Podcasts about p selektin

Im komplexen System der Funktionsweise von Thrombozyten werden auch dem Cholesterin der thrombozytären Zellmembran verschiedenste Funktionen zugeschrieben. Es hält die Zelle als wichtiger Membranbestandteil flexibel und beweglich und reichert sich bevorzugt in lipid rafts an. Durch die Anreicherung in diesen cholesterinreichen Domänen nimmt es Einfluss auf das clustering bestimmter Membranrezeptoren oder auf die transmembranöse Signalvermittlung und trägt auf diese Weise wesentlich zur Organisation und Funktionalität der Zellmembran bei. Dass der Cholesteringehalt der Zellmembran auch Einfluss auf die Bildung von Mikropartikeln hat, konnte in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen werden. Die Cholesterinbeladung führte zu einem höheren Anstieg der Mikropartikelanzahl als die Cholesterindepletion der Thrombozytenmembran. Durch die zusätzliche Einwirkung von Scherkräften im Kegel-Platten-Viskosimeter konnte die rein passive Generierung von Mikropartikeln noch erhöht werden. Hier waren die meisten Mirkopartikel ebenfalls in der Gruppe der cholesterinbeladenen Thrombozyten zu finden. Im TDT-Test spiegelte sich die höhere Anzahl von Mirkopartikeln in der Gruppe der cholesterinbeladenen Thrombozyten in einer verkürzten Gerinnungszeit gegenüber den cholesterindepletierten Plättchen wider. Insgesamt zeigte sich die Thrombingenerierung durch Veränderung des Cholesteringehaltes der Plättchenmembranen jedoch verlangsamt. Während eines Flussversuchs über VWFdA1 bildeten mit Cholesterin beladene Thrombozyten bei einer Scherrate von 10.000s-1 durchschnittlich längere tether aus als cholesterindepletierte Thrombozyten. Dies spricht dafür, dass der Cholesteringehalt die Flexibilität der Thrombozytenmembran insgesamt beeinflusst und damit auch die Adhäsion zum Zytoskelett, so wie es bereits für andere Zelltypen beschrieben wurde. Cholesterinbeladene Thrombozyten exprimierten im ruhenden Zustand mehr P-Selektin als cholesterindepletierte Thrombozyten. Während die P-Selektin-Expression der cholesterindepletierten Plättchen durch das Einwirken von Scherkräften deutlich gesteigert wurde, kam es bei den cholesterinbeladenen Thrombozyten zu keinem weiteren Anstieg. Dies deutet auf eine gestörte Degranulation der Thrombozyten durch Cholesterinbeladung hin, bzw. auf eine „Aktivierung“ der Thrombozyten trotz Blockierung der klassischen Aktivierungskaskaden. Ob die bei uns unter experimentellen Bedingungen in vitro beobachteten Phänomene auch die generell erhöhte Aktivität der Thrombozyten von Patienten mit Hypercholesterinämie, sowie die bei dieser Erkrankung bestehende erhöhte Anzahl von Mirkopartikeln erklären kann müssen weitere Studien klären.

Die von intrinsichen renalen Zellen und infiltrierenden Leukozyten exprimierten Zytokine sind zentrale Vermittler entzündlicher Nierenerkrankungen. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ist ein solches proinflamatorisches Zytokin, das in der glomerulären Entzündungsreaktion involviert ist. Die funktionelle Rolle von TNF wurde in Tiermodellen der Glomerulonephritis belegt. Die biologischen Effekte von TNF werden durch die beiden funktionell eigenständigen TNF-Rezeptoren TNFR1 (CD120a) und TNFR2 (CD120b) vermittelt. Neuere Daten zeigen, dass in Modellen einer Immunkomplex-Glomerulonephritis wie der nephrotoxische Serumnephritis die beiden TNF-Rezeptoren in vivo unterschiedliche Funktionen bei der glomerulären Entzündung vermitteln können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass Tnfr1 und Tnfr2 unterschiedliche inflammatorische TNF-Effekte in Glomeruli vermitteln. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Expression und Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Maus-Glomeruli zu charakterisieren und die Tnfr-abhängig exprimierten Entzündungsmediatoren in Maus-Glomeruli zu identifizieren. