klinische Relevanz haben könnten.

Trotz des Einsatzes verschiedenster sehr potenter Antibiotika und Antiphlogistika in Verbindung mit einer ausgereiften Intensivmedizinischen Betreuung ist die Sepsis sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin heute immer noch eine der häufigsten Todesursachen. Die Immunpathogenese der Erkrankung ist gekennzeichnet durch eine systemische Entzündungsreaktion, hervorgerufen durch eine frühe Sekretion des Zytokins Tumor Nekrose Faktor alpha (TNFα). Im Vergleich zu TNFα gilt dagegen das erst kürzlich entdeckte Zytokin High Mobility Group Box 1 (HMGB1) als später proinflammatorischer Faktor. Um nun die Rolle dieser beiden Zytokine in der caninen Sepsis näher zu untersuchen, wurden neue sensitive Nachweismethoden etabliert und zusätzlich zwei bereits kommerziell erhältliche Substanzen aus der Humanmedizin zur Neutralisation von caninem TNFα in vitro getestet. Anhand bereits publizierter Sequenzen und mit Hilfe der Ensembl Datenbank konnten per PCR die Sequenzen für canines TNFα, TNFR1 (P60), HMGB1 und dessen Rezeptor RAGE kloniert und die Proteine rekombinant exprimiert werden. Die Bioaktivität und die Konzentration des rcanTNFα wurden in einem Zytotoxizitäts Assay mit der Zelllinie WEHI164 getestet. Die Bioaktivität des P60-Fc Fusionsproteins wurde durch seine neutralisierende Wirkung auf das zytotoxische rcanTNFα im gleichen Assay nachgewiesen. Mit Hilfe des P60-Fc Fusionsproteins und einem kommerziellen biotinylierten Ziege-anti-Hund TNFα Antikörper konnte ein entsprechender sensitiver ELISA aufgebaut werden. Gleichzeitig wurden ebenfalls im WEHI-Bioassay die zwei humanen anti-TNFα Therapeutika Infliximab und Ethanercept auf ihre Eigenschaft zur Bindung und Neutralisation von caninem TNFα hin getestet Nur Ethanercept konnte dabei das Zytokin binden und neutralisieren. Anschließend wurden Plasmaproben von 79 klinisch an Sepsis erkrankten Hunden analysiert und im TNFα ELISA quantifiziert. Keine der untersuchten Proben wies dabei jedoch einen erhöhten Spiegel an TNFα im Plasma auf. Aus diesem Grund wurden nun auch mit Hilfe zweier polyklonaler Seren gegen rcanHMGB1 und gegen eine spezifische Peptidsequenz des Zytokins ein Western Blot Verfahren und ein Capture ELISA für die Messung von HMGB1 aufgebaut. HMGB1 konnte dabei allerdings sowohl bei gesunden als auch bei sepsiskranken Hunden in vergleichbaren Mengen nachgewiesen werden.

In der vorliegenden Dissertation wurde die Stabilitätsproblematik therapeutischer Proteine am Beispiel zweier Entwicklungssubstanzen, der Immunzytokine huKS-IL 2 und hu14.18-IL 2, erörtert. Bei beiden Molekülen handelt es sich um neuartige Fusionsproteine, in denen eine variable Antikörper-Komponente mit jeweils zwei Interleukin-2 Resten verknüpft ist. Ziel der Untersuchungen war es, das Abbauverhalten der Substanzen näher zu charakterisieren und destabilisierende Einflussfaktoren zu identifizieren. Im Fokus der Arbeit stand die Frage, inwiefern sich das Stabilitätsverhalten der Fusionsproteine gegenüber den einzelnen Proteinkomponenten verändert und welche Auswirkungen eine Variation der Molekülbestandteile auf die Stabilität der Konstrukte hat. Hierzu wurden den Stabilitätsstudien von huKS-IL 2 und hu14.18-IL 2 Untersuchungen mit den monoklonalen Antikörpern huKS und hu14.18 bzw. mit Interleukin-2 gegenübergestellt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, eine lagerstabile flüssige oder gefriergetrocknete Formulierung für huKS-IL 2 und hu14.18-IL 2 zu entwickeln, wobei im Rahmen der Rezepturfindung neben etablierten Excipienten auch einige neuartige Hilfsstoffe erprobt wurden. Der letzte Teil dieser Dissertation befasste sich schließlich mit der Frage, inwiefern für huKS-IL 2 und hu14.18-IL 2 Stabilitätsvorhersagen aufgrund beschleunigter Haltbarkeitsstudien getroffen werden können. Hierbei wurde die Anwendbarkeit der klassischen isothermen Methode sowie einer nonisothermen Methode getestet.

