Podcasts about rna prozessierung

Die Alzheimer Demenz (AD) ist eine degenerative zerebrale Erkrankung, die klinisch durch den Verlust vielfältiger kognitiver Fähigkeiten gekennzeichnet ist. Ein geringer Prozentsatz (65 Jahre) erfolgte im Sinne einer homogeneren Subgruppierung und sollte eine aussagekräftigere Assoziation der genetischen Vulnerabilitätsmarker ermöglichen. In die Kontrollgruppe wurden ausschließlich gesunde Probanden ohne demenzielle Erkrankungen in der Familie eingeschlossen. Neben einer grundsätzlichen Assoziation mit der AD wurde in einem zweiten Schritt der Zusammenhang zwischen den 19 Polymorphismen und der individuellen Gedächtnisleistung als intermediärer Phänotyp untersucht. Die Gedächtnisleistung wurde mittels standardisierter Tests erhoben. Die 19 SNPs (rs4412638, rs12024093, rs12043872, rs3009113, rs913858, rs12113404, rs12672536, rs4722589, rs10998072, rs10998076, rs1162757, rs16925347, rs1162756, rs1683152, rs784566, rs11170562, rs784563, rs2249381, rs1716966) wurden mittels iPLEX-Verfahren genotypisiert und die massenspezifischen Produkte im MALDI-TOF Massenspektrometer ausgewertet. Signifikante Assoziationen konnten dabei insbesondere zwischen den drei Genen HNRNPA2B1, PCBP2, ELAVL4 und der Alzheimer Demenz, sowie der Gedächtnisleistung festgestellt werden. Auf diesen drei Genen zeigten sich fünf Marker mit dem Phänotyp der AD bzw. insbesondere mit der EOAD assoziierbar: Auf ELAVL4 ließen sich rs3009113 und rs12024093 in der Patienten-Gesamtgruppe, sowie im EOAD-Kollektiv mit der AD assoziieren; auf PCBP2 waren rs784563 und rs2249381 in der Gesamtgruppe der Patienten auffällig; auf HNRNPA2B1 ließ sich rs4722589 mit der EOAD assoziieren. Diese und weitere Polymorphismen der angeführten drei Gene konnten sowohl in der EOAD- als auch in der LOAD-Gruppe mit einer verminderten Gedächtnisleistung assoziiert werden. In der Haplotypanalyse ließen sich diese Befunde grundsätzlich bestätigen. Zusammenfassend lassen die Resultate der vorliegenden Untersuchung einen Zusammenhang zwischen drei der untersuchten RBPs (HNRNPA2B1, PCBP2 und ELAVL4) und dem Phänotyp Alzheimer Demenz, sowie dem intermediären Phänotyp Gedächtnisleistung vermuten. SNPs in intronischen Bereichen können regulatorische Sequenzen wie die Polyadenylierung- oder Spleißfaktorbindungsstellen beeinflussen und zu Veränderungen in der Transkriptionsrate oder im Spleißprozess führen. Zudem kann durch Muationen die natürliche Aggregationsbereitschaft RNA-bindender Proteine, sich in RNA-granules zusammenzulagern, verstärkt werden und damit direkt zellschädigend wirken. Da über Funktion und Struktur der untersuchten RBPs gegenwärtig noch relativ wenig bekannt ist und es bislang keine vergleichbaren Referenzstudien bezüglich Alzheimer gibt, ist weiterführende Forschungsarbeit zur abschließenden Interpretation der Ergebnisse notwendig. Aufgrund der bis dato vorliegenden Ergebnisse stellen RNA-bindende Proteine insgesamt einen interessanten Kandidaten für die Alzheimerforschung dar.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Fragestellungen zur funktionellen und dynamischen Organisation des Kerns von Säugerzellen untersucht. Der erste Teil der Arbeit widmete sich der Frage, in welchem Zusammenhang die Synthese naszenter RNA mit der Organisation des Chromatins im Zellkern steht. Dabei wurde speziell untersucht, ob naszente RNA bevorzugt in chromatinarmen Räumen lokalisiert, wie es das Chromosomen-Territorien/Interchromatin-Kompartiment Modell (CT/IC-Modell)(Cremer und Cremer, 2001) vorhersagt. Diese Untersuchungen wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, die stabil eine Fusion zwischen dem „Green Fluorescent Protein” (GFP) und dem Histon H2B exprimierten (Kanda et al., 1998). Mit Hilfe dieses Fusionsproteins kann die Chromatinstruktur sehr gut dargestellt werden (Sadoni et al., 2001; Zink et al., 2003). Die naszente RNA wurde in diesen Zellen durch kurze Pulse von BrUTP markiert, das anschließend durch eine Immunfärbung nachgewiesen wurde. Die markierten Zellen wurden mit Hilfe hochaufl ösender konfokaler Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Für die Analyse der Bilddaten wurde eine Erosionsmethode entwickelt, welche die Auswertung der Daten unabhängig von subjektiv gewählten Schwellenwerten ermöglichte. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten keine bevorzugte Lokalisierung naszenter RNA in chromatinarmen Bereichen. Damit stützen die Ergebnisse nicht die entsprechenden Vorhersagen des ICD-Modells. Die hier gewonnenen Ergebnisse stehen nicht im Einklang mit den Ergebnissen anderer Studien (Politz et al., 1999; Verschure et al., 1999). Die unterschiedlichen Ergebnisse sind wahrscheinlich auf unterschiedliche Methoden zur Darstellung der Chromatinorganisation, beziehungsweise auf unterschiedliche Methoden zur Bildanalyse zurückzuführen. Eine weitere Fragestellung, die im Zusammenhang mit der dynamischen Organisation der RNA-Synthese und RNA-Prozessierung in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, war wie das Spleißfaktor-Kompartiment mit Chromatin interagierte. Diese Interaktion sollte in lebenden „Chinesischen Hamster Ovarien” (CHO)-Zellen untersucht werden. Speziell sollte der Frage nachgegangen werden, ob das Spleißfaktor-Kompartiment unterschiedlich mit funktionell unterschiedlichen Chromatinfraktionen assoziiert ist. Dafür wurde die DNA dieser Chromatinfraktionen mit Hilfe von Cy3-dUTP (Zink et al., 1998; Zink et al., 2003) spezifisch markiert. Das Spleißfaktor-Kompartiment der lebenden Zellen wurde simultan mit einem hier lokalisierenden GFP-Fusionsprotein dargestellt (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Die so markierten lebenden Zellen wurden mit Hilfe der konfokalen Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Die Auswertung der Bilddaten ergab eine generelle enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin. Dagegen bestand eine solche Assoziation nicht mit spät-replizierendem und transkriptionell inaktivem Chromatin. Eine Behandlung der Zellen mit dem Transkriptions-Inhibitor α-Amanitin zeigte, dass die enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin direkt vom Prozess der Transkription abhängig war. Insgesamt zeigten die Daten zum ersten Mal, dass es in lebenden Zellen eine definierte Interaktion des Spleißfaktor-Kompartiments mit funktionell unterschiedlichen Chromatinfraktionen gibt, die abhängig ist vom Prozess der Transkription. Ein weiterer dynamischer Prozess im Zellkern, der in der vorliegenden Arbeit an lebenden HeLa-Zellen untersucht werden sollte, war der Prozess der DNA-Replikation. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage, welchen dynamischen Reorganisationen die DNA während der S-Phase unterliegt. Daneben sollte auch untersucht werden, wie der spezifische zeitlich-räumliche Verlauf der S-Phase in Säugerzellen koordiniert wird. Zur Untersuchung dieser Fragen wurde die zu replizierende oder die naszente DNA lebender Zellen mit fluoreszensmarkierten Nukleotiden dargestellt. Simultan wurde die Replikationsmaschinerie mit Hilfe eines GFP-PCNA Fusionsproteins markiert (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Diese Markierungstechniken erlaubten es zum ersten Mal, direkt die Interaktionen von replizierender DNA und der Replikationsmaschinerie zu beobachten und zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA während der S-Phase keine großräumigen Umlagerungen erfuhr. Nur einige lokal begrenzte Reorganisationen wurden beobachtet, die sich innerhalb von Distanzen von weniger als 1 µm abspielten. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass DNA in stabile Aggregate organisiert war, die den Replikationsfoci entsprachen. 85 % dieser Aggregate, die auch als subchromosomale Foci bezeichnet werden (Zink et al., 1998), behielten ihren Replikationszeitpunkt von S-Phase zu SPhase stabil bei. Während des zeitlichen Fortschreitens der S-Phase schritt die Replikationsmaschinerie sequentiell durch benachbarte Gruppen von subchromosomalen Foci. Diese besaßen einen definierten Replikationszeitpunkt, und lokalisierten an de- finierten Positionen im Zellkern. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die spezifische Anordnung von subchromosomalen Foci im Kern, die während der frühen G1-Phase etabliert wird (Dimitrova und Gilbert, 1999; Ferreira et al., 1997; Sadoni et al., 1999), die räumlich-zeitliche Organisation der S-Phase determiniert.

Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) sind Komplexe aus RNA und Proteinen, die entscheidende Funktionen bei Prozessen wie Translation, Telomer-Synthese, Protein-Import in das endoplasmatische Retikulum oder RNA-Prozessierung übernehmen. Obwohl stets neue Beispiele die Bedeutung von RNPs untermauern, sind grundlegende Aspekte ihrer Funktion noch unklar. So stellte sich zu Beginn dieser Arbeit die Frage, wie sich die Komponenten von RNPs zu funktionellen Gebilden zusammenlagern. In frühen in-vitro-Studien war beobachtet worden, dass sich RNPs spontan ausbilden und dieser Vorgang keine weiteren Faktoren benötigt. Daraus war die Hypothese abgeleitet worden, dass dies möglicherweise auch der in vivo Situation entsprechen könnte. Unerwartete Einblicke in die Biogenese von RNPs lieferten schliesslich Studien zum "survival motor neurons"-Protein (SMN), dem Krankheitsgenprodukt der spinalen Muskelatrophie. Antikörper gegen SMN und seinem Bindungspartner Gemin2 inhibierten in Xenopus laevis Oocyten die Ausformung von RNP-Untereinheiten des Spleißosoms - den U snRNPs und nährten den Verdacht, dass diese Proteine Hilfsfaktoren der U snRNP-Biogenese sein könnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, mechanistische Details über die Zusammenlagerung von U snRNPs in vivo zu ermitteln und die Rolle von SMN und Gemin2 zu untersuchen. Die wesentlichen Schritte der Biogenese von U snRNPs können experimentell in X. laevis Oocyten verfolgt werden. Nach dem Export der U snRNAs U1, U2, U4 und U5 in das Cytosol lagern sich dort jeweils sieben sogenannte Sm-Protein an ein gemeinsames Motiv der U snRNAs an und formen so die Grundstruktur jedes U snRNPs, die Sm-Core-Domäne. Hierauf folgen die Hypermethylierung der U snRNA-Kappe und der Import der Sm-Core-Domäne in den Zellkern, wo sich U snRNP-spezifische Proteine anlagern, ehe die reifen snRNPs am Spleißprozess teilnehmen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein zellfreies System entwickelt, durch das die Zusammenlagerung von U snRNPs in der Komplexität des Cytosols untersucht werden konnte. Unter Verwendung von Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern oder HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, entgegen bisheriger Vermutungen, nicht spontan erfolgt, sondern Energie in Form von ATP benötigt. Aus Depletionsversuchen wurde deutlich, dass SMN unter diesen zellähnlichen Bedingungen für die snRNP-Biogenese unbedingt erforderlich ist. SMN, dies zeigten immunbiochemische Reinigungen, ist in der Zelle mit 17 verschiedenen Proteinen assoziiert, die hier erstmals vollständig identifiziert wurden. Dieser SMN-Komplex enthält bereits alle Sm-Proteine, jedoch keine U snRNAs. Anhand direkten Sm-Protein-Transferstudien wurde klar, dass der SMN-Komplex allein nicht nur notwendig sondern auch hinreichend für die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, ist. Dennoch konnte mit dem pICln-Komplex ein Proteinkomplex entdeckt werden, der mit dem SMN-Komplex interagiert und dessen Aktivität erheblich steigert. Der pICln-Komplex enthält eine neuartige Methyltransferase, die Arginylreste in den Sm-Proteinen B/B’, D1 und D3 zu symmetrischen Dimethylargininen modifiziert. Es ist bekannt, dass hierdurch die Bindung von Sm-Proteinen an SMN verstärkt wird. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass SMN- und pICln-Komplexe eine funktionelle Einheit bilden, in der Modifikation und Transfer der Sm-Proteine koordiniert ablaufen. Erste Erkenntnisse aus Versuchen mit HeLa-Zellen und Patientenzelllinien deuten an, dass reduzierte Menge des SMN-Komplexes mit einer reduzierten U snRNP-Zusammenlagerungsaktivität einhergehen, und dass dies einen biochemischen Defekt in Spinaler Muskelatrophie darstellen könnte. In einem weiteren Projekt wurde mit Hilfe von Datenbankanalysen und biochemischen Strategien das SMN-homologe Protein SMNrp identifiziert und charakterisiert. Biochemische Studien zeigten, dass SMNrp eine Komponente des U2 snRNPs ist und eine essentielle Rolle beim Spleißen ausführt. Kernextrakte die kein SMNrp enthalten wiesen einen Defekt der Spleißosomen-Zusammenlagerung auf der Stufe des „prä-Spleißosoms“ auf. SMNrp ist demnach ein Zusammenlagerungsfaktor des Spleißosoms und bezüglich dieser Funktion dem U snRNP-Zusammenlagerungsfaktor SMN ähnlich.