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnten selektive, Tnfr-spezifische Therapien zur Hemmung der glomerulären Entzündungsreaktion entwickelt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit die funktionelle Rolle der beiden TNF-Rezeptoren im MRL/lpr-Mausmodell der Lupusnephritis untersucht, um eine selektive Tnfr-Blockade als mögliche Therapiestrategie zu charakterisieren. Hierfür war eine Rückkreuzung von Tnfr1- und Tnfr2-defizienten C57BL/6J-Mäusen in den MRL/lpr-Hintergrund erforderlich. Um TNF-Rezeptor-1- und 2-vermittelte inflammatorische Signalwege in Glomeruli zu identifizieren wurde die Expression und die Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Mausnieren, in isolierten Glomeruli ex vivo und murinen glomerulären Endothel- und Mesangialzellen in vitro untersucht. In normaler Mausniere konnte eine Tnfr1- und Tnfr2-mRNA- und Protein-Expressionen präferentiell in Glomeruli im Vergleich zum Tubulointerstitium nachgewiesen werden. Die Expression von beiden TNF-Rezeptoren und die TNF-induzierte Induktion von Tnfr2-mRNA-Expression wurde auch in vitro sowohl in murinen glomerulären Endothel- als auch Mesangialzelllinien bestätigt. Die prominente glomeruläre TNF-Rezeptor-Expression korrelierte mit einer konstitutiven glomerulären mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen wie Icam-1, Vcam-1, E- und P-Selektin und Chemokinen wie Ccl2, Ccl3 und Ccl5. Eine intraperitoneale TNF-Injektion induzierte die Expression dieser Mediatoren präferentiell in Glomeruli. Diese in vivo TNF-Exposition führte zu einer raschen glomerulären Akkumulation von Leukozyten einschließlich Neutrophilen und mononukleären Phagozyten, die mittels einer kompartimentspezifischer Durchflußzytometrie analysiert wurden. Um Tnfr-abhängige inflammatorische Effekte in intrinsischen glomerulären Zellen unabhängig von infiltrierenden Leukozyten zu untersuchen, wurde eine Microarray-Gene-Expressionsanalyse an intakten Glomeruli durchgeführt, die aus Wildtyp und Tnfr-defizienten Mäusen isoliert und anschließend mit TNF ex vivo stimuliert wurden. Die meisten TNF-Effekte wurden ausschließlich durch Tnfr1 vermittelt, unter anderem die induzierte mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen, proinflammatorischen Chemokinen, Komplement-Faktoren und proapoptotischen Molekülen. Im Gegensatz dazu fanden wir nur vier Tnfr2-abhängig exprimierte Gene, einschließlich einer kleinen GTPase der Rab-Familie (Rab6b). Diese Ergebnisse wurden durch quantitative RT-PCR-Analysen von TNF-stimulierten Glomeruli und primären Mesangialzellen bestätigt. Weitere Untersuchungen zeigten allerdings auch einen Beitrag von Tnfr2 bei der gesteigerten glomerulären Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokine nach Stimulation mit niedrigen TNF-Konzentrationen auf. Im Gegensatz zur Wildtyp-Kontrolle fehlte in TNF-stimulierten Tnfr1-defizienten Glomeruli die Sekretion verschiedener proinflammatorischer Chemokine beinahe vollständig. Interessanterweise war die Proteinexpression auch in Tnfr2-defizienten Glomeruli signifikant herunterreguliert. Folglich sind die meisten inflammatorischen TNF-Effekte in Glomeruli via Tnfr1 durch die induzierte Expression von proinfammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmolekülen und Chemokinen vermittelt. Darüber hinaus dürfte Tnfr2 zu dieser inflammatorischen Antwort beitragen, wenn Glomeruli niedrigen TNF-Konzentrationen ausgesetzt sind. Ferner scheint Tnfr2 posttranskriptionell die Chemokinsekretion in Glomeruli nach einer TNF-Exposition zu beeinflussen, möglicherweise durch die Tnfr2-abhängig exprimierte Rab GTPase Rab6b, die am intrazellulären Transport und der Sekretion von inflammatorischen Molekulen beteiligt sein könnte. In Bezug auf Tnfr-spezifische, anti-inflammatorische Therapien weisen die hier präsentierten Ergebnisse somit darauf hin, dass eine selektive Tnfr1-Blockade eine glomeruläre, insbesondere durch Granulozyten und Makrophagen vermittelte Entzündung verbessern könnte, möglicherweise bei geringer Hemmung immunregulatorischer und antimikrobieller Funktionen von TNF, die redundant durch Tnfr2 vermittelt werden könnten. Dagegen erscheint aufgrund der erhobenen Daten im MRL/lpr-Mausmodell eine Blockade von TNF oder beider Rezeptoren bei der Lupusnephritis, in der glomeruläre Neutrophileninfiltrate keine entzündliche Rolle spielen, weniger erfolgversprechend. Gleichzeitig weisen die vorliegenden Ergebnisse auf eine immunsuppressive, die systemische Immunreaktivität beim SLE begrenzende Funktion von Tnfr2 hin.

Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Diagnosen in den industrialisierten Ländern. In der Regel kommt es zu einem thrombotischen Verschluss einer Koro-nararterie. Die rasche Revaskularisierung und die dadurch erhoffte Reduktion des in-farzierten Areals ist die wichtigste therapeutische Maßnahme zur Rettung des ischämischen Myokards und zur Senkung der Morbidität und Mortalität. Nach der plötzlichen Reperfusion des postischämischen Gewebes kommt es zu einem soge-nannten myokardialen Ischämie/Reperfusionsschaden, der sich als Endothel- und Myozytenschädigung ausbildet. Folge von rascher Reoxygenierung sind u. a. eine gesteigerte inflammatorische Re-aktion und in diesem Rahmen eine gesteigerte Einwanderung von Leukozyten in das ischämische Areal. Die Rolle der Thrombozyten für die postischämische Leukozyten-rekrutierung war bisher unklar. In unserer Studie wurden Wildtyp- (WT), P-Selektin- und ICAM-1/P-Selektin-defiziente Mäuse einer 20-minütigen LAD-Okklusion unterzogen, gefolgt von 15 Mi-nuten Reperfusion, um den Effekt der Interaktion zwischen Endothel, Leukozyten und Thrombozyten und den Einfluss auf den frühen Reperfusionsschaden zu unter-suchen. Anschließend wurden die Herzen ex vivo fluoreszenzmikroskopisch bzw. mittels LV-Druckmessung im isolierten Herzen analysiert. Zur Analyse der Zell-Zell-Interaktion wurden zu Beginn der Reperfusion zirkulierende Leukozyten mit Rhoda-min G6 gefärbt bzw. 2x108 BCECF-AM- oder Rhodamin G6-gefärbte homologe oder heterologe Thrombozyten systemisch infundiert. In P-Selektin-defizienten Tieren war die Verminderung der Leukozytenrekrutierung (Abb. 11) und die Bildung der Leukozyten/Thrombozyten-Co-Aggregate (Abb. 12 sowie die Reduktion des postischämischen linksventrikulären Funktionsverlustes (Tabelle 5) moderat. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Abwesenheit von ICAM-1 verstärkt (Abb. 11, Abb. 12, Tabelle 5). Die Adhäsion von Plättchen war nicht beeinflusst (Abb. 13). Die Inhibition der Thrombozytenadhäsion mittels Tirofiban, ei-nem GPIIb/IIIa-Inhibitor (Abb. 14), reduzierte die Leukozytenadhäsion und die links-ventrikuläre Dysfunktion (Abb. 15, Tabelle 5). Während in ICAM-1/P-Selektin-defizienten Herzen die direkte Rekrutierung von Leukozyten stark eingeschränkt war, konnte diese durch die Infusion von Wildtyp-Plättchen nahezu vollständig wiederher-gestellt werden. Die Inhibition der Plättchenadhäsion durch die zusätzliche Gabe von Tirofiban konnte diesen Effekt wieder aufheben (Abb. 19). Unsere Experimente de-monstrieren erstmals die Rolle des thrombozytären P-Selektins und des ß3-Integrins GPIIb/IIIa als redundanten Rekrutierungsmechanismus für die thrombozyten-vermittelte postischämische Leukozytenrekrutierung in vivo. Über diesen redundanten Mechanismus tragen Thrombozyten indirekt zum Reperfu-sionsschaden bei, indem sie die postischämische Leukozytenadhäsion verstärken. Diese thrombozyten-vermittelte Leukozytenadhäsion benötigt P-Selektin-suffiziente Plättchen, nicht jedoch endotheliales P-Selektin. Die Antagonisierung von GPIIb/IIIa, die in Patienten effektiv ist für die Thrombolysehandlung31, PTCA177 und Stent-Implantation10, 149, 203, inhibiert sowohl die Plättchenadhäsion als auch thrombozyten-vermittelte Leukozytenrekrutierung. Im experimentellen Modell der akuten myokardialen Ischämie und Reperfusion zeigte die GPIIb/IIIa-Antagonisierung eine protektive Wirkung über die Plättchen-Inhibition hinaus, in dem sie den durch plättchen-vermittelte Leukozytenrekrutierung induzier-ten akuten Reperfusionsschaden reduzierte. In einem weiteren Schritt wurde ein chronisches Mausmodell der myokardialen Ischämie und Reperfusion etabliert, um die Auswirkungen einer reduzierten Leukozy-tenadhäsion auf den chronischen postischämischen Reperfusionsschaden zu unter-suchen und mit alternativen Behandlungsmethoden zu vergleichen. WT-Tiere und ICAM-1-defiziente Tiere wurden einer einstündigen LAD-Okklusion unterzogen, ge-folgt von 14 Tagen Reperfusion. Anschließend wurde die linksventrikuläre Funktion mittels invasiver Millar-Tip Kathetermessung analysiert. 