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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

Das Auftreten von Resistenzen ist eines der Hauptprobleme der heute angewandten antiretroviralen Therapie. Resistenzen können diagnostisch mit dem sog. genotypischen oder dem phänotypischen Verfahren festgestellt werden. Die genotypische Diagnostik beruht auf der Nukleotid-Sequenzierung der viralen Target-Gene Reverse Transkriptase (RT) oder Protease (PR), die relativ einfach zu bewerkstelligen ist. Ein phänotypischer Resistenztest und damit direkter Aktivitätstest der Enzyme RT und PR ist sehr viel präziser. Dies ist z.B. beim Vorliegen komplexer Resistenzmuster oder einem Mangel an genotypischer Information von resistenzrelevanten Mutationen bei einem neu verwendeten antiviralen Medikament von großer Bedeutung. Die zu testenden Enzyme werden entweder aus DNA, isoliert aus PBMCs aus Patientenvollblut oder Plasma-RNA rekombinant hergestellt. Vor kurzem wurde nun die Frage erhoben, ob die diagnostisch gemessenen Werte Unterschiede aufweisen, je nachdem ob DNA oder RNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Die Veröffentlichungen zu diesem Thema waren diskreptant in ihren Aussagen. Zur Klärung dieser Frage wurde in der vorliegenden Arbeit das phänotypische Resistenzverhalten der HIV-Protease von 12 Patienten gegenüber 5 verschiedenen Proteaseinhibitoren untersucht. Aus jedem der Patienten wurde ein "Protease-Paar" sowohl aus HIV-DNA als auch HIV-RNA (via cDNA) rekombinant produziert. Die Patienten wiesen eine unterschiedliche Höhe der Viruslast auf, sie lag zwischen 1.900 cp/ml und 230.000 cp/ml, und hatten unterschiedlich hohe CD4-Zellzahlen. Mit dieser Untersuchung sollte also erstens die Frage beantwortet werden, ob zu einem gegebenen Zeitpunkt Abweichungen im Resistenzprofil zwischen den beiden Formen genetischer Information von HIV im Körper vorliegen können. Im positiven Fall sollte festgestellt werden, welchen Einfluss die Virusvermehrung/Virusdynamik und der Immunstatus des betroffenen Patienten, ausgedrückt durch die Laborparameter Viruslast und CD4-Zellzahl, darauf haben. Zweitens sollte dasjenige Probenmaterial gefunden werden, welches für den phänotypischen Resistenztest das optimale Resultat ergibt: entweder HIV-DNA aus PBMCs im Vollblut oder HIV-RNA aus Blutplasma. Der hier verwendete phänotypische Resistenztest (PRT) basiert auf der direkten Messung der HIV-Proteaseaktivität, die durch rekombinante Expression der gesamten Population von HIV-Protease eines Patienten hergestellt wurde. Für die vorliegende Arbeit wurde parallel sowohl HIV-DNA aus PBMCs im Vollblut als auch cDNA aus viraler RNA im Blutplasma des Patienten als Ausgangsmaterial für die nested PCR verwendet. Nach erfolgter Expression des Enzyms in E. coli und effektiver Ein-Schritt-Aufreinigung wurde die Proteaseaktivität mit einem neuen und schnellen phänotypischen Testsystem mittels eines Fluoreszenzsubstrates in Ab- und Anwesenheit der verschiedenen Inhibitoren gemessen. Durch den Vergleich mit Wildtyp-Werten konnten die entsprechenden Resistenzfaktoren berechnet werden. Ergebnis: Von den 12 untersuchten Patienten zeigten sich in 3 "DNA/RNA-Paaren" signifikante Unterschiede in mindestens einem Proteaseinhibitor, während bei 9 Patienten übereinstimmende Resistenzmuster gefunden wurden. Schlussfolgernd wird festgestellt, dass die Verwendung von entweder DNA oder RNA als Ausgangssubstanz für den benutzten Resistenztest unterschiedliche Ergebnisse im Resistenzmuster