Das feline Fibrosarkom hat mit einer Rezidivneigung von bis zu 70 % nach alleiniger chirurgischer Entfernung eine ungünstige Heilungsprognose. Auch adjuvante Chemo- oder Strahlentherapien führen nur in 42 % der Patienten zu einer rezidivfreien Zeit von über einem Jahr. In der vorliegenden Arbeit soll ein nonvirales Gentransfersystem etabliert werden, bei dem erstmalig eine Kombination aus drei felinen Zytokin-Genen zur adjuvanten Immunstimulation nach Tumorexstirpation beim Fibrosarkom der Katze eingesetzt wird. Ziel dieser Studie ist die Festlegung einer maximal tolerierten Dosis. Mit Hilfe eines Nebenwirkungskataloges, der auf der Common-Toxicity-Criteria-Tabelle des National Cancer Instiute basiert, werden klinische wie auch labordiagnostische Parameter objektiv erfasst und in Relation zur Therapie gestellt. Nach definierten Aufnahmekriterien werden Katzen mit Fibrosarkomen von prak-tischen Tierärzten an die Medizinische Kleintierklinik überwiesen. Es werden nur Tiere in die Studie aufgenommen, deren Tumoren (Primärtumor oder Rezidiv) am Rumpf lokalisiert sind. Die Tumorexstirpation muss in einer Sitzung möglich sein und darf dabei weder zu einer Gliedmaßenamputation noch zur Eröffnung einer Körperhöhle führen. Katzen, bei denen Hinweise auf Metastasen oder eine andere schwere Krankheit vorliegen, sowie Tiere, die bereits zuvor mit einer Chemo-, Strahlen- oder Gentherapie behandelt wurden, können nicht in die Studie aufge-nommen werden. Nach Tumorexstirpation wird den Tieren ein Kollagenschwamm in das Tumorbett implantiert. Dieser Kollagenschwamm trägt Plasmide, die jeweils für feIL-2, feIFNγ und feGM-CSF kodieren. Die Plasmid-DNA ist zusätzlich an Polyethylenimin (PEI) assoziiert und mit einem Hüllpolymer (P6YE5C) ummantelt. Insgesamt werden 15 Tiere in vier verschiedenen Dosisgruppen therapiert. Gruppe I (n=3) mit 75 μg je Plasmid, Gruppe II (n=3) mit 150 μg je Plasmid, Gruppe III (n=6) mit 300 μg je Plasmid und in Dosisgruppe IV (n=3) mit 600 μg je Plasmid. Als Ver-gleichsgruppe gelten vier Katzen, die unter gleichen Bedingungen nur mit einer en bloc Resektion behandelt werden. In die Studie werden 15 Katzen (mk=9, wk=6) im Alter zwischen drei und 15 Jahren aufgenommen. Die Fibrosarkome sind häufiger im Interscapularbereich lokalisiert. Bei keinem Patienten kommt es zu therapiebedingten Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens. Drei Katzen entwickeln postoperativ ein Serom, das ohne thera-peutisches Eingreifen resorbiert wird. Systemische Veränderungen, die auf die Therapie zurückgeführt werden, manifestieren sich erst in Dosisgruppe IV mit einem Abfall der Lymphozytenpopulation. Dabei fallen in einem Zeitraum bis 45 Tage nach Implantation des Kollagenschwammes die Lymphozyten bis zu 70 % des Ausgangs-wertes ab. Bei dieser Phase I-Studie handelt es sich um eine Dosisfindungsstudie. Diese wird durch das Auftreten erster Nebenwirkungen, die auf das Transgen oder auf dessen Expressionsprodukt zurückgeführt werden können, beendet. Die maximal tolerierte Dosis wird somit in vorliegender Studie auf 600 μg je Zytokin-Plasmid festgesetzt.