24 Stunden nach Ischämie wurden 3*106 in vitro expandierte embryonale EPC (eEPC) systemisch in WT-Tiere oder ICAM-1-defiziente Tiere infundiert. In zwei weiteren WT-Gruppen wurden auto-loge Progenitorzellen und mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark mobilisiert mittels Gabe von 0,5µg GM-CSF 7 Tage vor Ischämie bzw. direkt postischämisch. In den ICAM-1-defizienten Tieren war der postischämische Funktionsverlust im Ver-gleich zu den WT-Kontrollen etwa im gleichen Maß verringert wie bei den eEPC-behandelten Tieren (Abb. 22 Abb. 23, Abb. 24). Unter reduzierter Leukozytenredukti-on in den ICAM-1-defizienten Tieren zeigte sich ein zusätzlicher benefizieller Effekt durch die Behandlung mit eEPCs (Abb. 22 Abb. 23, Abb. 24). DiI-markierte eEPCs konnten histologisch im Infarkt-Areal in enger Nachbarschaft mit Blutgefäßen nach-gewiesen werden (Abb. 28). Die Adhäsion von Leukozyten und der damit verbundene leukozyten-assozierte Re-perfusionsschaden ist durch die Defizienz von ICAM-1 auch im chronischen Ischä-mie/Reperfusionsmodell vermindert. Embryonale EPCs sind in der Lage in ischämisches Areal einzuwandern, zu inkorpo-rieren und protektiv auf die postischämische Funktion zu wirken. Sie können so über einen längeren Zeitraum als Quelle für parakrine, angiogenese-fördernde, humorale Aktivatoren wie z. B. Thymosin-ß4 den Remodellingprozess unterstützen und führen somit zu einer verbesserten postischämischen Funktion. Die Adhäsion von embryonalen EPCs scheint dagegen unabhängig von ICAM-1 zu sein. Hier spielen Selektine211, 1-Integrine57, 141 und indirekt auch Thrombozyten118 eine wesentliche Rolle. Die präischämische Mobilisation von hämatopoetischen Progenitorzellen aus dem Knochenmark mittels GM-CSF hatte in unserem Modell eine vergleichbar protektive Wirkung wie die eEPC-Behandlung oder die Antagonisierung der Leukozytenadhäsi-on durch ICAM-1-Defizienz, während die postischämische Applikation den posti-schämischen Funktionsverlust nicht verbesserte (Abb. 25, Abb. 26, Abb. 27). Die Zytokin-Applikation zeigte bei rechtzeitiger Applikation vor Beginn der Ischämie eine protektive Wirkung. Dieses Protokoll ist allerdings nicht in der Klinik anwendbar. In weiteren Studien wird es notwendig sein, den optimalen Zeitpunkt und die optima-le Dosis zu evaluieren und mögliche Co-Applikation, z. B. Stromal-Cell-Derived-Factor-1, zur Verbesserung der Rekrutierung und zur Effizienzsteigerung zu untersu-chen, um knochenmark-stimulierende Zytokine als erfolgversprechende Behand-lungsalternativen im akuten Koronarsyndrom am Menschen einsetzen zu können.

Subendothelial lokalisierter Tissue Factor bildet das wichtigste Startsignal für die Blutgerinnung. Unter physiologischen Bedingungen verhindert die Endothelbarriere den Kontakt von TF mit plasmatischen Gerinnungsfaktoren und damit den Gerinnungsstart. Neue Untersuchungen haben gezeigt, daß präformierter TF in ruhenden Plättchen gespeichert ist. Nach Kontakt mit Kollagen wird dieser TF auf der Plättchenoberfläche und auf zirkulierenden Mikrovesikeln exprimiert. In der vorliegenden Arbeit fanden wir, daß für die funktionelle Aktivierung des intravaskulären TF Interaktionen von Plättchen, Neutrophilen und Mikrovesikeln notwendig sind. Die TF-Aktivität sowie die TF-abhängige Fibrinbildung wurden in einem System aus isolierten Blutzellen und parallel in einem der In-vivo-Situation nahestehenden Vollblutsystem gemessen. Neben zirkulierenden Mikrovesikeln wurden auch in vitro hergestellte Mikrovesikel eingesetzt und mittels ELISA auf ihren TF-Gehalt untersucht. Dabei zeigte sich, daß in Analogie zu den „Mutterzellen“ Plättchen-Mikrovesikel TF enthalten, während in Neutrophilen-Mikrovesikeln kein TF nachweisbar war. Die Förderung der thrombozytären TF-Aktivität durch Neutrophile lässt sich vermutlich durch die Fähigkeit der Leukozyten erklären mittels sezernierter Sauerstoffradikale (und Proteasen) TF zu aktivieren und seinen physiologischen Antagonisten TFPI zu hemmen. TFPI ist ein physiologischer Antagonist des TF, der von aktivierten Thrombozyten sezerniert wird. Für die Aktivierung des thrombozytären TF ist die Adhäsion von Plättchen an Leukozyten notwendig. Antikörper gegen Adhäsionsmoleküle für den Plättchen-Leukozyten-Kontakt, wie P-Selektin oder PSGL-1, reduzierten die TF-Aktivität. Da das von aktivierten Plättchen sezernierte ADP die Plättchen-Leukozyten-Adhäsion und die TF-Freisetzung aus alpha-Granula fördert, bildet das ADP-System ein interessantes Ziel für pharmakologische Interventionen. Tatsächlich konnte durch Blockierung des ADP-Rezeptors P2Y12 die Aktivität des blutassoziierten TF merklich gesenkt werden. Dies wurde im Rahmen einer Studie mit dem Thrombozytenaggregationshemmer Clopidogrel ex vivo und in in-vitro-Analysen beobachtet. Zusammen mit früheren Arbeiten ermöglicht die vorliegende Studie eine substantielle Erweiterung des Modells der schnellen Aktivierung der Blutgerinnung durch intravaskulären TF. Der im Rahmen dieser Arbeit beschriebene Aktivierungsmechanismus zeigt, daß das ADP-Amplifikationssystem der Thrombozyten und Sauerstoffradikale der Neutrophilen von erheblicher Bedeutung für die Aktivierung des intravaskulären TF sind. Für die pathologische Bedeutung dieser im Rahmen thromboembolischer Ereignisse bestehen bereits zahlreiche Hinweise.