erbringen kann, dies aber nicht notwendigerweise der Fall ist. Zwischen dem Auftreten bzw. Fehlen von unterschiedlichen Resistenzmustern und den virologischen und immunologischen Parametern Viruslast und Anzahl der CD4 positiven Zellen konnte keine klare Korrelation festgestellt werden. Ein Auftreten von Differenzen zwischen den Resistenzmustern von DNA und RNA kann die Folge eines Populationswechsels der HIV-RNA sein, die im Gegensatz zur archivarischen Natur der meist integrierten DNA aus ruhenden CD4 positiven T-Gedächtniszellen oder Monozyten erst kürzlich von aktiv infizierten Zellen produziert wurde. Ein Fehlen von Unterschieden kann bedeuten, dass die Hauptfraktion der DNA entweder erst kürzlich generiert wurde oder die RNA sich nicht verändert hat. Für die diagnostische Anwendung des PRT haben diese Ergebnisse folgende Konsequenzen: um die aktuelle Resistenzsituation abzubilden, ist virale RNA aus dem Blutplasma das bevorzugte Ausgangsmaterial. Um dagegen stille Mutationen aufzudecken, die z.B. für zukünftige Therapien oder eine adäquate Postexpositionsprophylaxe von Bedeutung sind, sollte virale DNA, stammend aus PBMCs des Vollblutes, verwendet werden.

In dieser Arbeit wurden drei Aspekte der Reifung der Hydrogenasen in E. coli näher untersucht: 1. Eine Deletion im carAB-Locus führt zum Verlust der Synthese aktiver Hydrogenasen in E. coli. Die Aktivität kann wiederhergestellt werden, wenn der Stamm mit einem carAB-tragenden Plasmid transformiert oder wenn er in Anwesenheit von Citrullin angezogen wird. Da der carAB-Locus für das Enzym der Carbamoylphosphat-Synthese kodiert und Citrullin in der Zelle in Carbamoylphosphats umgewandelt werden kann, ist Carbamoylphosphat die Ausgangssubstanz für die Synthese der Liganden des Metallzentrums. Aufgrund seiner Struktur wurden Reaktionsmechanismen postuliert, über die es in CN- und/oder CO-Einheiten umgewandelt werden kann. 2. Dem HypF-Protein konnte die biochemische Funktion einer Carbamoylphosphat-Phosphatase zugeschrieben werden, zusätzlich besitzt es eine an die Anwesenheit von Carbamoylphosphat gekoppelte ATP-hydrolysierenden Aktivität. Die ATP-Hydrolyse durch HypF führt zur Bildung von AMP und PPi und sie geht parallel mit der Ausbildung eines adenylierten Reaktionsintermediats wie über die Pyrophosphat-ATP-Austausch-Reaktion gezeigt wurde. Beim adenylierten Intermediat handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um Carbamoyl-Adenylat. Es wird postuliert, dass dieses Substrat vom HypE-Protein zur Bildung des CN-Liganden durch einen Wasserentzug über eine PurM-ähnliche Reaktion verwendet wird. Durch spezifische Mutagenisierung konnten HypF-Varianten konstruiert werden, die zur Bildung aktiver Hydrogenasen unfähig waren. Die drei strukturell auffälligsten Motive des HypF-Proteins (Acylphosphat-Phosphatase-, Zink-Finger- und O-Carbamoyl-Transferase-Motiv) sind wichtig für die optimale Reifung der Hydrogenasen. Diese in vivo Unfähigkeit der Mutanten aktive Hydrogenasen zu synthetisieren geht mit dem Verlust der Carbamoylphosphat-Phosphatase einher. 3. Die kristallographische Analyse des HybD-Proteins als Beispiel einer spezifisch an der Hydrogenasen-Reifung beteiligten Protease, zeigte die Anwesenheit einer essentiellen Metallbindetasche, an deren Ausbildung Glu, Asp und His beteiligt sind und die in einer Peptidbindungsfurche liegt. Die Metalltasche fungiert spezifisch als Nickelerkennungsstelle in der Prozessierung, da nur Nickel-enthaltendes Apo-Protein prozessiert werden kann