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Der Typ-2-Diabetes mellitus ist durch eine chronische Hyperglykämie charakterisiert, welche auf eine Kombination aus peripherer Insulinresistenz und Dysfunktion der insulinproduzierenden β-Zellen des endokrinen Pankreas zurückzuführen ist. Um eine bessere Prävention und Therapie dieser häufig vorkommenden Stoffwechselerkrankung zu ermöglichen, war es das Ziel der vorliegenden Dissertation, neue Aspekte der β-Zelldysfunktion in der Pathogenese des Typ-2-Diabetes mellitus aufzuklären. Im ersten Teil dieser Arbeit sollten auf zellulärer Ebene am Typ-2-Diabetesmodell der db/db-Maus neue Erkenntnisse über die sequenzielle Abfolge von Ereignissen gewonnen werden, welche sich im endokrinen Pankreas bei der Entwicklung eines Typ-2-Diabetes abspielen. Durch den direkten Vergleich diabetesresistenter db/db-Mäuse mit C57BL/6J-Hintergrund (db/db B6) und diabetessuszeptibler db/db-Mäuse mit C57BLKS/J-Hintergrund (db/db BKS) wurde erstmalig gezeigt, dass beide Mausstämme eine ähnlich ausgeprägte Insulinresistenz aufweisen und zunächst in der Lage sind, den dadurch erhöhten Insulinbedarf effektiv zu kompensieren. Der sich ab einem Alter von 9 Wochen bei db/db BKS-Mäusen manifestierende Typ-2-Diabetes ist auf einer altersbedingten, inadäquaten Expansion der β-Zellmasse begründet, welche aus einer abnehmenden β-Zellhyperproliferation und einer signifikant gestei-gerten Apoptose der β-Zellen resultiert. Da kompensatorische Defizite der β-Zellmasse möglicherweise auch die humane Typ-2-Diabetesentstehung entscheidend beeinflussen, ist bei prädisponierten Personen eine frühzeitige therapeutische Unterstützung der β-Zellmasse als erfolgversprechende Maßnahme zur Prävention eines Typ-2-Diabetes mellitus vorstellbar. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollten neue Gene identifiziert werden, die eine regulatorische Funktion in den β-Zellen einnehmen und deshalb mögliche Angriffspunkte für neue Therapieformen der β-Zelldysfunktion beim Typ-2-Diabetes darstellen. In Voruntersuchungen wurden die Proteine OPG (Osteoprotegerin) und SOCS2 („suppressor of cytokine signaling 2“) zur genaueren Analyse ausgewählt. Die Hypothese einer positiven Regulatorfunktion von OPG in den pankreatischen β-Zellen konnte zunächst durch die Feststellung einer zeitlichen Korrelation zwischen der β-zellspezifischen OPG-Expression und den kompensatorischen β-Zellveränderungen während der murinen Schwangerschaft bekräftigt werden. In vitro-Versuche an den Insulinomzelllinien Ins-1E und MIN6 sowie an isolierten C57BL/6-Pankreasinseln ergaben, dass das Sekretionsprotein OPG keinen signifikanten Einfluss auf die glukosestimulierte Insulinsekretion und Proliferation von β-Zellen ausübt. OPG wird jedoch durch Zytokine in Ins-1E-Zellen induziert und schützt diese Zellen partiell vor einer IL-1β-induzierten Apoptose. Somit kann eine Rolle von OPG als autokriner Überlebensfaktor pankreatischer β-Zellen postuliert werden. Dieser protektive Effekt geschieht vermutlich unabhängig von den klassischen OPG-Liganden RANKL und TRAIL über eine Inhibierung der IL-1β-induzierten MAP-Kinasen JNK1/2, p38 und ERK1/2. Die physiologische Funktion von SOCS2 wurde sowohl in vivo an SOCS2-Knockout-Mäusen als auch in vitro an Ins-1E-Zellen und isolierten Pankreasinseln untersucht. Dabei konnte kein signifikanter Einfluss von SOCS2 auf die GH-induzierte β-Zellproliferation und die zytokininduzierte Apoptose der β-Zellen demonstriert werden. Unter Anwendung glukosestimulierter Insulinsekretionsversuche und Glukosetoleranztests wurde des Weiteren nachgewiesen, dass SOCS2 weder in vitro noch in vivo die Funktion von β-Zellen signifikant beeinflusst. Auch ein Effekt von SOCS2 auf die Insulinsensitivität konnte an SOCS2-Knockout-Mäusen ausgeschlossen werden. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass SOCS2 - im Gegensatz zu SOCS1 und SOCS3 - keine nicht-kompensierbaren Effekte auf die Physiologie pankreatischer β-Zellen und auf den Glukosemetabolismus ausübt. Erklärt werden kann dies wahrscheinlich durch die hohe Redundanz innerhalb der SOCS-Proteinfamilie. Zusammenfassend tragen die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zu einem besseren Verständnis der pankreatischen β-Zellphysiologie und der Pathogenese des Typ-2-Diabetes mellitus bei und ermöglichen es dadurch, die diesbezügliche Entwicklung präventiver und therapeutischer Maßnahmen voranzutreiben.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

Die Immuntherapie stellt eine mögliche Therapiealternative bei malignen Erkrankungen dar. In dieser Arbeit wurden im murinen Modell dendritische Zellen in vitro generiert, mit bestrahlten Tumorzellen koinkubiert und mit CpG-Oligonukleotiden aktiviert. Diese Tumorvakzine wurde subkutan gegen subkutan induzierte Tumoren eingesetzt. Sowohl prophylaktisch wie auch therapeutisch konnte eine potente antitumorale Immunantwort induziert werden, die systemisch wirksam, lang anhaltend und tumorspezifisch war. Durch einen Vergleich zwischen zwei Mausstämmen konnten Faktoren, die möglicherweise die antitumorale Immunantwort beeinflussen, identifiziert werden.