Thu, 29 Nov 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7851/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7851/1/Klose_Alexander.pdf.pdf

Der „Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer“ EMMPRIN ist bisher im Wesentlichen bekannt aus der Tumorpathologie; er induziert in umliegenden Fibroblasten eine Aktivierung der Matrix Metalloproteinasen (MMPs). Die Beteiligung von EMMPRIN am arteriosklerotischen Geschehen konnte in früheren Untersuchungen durch den Nachweis der EMMPRIN-Expression in verschiedenen kardiovaskulären Zellen wie Monozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen in der arteriosklerotischen Plaque erbracht werden. Diese Arbeit beschreibt erstmals das Vorkommen von EMMPRIN auf Thrombozyten. Der Rezeptor wird im offenen kanalikulären System von ruhenden Thrombozyten gespeichert und aktivierungsabhängig an der Zelloberfläche exprimiert. Für die Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von EMMPRIN auf den Thrombozyten und für weiterführende in vivo-Versuche beschreibt die vorliegende Arbeit die Generierung muriner Thrombozyten, welche mittels retroviralem Gentransfers eine Überexpression von EMMPRIN an der Zelloberfläche aufweisen. Die siRNA-Technologie wurde eingesetzt, um die EMMPRIN-Synthese der koinkubierten Monozyten zu hemmen. Eine funktionelle Relevanz von EMMPRIN bei zellulären Interaktionen konnte nachgewiesen werden. So führt die Wechselwirkung der Thrombozyten untereinander EMMPRIN-vermittelt zu einer Aktivierung der Zellen mit weiterer Expression von Adhäsionsmolekülen wie P-Selektin und CD40L. Die Interaktion der Thrombozyten mit Monozyten führt EMMPRIN-vermittelt zu einer vermehrten Aktivität der monozytären MMP-9. Bei der Wechselwirkung zwischen Thrombozyten und Monozyten aktiviert EMMPRIN außerdem den Transkriptionsfaktor NF-kappaB über den klassischen Weg und induziert dadurch eine vermehrte Sekretion des proinflammatorischen Interleukin 6. EMMPRIN könnte somit ein neuer therapeutischer Angriffspunkt sein für die Identifikation rupturgefährdeter Plaques. Deren Progression könnte durch eine pharmakologische Hemmung von EMMPRIN möglicherweise reduziert werden.

Der Einsatz der extrakorporalen Zirkulation bei koronarchirurgischen Eingriffen führt durch den Kontakt des Patientenbluts mit der Fremdoberfläche des Perfusionssystems zu einer systemischen inflammatorischen Reaktion (SIRS). Inflammatorische Mediatoren, wie Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), Interleukin-10 (IL-10), P-Selektin und Stickstoffmonoxid (NO) treten nach kardiopulmonalem Bypass in erhöhten Konzentrationen im Plasma auf. Abhängig vom Schweregrad der durch die extrakorporale Zirkulation ausgelösten systemischen inflammatorischen Reaktion (SIRS) kann diese bei dem Patienten zu der Ausbildung von Funktionsstörungen verschiedener Organsysteme bis hin zum Multiorganversagen führen. Die Beschichtung der inneren Oberfläche der in der Herzchirurgie verwendeten Perfusionssysteme mit Phosphorylcholin (PC) imitiert die Eigenschaften der physiologischen Zellmembran und reduziert die Aktivierung zellulärer und humoraler Bestandteile des Bluts. In der vorliegenden Arbeit wurde in einer prospektiv randomisierten Studie untersucht, ob durch die Beschichtung der inneren Oberfläche des Perfusionssystems mit PC eine reduzierte systemische inflammatorische Reaktion und somit verbesserte Biokompatibilität für den Patienten erreicht werden kann. Hierzu wurden Patienten zur koronarchirurgischen Revaskularisation am kardiopulmonalen Bypass prospektiv in die Studie eingeschlossen und in 2 Gruppen randomisiert. In der einen Gruppe wurde ein mit PC-beschichtetes Perfusionssystem verwendet (PC-Gruppe), während in der Kontrollgruppe ein herkömmliches unbeschichtetes System zum Einsatz kam. In beiden Patientengruppen wurden perioperativ die Plasmakonzentrationen von TNF-α, IL-10 und P-Selektin mittels „Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (ELISA) gemessen. Die Plasmakonzentrationen von Nitrat/Nitrit (NOx) wurden mit Hilfe der Griess-Reaktion bestimmt. Die Plasmakonzentrationen von TNF-α und P-Selektin waren bei Patienten bei denen ein unbeschichtetes System verwendet wurde signifikant höher im Vergleich zu den Patienten bei denen ein PC-beschichtetes System verwendet wurde. In der Kontrollgruppe wurde postoperativ ein Anstieg der IL-10 Plasmakonzentration gemessen, während die Interleukin-10 Konzentration in der PC-Gruppe unverändert blieb. Am ersten postoperativen Tag war die Konzentration von Plasma NOx in der PC-beschichteten Gruppe signifikant erhöht, während sich keine Änderungen der NOx Plasmakonzentration in der Kontrollgruppe feststellen ließen. Im Hinblick auf die prä-und postoperativen klinischen Daten ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der PC-Gruppe und der Kontrollgruppe. Die hier gewonnen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Beschichtung des Perfusionssystems mit Phosphorylcholin die Biokompatibilität erhöht und zu einer Reduktion der postoperativen systemischen inflammatorischen Reaktion bei Patienten zur koronarchirurgischen Revaskularisierung am kardiopulmonalen Bypass führt.

