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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

Das Plazentare Wachstumshormon (hGH-V) gehört der Wachstumshormonfamilie an und unterscheidet sich nur in 13 AS von hGH-N. Es wird ab der Früh-SS von den Synzytiotrophoblasten der Plazenta exprimiert und kontinuierlich in die maternale Zirkulation ausgeschüttet. Schon kurze Zeit nach der Entbindung ist hGH-V nicht mehr nachweisbar. HGH-V korreliert positiv mit der maternalen IGF-I-Konzentration und hat eine dem hGH-N vergleichbare somatogene Aktivität. Über die Funktion von hGH-V während der SS herrscht bis heute Unklarheit. Es wird angenommen, dass es eine wichtige regulatorische Rolle im Glukosestoffwechsel während der SS spielt. Der in dieser Arbeit beschriebene immunofluorometrische Assay, basierend auf spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen hGH-V, stellt eine hochsensitive Messmethode für hGH-V im menschlichen Serum dar. Bereits ab der 7. SSW ist ein Nachweis von hGH-V möglich. Seine kurze Inkubationszeit von zwei Stunden, das geringe Probenvolumen und das gefahrenlose Arbeiten ohne Radioaktivität stellen wichtige praktische Aspekte für die weitere Erforschung der physiologischen und pathophysiologischen Rolle von hGH-V dar. In einer ersten prospektiv longitudinalen, klinischen Studie wurde der Hypothese nachgegangen, ob hGH-V den Glukosemetabolismus während der SS beeinflusst. Hierfür wurden 69 Patientinnen ohne Glukosestoffwechselstörung (NORM), 27 Patientinnen mit Diabetes mellitus Typ I (DM I) und 43 Patientinnen mit Gestationsdiabetes (GDM) während der SS untersucht. In vierwöchentlichen Abständen wurde den Patientinnen Blut entnommen und der Verlauf der SS wie auch der Geburt notiert. Es konnte gezeigt werden, dass die hGH-V-Konzentration in allen Gruppen kontinuierlich während der SS ansteigt und nach der Geburt rasch wieder aus dem Körper der Mutter eliminiert wird (HWZ: 15 min). Innerhalb fest definierter Zeiträume der SS unterscheidet sich die hGH-V-Konzentration der Patientinnen mit GDM und DM I nicht signifikant von der des Normalkollektivs. Innerhalb des Normalkollektivs lässt sich ein deutlicher Unterschied zwischen normal-, unter- und übergewichtigen Personen erkennen. So zeigen untergewichtige Patientinnen im Verlauf der SS signifikant höhere hGH-V-Werte als normal- und übergewichtige Patientinnen. Dies spricht für eine inverse Korrelation zwischen hGH-V und Fettgewebe, wie es auch bei hGH-N beschrieben ist. Funktionell kann diskutiert werden, dass bei schlanken Patientinnen höhere hGH-V-Spiegel zur Induktion einer relativen Insulinresistenz erforderlich sind, die ihrerseits einen hinreichenden Glukose-Flux zur fetoplazentaren Einheit sicherstellt. Zudem konnte bei gewichtskorrigierter Betrachtung der Gruppen zueinander ein signifikanter Unterschied zwischen der hGH-V-Konzentration der Patientinnen mit DM I und der des Normalkollektivs festgestellt werden. HGH-V korreliert positiv mit der maternalen IGF-I-Konzentration. Diese unterscheidet sich signifikant in beiden pathologischen Gruppen von der des Normalkollektivs. Es besteht keine Korrelation zwischen hGH-V und den morphologischen Daten des Kindes, jedoch zwischen hGH-V und dem Plazentagewicht. In der Folgestudie wurde der Frage nachgegangen, ob die Veränderung der Insulin- sensitivität in der SS mit der hGH-V-Konzentration in Verbindung steht. Hierfür wurde bei 13 Patientinnen ohne Glukosestoffwechselstörung zweimal in der SS ein oraler Glukose-Toleranztest (OGTT) vorgenommen und zu definierten Zeitpunkten während des Tests Blut entnommen. Die Insulinsensitivität verringerte sich bei 12 der 13 Patientinnen mit Fortschreiten der SS. Ein kausaler Zusammenhang zwischen dem Grad der Insulinresistenz und der hGH-V-Konzentration kann durch Korrelation dieser beiden sich bekanntermaßen mit der Gestationsdauer verändernden Parameter statistisch nicht nachgewiesen werden, liegt jedoch nahe. Diese Vermutung wird auch gestützt durch den hier erbrachten Nachweis einer Korrelation von hGH-V und HbA1c innerhalb des Normbereichs. Zudem zeigte sich eine signifikante Abnahme der hGH-V-Konzentration 30 Minuten nach Gabe der Glukoselösung in beiden Tests. Diese Beobachtung erlaubt erstmals die Feststellung, dass die plazentare hGH-V-Ausschüttung, gleich dem hypophysären hGH-N, durch Glukose akut in vivo geregelt wird. Zusammenfassend lässt sich die Hypothese bestätigen, dass dem hGH-V bei der Regulation der Glukosebereitstellung zum Kind eine bedeutende Rolle zukommt. So wird die hGH-V-Sekretion bei hohen maternalen Glukose-Konzentrationen supprimiert, während es bei untergewichtigen Müttern zu einer vermehrten hGH-V-Ausschüttung kommt. Letztlich ist der genaue Interaktionsmechanismus noch unklar und erfordert weitere Untersuchungen, die durch die hier vorgestellte Analysemethode des hGH-V-Immunoassays signifikant erleichtert werden.