The feline fibrosarcoma is a spontaneous malignant soft tissue sarcoma. Due to the high recurrence rate of approximatelly 70 % even after radical surgical excision the prognosis is very poor. There have been carried out different gene-therapy protocolls adjuvant to tumour excision, yet. In the following study a local, nonviral gene-transfer with the feline cytokine-genes Interleukin 2, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and Interferon γ is conducted. As local gene delivery system serves a collagen-sponge loaded with a plasmid-DNA-PEI-PEG-formulation. The immunomodulating cytokines are expected to improve the antigen presentation, to activate immune effector cells and to generate memory cells against specific tumour antigens. The goal is to enhance tumour cell killing and anti cancer immune response to extend the tumour free survival time or even to decrease the recurrence rate in fibrosarcoma bearing cats. First a phase I dose escalation study is carried out using these vector-loaded collagen sponge. The adjuvant immunotherapy is combined with the surgical standard treatment of the feline fibrosarcoma. Blood was collected from healthy cats. Feline peripheral mononuclear blood cells were separated, cultured and stimulated in vitro by Concanavalin A. mRNA was isolated and reverse transcribed in cDNA. The cDNA served as template for the PCR amplification. Specific primers are based on already published sequences and introduced restriction endonuclease sequences in the amplified product. PCR products and expression vector were cut with these restriction enzymes. After ligation of PCR products and expression vector p55pCMV_ivs_luc+ transformation in DH 10 B bacteria was performed. Further analysed inserts were sequenced. Before therapeutic use the cytokines had to show biological activity. Recombinant proteins are expressed in the mammalian cell line COS-7. The feIL-2 and feGM-CSF bioactivity is demonstrated in proliferation assays, using the IL-2 and GM-CSF dependent cell lines CTLL-2 and TF-1. The biological acitivty of feIFNγ is measured by FACS analysis. A MHC I and II induction assay was performed on feline fibrosarcoma cells. After plasmid DNA preparation with polykation polyethylenimine and protective copolymers (polyethylene glycol) the collagen sponge is loaded with these gene vectors under sterile conditions. The vector loaded sponge is stored at 4 °C till implanted in the tumour bed of fibrosarcoma bearing cats.