Die chronische Gelenkentzündung entsteht aus unterschiedlicher und teilweise noch ungeklärter Ursache.Zu Beginn kommt es zu einer Entzündung der Synovialis mit Änderungen in der Mikrozirkulation und Einwanderung von Leukozyten.Auch Thrombozyten agieren vermehrt mit dem Endothel und lagern sich diesem an.Daher war es das Ziel des Versuchsvorhabens die Interaktion der Thrombozyten mit dem Endothel und den Leukozyten näher zu charakterisieren und auf der Grundlage der Rezeptoren P-Selektin und GPIIb/IIIa, molekulare Mechanismen aufzudecken.In den Untersuchungen mit P-Selektin defizienten Thrombozyten bzw. P-Selektin defizientem Endothel an Tieren mit Antigen-induzierter Arthritis (AiA), zeigte sich in beiden Fällen eine signifikante Reduktion sowohl der Thrombozyten-Endothelzell, als auch der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion gegenüber Wildtyp-Tieren.Im zweiten Abschnitt wurden die Thrombozyten selektiv durch den GPIIb/IIIa Antagonisten Tirofiban inhibiert. Hierdurch wurden bei Tieren mit AIA das Rollen nahezu und die Adhärenz der Thrombozyten am Endothel im Vergleich zu nicht behandelten arthritischen Mäusen halbiert.Auch war hier das Rollen und die Adhärenz der Leukozyten am Endothel signifikant reduziert. Daher könnte die Inhibition der Rekrutierung, Adhäsion und Aggregation von Thrombozyten in der synovialen Mikrozirkulation für die Reduktion der Leukozytenrekrutierung und Chemokinfreisetzung und damit für die Reduktion des konsekutiven Gewebeschadens von wichtiger, therapeutischer Bedeutung sein.

1. Fragestellung: Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war zum einen die Untersuchung des tatsächlichen Einflusses verschiedener nicht steroidaler Antiphlogistika auf die Thrombozytenfunktion und zum anderen der Vergleich der hier angewandten Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und Praktikabilität im klinischen Alltag. Während die Thrombozytenaggregationshemmung für Acetylsalicylsäure schon lange bekannt ist, sind Daten oder Aussagen zu einer Reihe von anderen Analgetika nach wie vor unklar. Diese Fragestellung interessierte uns insbesondere vor dem Hintergrund der onkologischen und hämatologischen Patienten, bei denen häufig eine krankheits- oder medikamentenbedingte Thrombozytopenie besteht, und die andererseits häufig auf schmerzstillende oder fiebersenkende Medikamente angewiesen sind. Ausserdem sollte die Dauer einer Thrombozytenfunktionsstörung nach Einnahme von NSAIDs untersucht werden. 2. Methoden Wir untersuchten 5 nichtsteroidale Antiphlogistika an gesunden Probanden. Die Medikamente waren ASS, Ibuprofen, Paracetamol, Diclofenac und der selektive COX-2 Hemmer Rofecoxib. Zunächst wurde an Tag 0 die Thrombozytenfunktion der Probanden ohne Einfluss eines Medikamentes gemessen. An Tag 1, 2 und 3 nahmen die Probanden eines der genannten Medikamente ein. An Tag 4, 5 und 6 wurde die Thrombozytenfunktion im Verlauf gemessen. Die angewandten Methoden waren die Durchflusszytometrie, die Aggregometrie, die Thrombelastographie und der Platelet function Analyser -100. Die Durchflusszytometrie ermöglicht Aussagen über die Plättchengröße, die Plättchengranularität und Glykoproteinexpression an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Aggregometrie erlaubt Aussagen über das Aggregationsverhalten der Thrombozyten nach Stimulation durch ADP oder Kollagen. Die Thrombelastographie ist in der Lage, die Geschwindigkeit der plasmatischen Gerinnung, der Koagelbildung und die Festigkeit des Blutgerinnsels zu messen. Der PFA-100 ist ein Analysesystem, das den Prozess der Thrombozytenadhäsion und Thrombozytenaggregation nach einer Gefäßverletzung simuliert. Sozusagen eine Messung der Blutungszeit in vitro, die das Erkennen von ererbten, erworbenen oder durch Thrombozytenaggregationshemmer induzierte Thromozytenfunktionsstörungen ermöglicht. 3. Ergebnisse In der Durchflusszytometrie zeigte sich nach der Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac eine vermehrte Expression von P-Selektin an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Expression des Glykoproteins GPIIb/IIIa war überraschenderweise nach Einnahme von Rofecoxib statistisch signifikant vermindert. Bei der Untersuchung der Blutungszeit in vitro mit dem PFA-100 fanden sich statistisch signifikante Verlängerungen der Blutungszeit nach Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac. Paracetamol und Rofecoxib nahmen keinen Einfluss auf die Blutungszeit. In der Aggregometrie ließ sich nur nach Einnahme von ASS ein signifikanter Einfluss auf die Menge der benötigten, die Aggregation auslösenden, Stimulantia nachweisen. Die weiteren Medikamente hatten keinen Einfluss. In der Thrombelastographie zeigte sich eine Verlängerung der plasmatischen Gerinnung nach Einnahme von ASS, Diclofenac und Rofecoxib. 