Ziel der Arbeit ist die Untersuchung von Magnetfeldern im intergalaktischen Gas von Galaxienhaufen mittels Faradayrotationskarten extragalaktischer Radioquellen, die in oder hinter einem Galaxienhaufen lokalisiert sind. Faradayrotation entsteht, wenn linear polarisierte Strahlung einer solchen Quelle durch ein magnetisiertes Medium propagiert und dabei dessen Polarisationsebene rotiert wird. Multifrequenzbeobachtungen erlauben die Konstruktion von Faradayrotationskarten. Die statistische Charakterisierung und Analyse dieser Karten erlaubt es, Eigenschaften der Magnetfelder, welche mit dem Plasma in Galaxienhaufen in Verbindung stehen, zu bestimmen. Es wurde untersucht, ob es einen Beweis dafuer gibt, dass die Faradayrotation im quellennahen Material erzeugt wird oder im magnetisierten Plasma der Galaxienhaufen. Dazu wurden zwei statistische Masse zur Charakterisierung der Daten eingefuehrt. Beide Masse sind ausserdem wertvolle Indikatoren fuer moegliche Probleme bei der Berechnung von Magetfeldeigenschaften auf der Basis von Faradayrotationsmessungen. Die Masse wurden auf Faradayrotationsmessungen von ausgedehnten Radioquellen angewandt. Es konnten keine Hinweise auf quellennahe Enstehungsorte der Faradyrotation gefunden werden. Aufgrund von davon unabhaengigen Beweisen, wurde festgestellt, dass die Magnetfelder, welche die Faradayrotation verursachen, mit dem Plasma in Galaxienhaufen in Zusammenhang stehen sollten.Eine statistische Analyse von Faradayrotationsmessungen mittels Autokorrelationsfunktionen und aequivalent dazu Energiespektren wurde entwickelt um Magnetfeldstaerken und -korrelationslaengen zu bestimmen. Diese Analyse stuetzt sich auf die Annahme, dass die Magnetfelder statistisch isotrop im Faradayrotationsgebiet verteilt sind. Sie benutzt eine sogenannte Fensterfunktion, die das Probenvolumen beschreibt, in welchem Magnetfelder detektierbar sind. Die Faradayrotationskarten von drei ausgedehnten Radioquellen (d.h. 3C75 in Abell 400, 3C465 in 2634 und Hydra A in Abell 780) wurden mittels dieser Methode neu ausgewertet und dabei Magnetfeldstaerken von 1 bis 10 muGauss fuer diese drei Galaxienhaufen abgeleitet.Die Messung von magnetischen Energiespektren erfordert Faradayrotationskarten hoechster Guete. Um Artefakte durch die Datenreduktion zu vermeiden, wurde ein neuer Algorithmus -- Pacman -- zur Berechnung von Faradayrotationskarten entwickelt. Verschiedene statistische Tests zeigen, dass dieser Algorithmus stabil ist und zuverlaessige Faradayrotationswerte berechnet. Zur genauen Messung von magnetischen Energiespektren aus den Pacman Karten wurde ein Maximum-Likelihood-Schaetzer, der auf der zuvor eingefuehrten Theorie beruht. Diese neue Methode erlaubt erstmals, die statistische Unsicherheit des Ergebnisses anzugeben. Des weiteren beruecksichtigt diese Methode das begrenzte Probenvolumen und macht die verlaessliche Bestimmung von Energiespektren moeglich. Diese Maximum-likelihood Methode wurde auf Pacman Faradayrotationskarten von Hydra A angewandt. Beruecksichtigt man die Ungewissheit ueber die exakte Probengeometrie des Faradaygebietes, erhaelt man eine Magnetfeldstaerke von 7 +/- 2 muGauss. Das berechnete Energiespektrum folgt einem Kolmogorov aehnlichem Energiespektrum ueber wenigstens eine Groesseenordnung. Die magnetische Energie ist auf einer dominanten Skale von ungefaehr 3 kpc konzentriert.