IL-12, ein heterodimeres Zytokin bestehend aus IL-12p40 und IL-12p35, wird hauptsächlich von Zellen des angeborenen Immunsystems als Antwort auf intrazelluläre Pathogene gebildet und induziert eine TH1 vermittelte Immun- reaktion. Hühner IL-12p40 wurde in einer EST-Datenbank identifziert und vollständig kloniert. Der Vergleich des Hühner IL-12p40 Gens mit verschiedenen Säugerhomologen ergab Aminosäureidentitäten von 39,7% bis 43,5%. In der Hühnergenomsequenz wurde das IL-12p40 Gen auf Chromosom 13 lokalisiert, es ist 4898bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Der korrespondierende offene Leserahmen besteht aus 945bp und kodiert für ein 315 Aminosäuren langes Protein. ChIL-12p40 wurde sowohl in prokaryotischen als auch in einem eukaryotischen System exprimiert und unter denaturierenden bzw. nativen Bedingungen aufgereinigt. Mit Hilfe des aus E. coli gewonnen ChIL-12p40 wurde ein polyklonales Kaninchen-a-ChIL-12p40 Antiserum entwickelt, das sowohl ChIL-12p40 aus prokaryotischem Expressionssystem als auch aus dem eukaryotischen Schneider SL-3-System erkennt und im Westernblot ChIL-12p40-Mengen bis zu 7,5ng detektiert. Die Klonierung der Hühner IL-12p35 Kette mit Hilfe von PCR mit Oligonukleotiden, spezifsch für hochkonservierte Regionen in Säugerhomologen, war nicht erfolgreich. Erst nach der Veröffentlichung der Hühnergenomsequenz konnte das Hühner IL-12p35 Gen auf Chromosom 9 identifziert wer- den. Die genomische Sequenz ist 1797bp lang und besteht aus fünf Exons und vier Introns. Die kodierende Region ist 615bp lang und kodiert für ein 205 Aminosäuren langes Protein, das 26,8% bis 31,2% Identität zum Säuger aufweist. Die Gene für Hühner IL-12p40 und IL-12p35 wurden durch einen Linker hintereinander kloniert und als IL-12p40/p35 -"Flexi-IL-12" exprimiert. Zur Analyse der Expression von IL-12p40 wurde RT-PCR auf cDNA Proben durchgeführt, die von verschiedenen Zelllinien, Geweben sowie stimulierten und unstimulierten Zellen stammten. IL-12p40 Signale wurden in HD-11-, RP9-, 2D8-, T16G5-, JJ1G9-, OU2-, CEC32-Zellen und mit IL-2 stimulierten Milzleukozyten detektiert. Zur weiteren Kontrolle wurde auch IFNg und IL-18 per PCR nachgewiesen. In einem in vitro Zellsystem wurde nachgewiesen, dass das rekombinant hergestellte Hühner IL-12p40 konzentrationsabhängig Milzzellen zur Sekretion von IFNg stimuliert.

Thu, 27 May 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2245/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2

Im menschlichen Vollblut können zwei Monozytensubpopulationen unterschieden werden, die „klassischen“ CD14++CD16-DR+ Monozyten und die proinflammatorischen CD14+CD16+DR++ Zellen. Letztere machen nur ungefähr zehn Prozent aller Monozyten aus und sind bei zahlreichen Erkrankungen im zentralen Blutpool stärker vermehrt als die klassischen Monozyten. Bei der Erysipelerkrankung, einer lokalisierten Hauterkrankung durch Streptokokken, konnte am Tag der Diagnosestellung (Tag 1 der Studie) eine stark erhöhte CD14+CD16+ Monozytenzellzahl mit einem Mittelwert von 150,4 ± 69,3 Zellen / µl Vollblut bei 11 Patienten gemessen werden, während ein Patient eine niedrige Zellzahl aufwies (35,4 Zellen / µl, Kontrollspender 48,7 ± 19,9 Zellen / µl). Dabei waren die klassischen Monozyten der Erysipelpatienten im Vergleich zu denen der Kontrollpersonen um den Faktor 1,7 nur mäßig erhöht. Bei vier Patienten, bei denen die CD14+CD16+ Monozyten am Tag 1 vermehrt waren, kehrten die Zellzahlen innerhalb von fünf Tagen unter antibiotischer Therapie in den Kontrollbereich zurück. Die Patienten zeigten eine beschleunigte Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit (BKS), eine