4. Zusammenfassung Im Vergleich der hier angewandten Methoden stellte sich heraus, dass im klinischen Alltag der PFA-100 und die Aggregometrie als wegweisende Methoden für die Entdeckung eventueller Gerinnungsstörungen nach Einnahme von NSAIDs als Methoden der Wahl anzusehen sind. Die Thrombelastographie ist aufgrund der Dauer bis zu einem Ergebnis zu langsam und aus den Veränderungen in der Durchflusszytometrie lassen sich nicht zwangsläufig Thrombozytenfunktionsstörungen ableiten, die zu veränderten Blutungsneigungen führen können. Außerdem ist die Durchflusszytometrie auch die aufwendigste und teuerste der hier durchgeführten Methoden. In der Zusammenschau ist also dem PFA-100, und in zweiter Linie der Aggregometrie, der Vorzug in der Untersuchung der Throm-bozytenfunktion - nach Einnahme von NSAIDs - hinsichtlich einer Aussage über die Blutungsgefahr zu geben. Von den untersuchten Medikamenten hatte der selektive COX-2 Inhibitor Rofecoxib und das nicht steroidale Antiphlogistikum Paracetamol den geringsten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion. Eine Empfehlung zur Schmerztherapie bzw. fiebersenkenden Therapie bei blutungsgefährdeten Patienten geht also zum Einsatz von Paracetamol oder einem Medikament aus der Gruppe der COX-2 Inhibitoren.

Der Tissue Factor (TF) der Gefäßwand gilt heute als der wichtigste Starter der menschlichen Blutgerinnung. Es wird davon ausgegangen, dass die Lokalisation von TF innerhalb der Gefäßwand unter physiologischen Verhältnissen eine strikte Trennung von den plasmatischen Gerinnungsfaktoren gewährleistet, so dass es unter physiologischen Bedingungen nur nach Wegfallen der endothelialen Barriere zur Bildung des TF/VIIa-Komplexes und dort zur Auslösung der Blutgerinnung kommt. Nach der bisherigen Lehrmeinung stellen Monozyten die einzigen bekannten Blutzellen dar, die nach Langzeitstimulationsbedingungen in der Lage sind, TF zu synthetisieren und zu exprimieren. Der monozytäre TF spielt vor allem bei der Pathogenese der Sepsis und der damit assoziierten Disseminierten Intravasalen Gerinnung (DIC) eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass TF bereits nach einer fünf minütigen Stimulation von Vollblut mit fibrillärem Kollagen in Monozyten-Plättchen-Komplexen und Neutrophilen-Plättchen-Komplexen gemessen wurde. Die TF Präsentation in den Leukozyten-Plättchen-Komplexen war streng abhängig von der vorhandenen Plättchenzahl. Mit Hilfe von Vollblutgerinnungsmodellen und prokoagulatorischen Assays konnte gezeigt werden, dass der schnell präsentierte Tissue Factor funktionell aktiv war und somit die Fibrinbildung auslöste. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass das TF Antigen auf der Oberfläche von Plättchen vorhanden war, die sich in Konjugaten mit Leukozyten befanden. Um die Frage nach dem Ursprung dieses intravaskulären TF zu klären, wurden Monozyten, Neutrophile Granulozyten und Plättchen auf ihren Gehalt an TF Protein mit einem Double-Sandwich-ELISA untersucht. Dabei konnte nur in den Plättchen TF Antigen nachgewiesen werden. Weitergehende Untersuchungen zeigten, dass TF in der Tat in den a-Granula und dem „open cannanicular system“ der Plättchen lokalisiert ist. In den Plättchen und in deren Vorläuferzellen war keine m-RNA für TF vorhanden. So bleibt die letztendliche Quelle des intravaskulären TF bis auf weiteres ungeklärt. Durch Hemmung von Adhäsionsproteinen, die die Interaktion von Plättchen mit Leukozyten vermitteln, wie P-Selektin und CD40L, konnte die TF-Präsentation in den Plättchen-Leukozyten-Komplexen inhibiert werden. Daher ist davon auszugehen, dass mehrere Adhäsionsproteine an dem Prozess der Präsentation von intravaskulärem TF beteiligt sind. Ein aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit abgeleitetes Modell der Aktivierung des intravaskulären TF geht davon aus, dass in dem zwischen Leukozyten und Plättchen entstandenen Microenvironment ein von dem Plasma weitgehend unabhängiger Raum entsteht. In diesem Microenvironment wird möglicherweise der von den aktivierten Plättchen sezernierte TFPI durch die leukozytenassoziierte Elastase sowie weitere Proteasen und reaktive Sauerstoffspezies inaktiviert. TF kann damit zusammen mit FVIIa und FXa die Gerinnung starten. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die gesamte Blutgerinnung auf der Oberfläche von Plättchen stattfinden kann. Der intravaskuläre TF spielt vermutlicherweise eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gerinnung innerhalb des lumenwärts wachsenden Thrombus. Somit kann die Fibrinbildung gezielt dort aktiviert werden, wo sie benötigt wird, um den Thrombus zu stabilisieren. Das Vorhandensein eines schnell aktivierbaren, intra-vaskulären Tissue Factor Systems stellt ein neues Konzept dar, um sowohl den physiologischen als auch den pathologischen Gerinnungsstart besser zu verstehen.