Das biologische Geschlecht wird als ein Risikofaktor für die Entstehung und den Verlauf von septischen Zustandsbildern kontrovers diskutiert. In der hier vorgelegten Arbeit werden die Einflüsse genetischer Faktoren unter Berücksichtigung des biologischen Geschlechts und der Wirkung von Sexualsteroiden auf die entzündliche Antwort in einem Tiermodel untersucht. Hierzu wurde genotypisch verschieden Mausstämmen (A/J, C57BL6/J, DBA/2J, BALB/cJ und AKR/J) bakterielles Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS) intraperitoneal injiziert. Als Ausdruck der entzündlichen Antwort wurden Plasmaspiegel der Zytokine Tumor Nekrose Faktor alpha (TNF-a) und Interleukin 10 (IL-10) mittels ELSIA gemessen. Es zeigten sich deutliche geschlechtsspezifische Unterschiede in der LPS-induzierten entzündlichen Antwort von C57BL6/J-Mäusen (=B6), die hormonell bedingt zu sein scheinen. Der Vergleich mit A/J-Mäusen weist hier jedoch eine unterschiedliche Ausprägung und somit eine Abhängigkeit von genetischen Faktoren auf. Außerdem lässt sich die entzündliche Antwort durch Gabe von Sexual-Steroiden modulieren. Hierzu wurden Mäuse kastriert bzw. ovariektomiert und vor der Injektion von LPS mit 17-ß-Estrogen oder 5-a-Dihydrotestosteron behandelt. Männliche Tiere reagierten dabei allerdings deutlich besser auf diese Beeinflussung von außen. Darüber hinaus sind diese Effekte abhängig von genetischen Faktoren. Nach Änderung der hormonellen Bedingungen fanden sich bei den Männchen der einzelnen Stämme deutliche Unterschiede: Während sich einige Stämme z.T. unbeeinflusst, wie z.B. die IL-10 Plasmaspiegel von DBA/2J und BALB/c Mäusen nach Östrogen-Behandlung zeigten, fanden sich bei andere Stämme gar gegensätzliche Antworten, so z.B: die TNF-a Plasmaspiegel von A/J und B6 Mäusen nach Östrogen-Behandlung. Untersuchungen an der F1-Generation von A/J und B6 Mäusen zeigten, dass die beobachteten Effekte unabhängig von den Geschlechtschromosomen oder genetischem Imprinting zu sein scheinen. Die beobachteten Veränderungen durch hormonelle Manipulation wurden auch in ihrer Auswirkung auf den Verlauf nach einer letalen LPS-Injektion untersucht. Da Androgene allgemein als hauptsächlich verantwortlich für geschlechtsspezifische Unterschiede der entzündlichen Antwort eingeschätzt werden, wurde von der Verringerung der systemischen Androgenspiegel ein Überlebensvorteil erwartet. Um so interessanter war die Beobachtung, dass diesbezüglich lediglich A/J Mäuse nach chirurgischer Kastration vor den Auswirkungen von LPS geschützt waren. Dieser protektive Effekt könnte die Folge von sexual-steroid-abhängigen Änderungen in der Relation von pro- zu anti-inflammatorischer Komponente der entzündlichen Antwort sein. Es ist anzunehmen, dass dieser Schutz nur bei entsprechender genetischer Konstellation und wahrscheinlich in Abhängigkeit vom Verletzungsmechanismus zustande kommt. Östrogen-Behandlung von männlichen A/J and B6 Mäusen brachte kein verbessertes Überleben nach Endotoxinschock. Die vorgelegten Daten erlauben die Schlussfolgerung, dass biologisches Geschlecht und individuelle genetische Ausstattung gemeinsam einen messbaren Einfluss auf die LPS-induzierte entzündliche Antwort haben. Könnte man diese Ergebnisse auf Menschen übertragen, so ließe sich hieraus eine Erklärung für gegensätzliche Beobachtungen bei geschlechtsspezifischen Unterschieden in klinischen Studien ableiten. Genetische Marker könnten helfen, die Einflüsse des biologischen Geschlechts auf die entzündliche Antwort klinisch besser untersuchen zu können. Die Suche nach solchen Markern sollte in Zukunft intensiviert werden, da ihnen auch eine große Bedeutung für das Design von Laborexperimenten und klinischen Studien zukommt, aus denen sich dann eventuell sogar therapeutische Ansätzen zur Milderung der sekundären Effekte von Verletzungen ableiten lassen.