erhöhte Körpertemperatur und ein erhöhtes C-reaktives Protein (CRP), sowie erhöhte Interleukin (IL-6)- und Macrophage-Colony-Stimulating-Factor (M-CSF)- Serumspiegel auf. Unter diesen klinischen Entzündungsparametern korrelierten am Tag 1 nur die Körpertemperatur und der CRP-Spiegel signifikant mit den Zellzahlen der CD14+CD16+ Monozyten. Außerdem wurde die Tumornekrosefaktor (TNF)- Produktion bei beiden Populationen mit Hilfe der Dreifarbenfluoreszenzanalyse am Durchflusszytometer untersucht, zuerst nach Stimulation von Vollblut gesunder Probanden mit Lipopolysaccharid (LPS). Dabei konnte in den proinflammatorischen Monozyten im Vergleich zu den klassischen Monozyten ein dreifach erhöhter Median der Fluoreszenzintensität für das TNF-Protein gemessen werden. Bei den Patienten wurde anschließend die intrazelluläre TNF-Bestimmung nach ex vivo Stimulation mit Lipoteichonsäure (LTA) durchgeführt, einem typischen Bestandteil der Streptokokkenzellwand. Messungen zum Vergleich der LPS- mit der LTA-Stimulation bei gesunden Probanden zeigten keinen Unterschied auf, da die TNF-Expression der proinflammatorischen Monozyten im Vergleich zu den klassischen Monozyten nach Stimulation mit LTA ebenfalls um das Dreifache erhöht war. Im Gegensatz dazu zeigten die CD14+CD16+DR++ Monozyten der Erysipelpatienten verglichen mit den entsprechenden Zellen gesunder Kontrollspender eine zweifach niedrigere TNF-Expression, wobei gleichzeitig die TNF-Expression der klassischen Monozyten unverändert blieb. Demzufolge produzierten die CD14+DR++ Monozyten der Patienten ex vivo weniger TNF als die klassischen CD14++DR+ Monozyten derselben. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass die proinflammatorischen CD14+CD16+DR+ Monozyten bei Erysipelpatienten mengenmäßig vermehrt und selektiv tolerant gegenüber Stimulation mit Zellwandbestandteilen von Streptokokken sind.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.

Neisseria meningitidis, ein Gram negatives pathogenes Bakterium ist eine der Ursachen für schwere Septikämie und Meningokokkenmeningitis. Nach Besiedelung des menschlichen Nasopharynx und Übertritt in die Blutbahn besteht ein zentraler Schritt in der Pathogenese der durch N. meningitidis verursachten bakteriellen Meningitis in der Interaktion der Bakterien mit Zellen der Blut-Hirn-Schranke. Die Schwere der Erkrankung scheint direkt mit der Produktion proinflammatorischer Zytokine, Chemokine und Wachstumsfaktoren zu korrelieren. Daher wurde in der vorliegenden Studie mit Hilfe eines Zellkulturmodells die Freisetzung von Tumornekrosefaktor alpha (TNF-a), Interleukin-1b (IL-1b), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-8 (IL-8), Monocyten-attrahierendem Protein-1 (MCP-1) und transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-b) durch Gehirnendothelzellen nach Infektion mit Meningokokken analysiert. Mit ELISA und RT-PCR wurde die Freisetzung von Zytokinen und die Transkription der Zytokin-codierenden Gene von humanen Gehirnendothelzellen (HBMEC) nach Infektion mit dem Meningokokkenstamm MC58* und seiner unbekapselten isogenen Mutante MC58 siaD der Serogruppe B nachgewiesen. In Übereinstimmung mit der Zytokinfreisetzung wurde dabei ein typisches Genexpressionsmuster festgestellt. Beide Bakterienstämme beeinflußten die Transkription der Gene, die für IL-6 und IL-8 kodieren, wobei die Transkription bei den Zellen, die mit dem unbekapselten Stamm infiziert wurden, früher nachzuweisen war. Die Transkription des TNF-a Gens wurde nur nach der Infektion mit der unbekapselten Mutante nachgewiesen. Für IL-1b und MCP-1 wurde keine verstärkte Transkription festgestellt, wogegen das Gen, welches