96 Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden stellt ein relevantes klinisches Problem nach Lebertransplantation und Leberteilresektion sowie nach hämorrhagischem Schock dar. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, daß Thrombozyten an der Ausbildung des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens beteiligt sind. Bislang liegt jedoch keine Studie vor, in welcher die Mechanismen der Interaktion von Thrombozyten mit dem postischämischen hepatischen Endothel in vivo analysiert wurden. Insbesondere ist nicht geklärt, inwiefern diese Interaktion die Induktion und den Schweregrad des hepatozellulären Schadens beeinflußt. Ziele der Studie waren daher (1) die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion nach hepatischer I/R mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie systematisch in Abhängigkeit von der Ischämie- und Reperfusionszeit quantitativ zu analysieren, (2) zu untersuchen, welche Mechanismen die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion in der Leber vermitteln und (3) zu analysieren, welchen Einfluß diese Interaktion auf den Ischämie-Reperfusionsschaden der Leber hat. An einem etablierten murinen Modell der warmen hepatischen Ischämie-Reperfusion wurde die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion mittels intravitaler Videofluoreszenzmikroskopie untersucht. Thrombozyten wurden von separaten syngenen Spendertieren isoliert, ex vivo mit Rhodamin-6G markiert, intravenös zu den jeweiligen Reperfusionszeitpunkten appliziert und bezüglich ihrer Interaktion mit dem Endothel der hepatischen Mikrogefäße quantitativ analysiert. Zur begleitenden Analyse des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens wurden die sinusoidale Perfusionsrate, die Aktivität der Leberenzyme GOT/GPT im Serum und die Apoptosemarker Caspase-3- Aktivität und Anzahl TUNEL-positiver Zellen im Lebergewebe bestimmt. Durch Verwendung P-Selektin-defizienter Tiere (sowohl Thrombozytenspender als auch Thrombozytenempfänger) wurde die Rolle von endothelialem vs. thrombozytärem PSelektin für die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion untersucht. Des weiteren wurde versucht, durch Applikation eines Fibrinogen-Antikörpers die differentielle Bedeutung von Thrombozyten im Vergleich zu Leukozyten an der Ausbildung des Organschadens der Leber nach I/R in vivo aufklären. Es konnte gezeigt werden, daß hepatische Ischämie-Reperfusion eine Interaktion von Thrombozyten mit dem Endothel in präsinusoidalen Arteriolen, Sinusoiden und postsinusoidalen Venolen induzierte. Das Ausmaß dieser Interaktion war von der Ischämiedauer abhängig, während hingegen die Reperfusionsdauer keinen wesentlichen Einfluß hatte. Die vermehrte Thrombozytenadhäsion ging mit einem signifikanten Anstieg des mikrovaskulären und zellulären Organschadens einher. Untersuchungen an P-Selektin-defizienten Tieren demonstrierten, daß das endotheliale und nicht das thrombozytäre P-Selektin das Rollen und die nachfolgende Adhärenz von Thrombozyten in Arteriolen und Venolen der Leber vermittelte. Darüberhinaus war der postischämische Organschaden in P-Selektin-defizienten Tieren signifikant reduziert. Mittels der Blockade von Fibrinogen während der Reperfusionsphase konnte gezeigt werden, daß Fibrin(ogen) die postischämische Thrombozytenadhäsion vermittelte, an der Leukozytenadhärenz jedoch nicht beteiligt war. Die selektive Hemmung der Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion führte zu einer signifikanten Reduktion des mikrovaskulären Schadens sowie der Apoptoseinduktion in der Leber nach Ischämie- Reperfusion. Somit demonstriert diese Studie erstmals in vivo, daß den Thrombozyten bei der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens eine wichtige Bedeutung zukommt.