Das Gen des Selenoproteins PHGPx war in der Arbeitsgruppe im Verlaufe einer Expressionsklonierung als antiapoptotisches Gen für Burkitt-Lymphom-Zellen kloniert worden. Die Komplexität der kotranslationalen Inkorporation von Selenocystein, welches bei Selenoenzymen Teil des reaktiven Zentrums ist, limitiert die Überexpression und erschwert die funktionelle Analyse der Selenoproteine sowohl in vitro als auch in vivo. Die PHGPx und das ebenfalls Selenocystein-abhängige mitochondriale Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System sind bei der Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die in der mitochondrialen Atmungskette erzeugt werden. Im Gegensatz zur PHGPx vermittelt die Thioredoxin- Reduktase ihre Schutzfunktion vor oxidativem Stress über Thioredoxin-abhängige Peroxidasen, die sogenannten Peroxiredoxine. Aufgrund einer möglichen Redundanz beider Systeme sollten beide Gene in Mäusen gezielt zerstört und bei Bedarf doppel-knock-out-Tiere erzeugt werden. Da das Fehlen der funktionellen, mitochondrialen Thioredoxin-Reduktase möglicherweise nicht mit dem Leben vereinbar ist, wurden Mäuse unter Verwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems etabliert, bei welchen das Gen zunächst aktiv ist. Die Inaktivierung der Thioredoxin-Reduktase 3 erfolgte durch Einkreuzen von transgenen Mäusen, die die Cre-Rekombinase in allen Geweben exprimieren. Die aus dieser Verpaarung abstammenden, heterozygoten knock-out-Mäuse zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp. Erste Ergebnisse zeigen, dass homozygote TR3 knock-out-Mäuse wahrscheinlich embryonal oder perinatal letal sind. Bei der Inaktivierung des PHGPx-Gens in Mäusen wurden zwei Strategien verfolgt. Die lacZ knock-in-Strategie sollte ermöglichen, die Gewebeexpression der PHGPx zu studieren. Die konditionale knock-out-Strategie wurde parallel verfolgt, weil zu Beginn der Arbeit nicht abzusehen war, ob homozygote PHGPx knock-out-Mäuse lebensfähig sind oder ob Probleme mit der männlichen Fertilität zu erwarten sind. Schon lange war bekannt, dass die PHGPx im Hoden hoch exprimiert ist. Wie sich dann im Laufe dieser Arbeit herausstellte, handelte es sich bei dem konditionalen PHGPx knock-out ebenfalls um einen direkten knock-out. Durch die beabsichtigte konditionale knock-out-Strategie wurde ein Spermienkern-spezifisches, alternatives Exon des PHGPx-Gens zerstört. Diese neue Form der PHGPx wurde kloniert, das Hoden-spezifische Expressionsmuster und die Kernlokalisation des alternativenExons durch GFP-Fusionsproteine gezeigt. Geleitet von den in dieser Arbeit und von Ursini et al. (1999) beschriebenen neuen Funktionen der PHGPx in der Spermatogenese und den vergeblichen Versuchen, das veränderte PHGPx-Allel in Mäusen in die Keimbahn zu bekommen, wurden die Hoden und Spermien von den PHGPx- Chimären analysiert. Die Analyse der Chimären zeigte einen Phänotyp der partiellen Hodenatrophie und schweren Missbildungen der Spermien, der dem von Selendefizienten Nagetieren sehr ähnlich ist. Die bei diesen Chimären beobachtete Haploinsuffizienz führte zu der Entscheidung, die konditionale knock-out-Strategie für PHGPx zu ändern. Letztendlich gelang es, mit der neuen konditionalen knock-out- Strategie Keimbahntransmission zu erhalten. Dadurch wurde nicht nur das gesteckte Ziel, ein Maus knock-out-Modell für die PHGPx zu etablieren, erreicht, sondern es wurden viele zusätzlich wichtige neue Erkenntnisse über die Struktur und Funktion der PHGPx in der Spermienreifung gewonnen. Die Cre-vermittelte Inaktivierung des konditionalen PHGPx-Allels wird in Kürze erwartet.