für TGF-b codiert, von infizierten wie uninfizierten Zellen gleichermaßen exprimiert wurde. Neben den intakten Bakterien führte auch die Stimulation mit Außenmembranproteinen zu einer Induktion der Zytokinfreisetzung. Die Verhinderung der Internalisierung der Bakterien in die Zellen bzw. die Blockade des a5b1 Integrin Rezeptors reduzierte die Freisetzung von IL-8 und TNF-a, nicht jedoch die Freisetzung von IL-6. Während durch die IL-6 oder IL-8 Prästimulation der HBMEC keine Veränderung des Invasionsverhaltens der Meningokokken beobachtet werden konnte, führte eine Prästimulation mit TNF-a zu einer deutlich gesteigerten Invasion der Bakterien in die Zellen. Diese Ergebnisse machen deutlich, daß der Entzündungsprozeß im Gehirn eine komplexe Interaktion zwischen Bakterium und Wirtszelle erfordert. Dabei spielen die Gehirnendothelzellen offensichtlich eine wichtige Rolle in der interzellulären Kommunikation der beteiligten Zellen, indem sie Zytokine als Immunmodulatoren freisetzen, die ihrerseits zu veränderter Expression von Adhäsionsmolekülen führen könnten.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit neuen Ansätzen zur Immuntherapie von B-Zell-Lymphomen. Als Mausmodell wurden das Lymphom A20 und der eher leukämisch wachsende BCL1-Tumor verwendet. Alle Zellen eines B-Zell-Lymphoms produzieren einen identischen Antikörper, den sogenannten Idiotyp, der als tumorspezifisches Antigen benutzt werden kann: Die antigenbindenden variablen Regionen von schwerer und leichter Kette sind für die Tumorzellen jedes Patienten spezifisch. Die variablen Regionen lassen sich mit einem flexiblen Linker-Peptid zu single-chain Fragmenten (scFv) fusionieren. Die Antigenbindung und die Struktur als Tumorantigen bleiben dabei erhalten. Die BCL1-Sequenz war bereits bekannt, sie ließ sich mit Hilfe familienspezischer Primer mit PCR amplifizieren und klonieren. Bei der stark hypermutierten Sequenz des A20-Idiotyps versagte das Standardverfahren der Konsensus-Primer, erst eine 5'-RACE-PCR war erfolgreich. Der optimale Effektormechanismus (humoral, CD4 oder CD8 vermittelt) zur Immuntherapie von Lymphomen ist nicht bekannt. Bei DNA-Vakzinen lässt sich die Immunantwort besonders effektiv modulieren. Hier wurde ein System entwickelt, um rasch die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen in vivo untersuchen zu können: Der scFv-Idiotyp wurde mit einem Zytokin (IL1beta, IL4, IL12, GM-CSF oder Flt3 ligand) und/oder einem Adjuvans (Tetanus Toxin Fragment C oder HBsAg) gekoppelt. In vitro wurde die Expression, die Faltung des scFv und die biologische Aktivität bestätigt. Neben der spezifischen Zytokinwirkung stabilisieren die Fusionspartner die scFv-Proteine deutlich. Zunächst wurde mit dem Modellantigen HBsAg die Immunisierungstechnik optimiert: Intradermale Plasmid-Injektion in die Ohr Pinna ergab konsistent hohe Antikörper-Titer. Bereits ohne in vitro-Restimulation konnte eine starke zelluläre Antwort nachgewiesen werden. Weiterhin wurde für die beiden Tumormodelle A20 und BCL1 die Wachstumskinetik invivo bestimmt und ein Pilotversuch (32 Tiere) mit drei ausgewählten Konstrukten durchgeführt: Von sechs splenektomierten Mäusen zeigte nur eine nach zwei Immunisierungen eine spezifische zelluläre Antwort gegen A20. In keiner Versuchsgruppe zeigte sich eine signifikante Lebensverlängerung nach Lymphomchallenge. Zusammenfassend ist erstmalig ein System entwickelt worden, das es auf einfache Weise ermöglicht, die Wirksamkeit von verschiedenen Zytokinen und Adjuvantien zur Idiotyp-Vakzinierung zu untersuchen. Dieses System bietet viel Raum für Optimierungen.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.