Podcasts about abc transporter

A new editorial paper was published in Oncotarget on September 8, 2022, by researchers Jingwen Zhu, Joseph N. Miller and John D. Schuetz from St. Jude Children's Research Hospital in Memphis, Tennessee, entitled, “An ABC transporter as a potential target against SHH-Medulloblastoma: From Benchtop to Bedside.” Medulloblastoma (MB) is a common malignant pediatric brain tumor divided into four main subgroups (WNT, SHH, Group 3 and 4). The most prevalent MB in children

ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010]. In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren. In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005]. Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist. Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet. Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert. Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005). Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben.

The effective uptake of inorganic phosphate by cells from the environment depends on specific transport systems. In bacteria, these uptake systems are well characterized and most species contain both secondary transporters as well as primary uptake systems belonging to the ABC-family of transporters. Under phosphate starvation, genes coding for high-affinity phosphate transporters are induced in bacteria as well as in eukarya. In E. coli these are genes of the phosphate-specific transport via Pst or the Glycerol-3-phosphate-specific transporter, Ugp. Archaea possess the PHO stimulon, which induces numerous genes in response to phosphate limitation. So far this stimulon has only been described for Halobacterium salinarum R1. The genome of H. salinarum encodes ABC transporters resembling the Pst and Ugp systems of E. coli which are upregulated under Pi-limited conditions. In this study, the gene expression and function of the phosphate dependent operons pst1, pst2 and ugp of H. salinarum were investigated. First, it was shown that the three operons (pst1, pst2 und ugp) are transcribed as one polycistronic unit. The respective promoters are located upstream of the first ORF (open reading frame) of the operons, and transcription start sites (TSS) were mapped. Two TSSs were found for the pst1 operon, and are utilized in a phosphate dependent manner. Through an unknown regulation mechanism, the cell switches transcription of pst1 mRNA to either a transcript with or without a 60 nt long leader sequence. The transcripts of the pst2 and ugp operons have no 5’UTRs, regardless of phosphate concentration. Using a Ppst1-bgaH reporter system, it was observed that the transcripts with or without a leader sequence have different translation efficiencies. The transcript without a 5‘UTR had a 150-fold higher translation efficiency than the transcript with a 5‘UTR. It was concluded that the expression of the pst1 operon is modulated through a post-transcriptional regulation mechanism. To our knowledge, this is the first identified archaeal protein-coding operon that is transcribed by alternative promoters. The differences in phosphate dependent gene expression of the pst1, pst2 and ugp operons were investigated using the bgaH reporter system. Under phosphate saturated conditions, the expression of the pst2 operon is stronger compared to the expression of the pst1 operon, whereas under phosphate limited conditions, pst1 operon expression is highly induced. This assay system also identified the TATA boxes of the pst1 and pst2 promoters as well as AT-rich motifs, named P boxes. Mutations in the P box, with the consensus ATATWWW , reduced the promoter activity of both the pst1 and pst2 promoters. The results indicated that the TATA-2 box of the pst1 promoter has an impact on the phosphate dependent promoter activity under phosphate limited conditions and could be used as a P box. In the second part of the study, the proposed functions of the transporters Pst1, Pst2 and Ugp and the kinetic parameters were determined. Different knockout mutants were constructed, and these showed that the Pst transporters had different phosphate affinities. It was concluded from the results that the binding proteins PstS1 and PstS2 can interact with both transporters. The phosphate transport systems Pst1 and Pst2 are used differently. Under phosphate saturated conditions the cell operates mainly with the lower-affinity Pst2 transporter. If phosphate becomes limiting in the environment, predominantly the high-affinity transporter Pst1 is induced. This process is regulated on the transcriptional as well as on the post-transcriptional level. Furthermore, it was shown that a deletion of the Pst1 transporters leads to a loss of phosphate-directed chemotaxis under Pi-stress. This result confirms the importance of the Pst1 transporter under phosphate limited conditions. In related studies, growth experiments showed that the Ugp transporter is the only transporter for glycerol-3-phosphate in H. salinarum. In addition, the search for a regulatory protein that is involved in the regulation of the genes of the PHO stimulon did not reveal any likely candidates, but it was shown that deletion of the pst1 operon leads to an induction of the pst2 operon.

ABCG2 is a transporter protein that has the ability to efflux many drugs and fluorescent dyes. Primitive haematopoietic stem cells highly express ABCG2 and the expression level decreases as these cells differentiate indicating a possible role of this transporter in HSC. In the present study, we have analyzed the role of ABCG2 in early haematopoietic stem cells by constitutively expressing ABCG2 in human CB derived CD133+ cells. This constitutive expression of ABCG2 demonstrated an enhancement of primary CFCs in vitro, including the most primitive clonogenic cells the CFU-GEMM (n=12, p

Peroxisomales Targeting und Import von Proteinen in Peroxisomen sind für die Entstehung, Wachstum und Funktion von Peroxisomen entscheidend. Ziel dieser Dissertation war, die Region und das Aminosäure-Motiv innerhalb des Adrenoleukodystrophie-Proteins (ALDP) zu identifizieren, welches für das peroxisomale Targeting erforderlich ist. Dieses peroxisomale Membran-Protein ist defekt oder fehlend bei der X-gebundenen Adrenoleukodystrophie, einer überwiegend in der Kindheit auftretenden letalen neurodegenerativen Erkrankung. Unter Verwendung von Deletions- und GFP-Fusionsprotein-Konstrukten konnte die für das peroxisomale Targeting notwendige Region des humanen ALDP auf die Aminosäuren 67-110 eingegrenzt werden. Dabei sind die NH2-terminalen 66 Aminosäuren des ALDP für das peroxisomale Targeting zwar nicht notwendig, sie erhöhen jedoch die Targeting-Effektivität insgesamt. Die für das Targeting notwendige Region ist allerdings alleine nicht auseichend, um ein Fusionsprotein an das Peroxisom zu leiten. Zusätzliche Aminosäuren scheinen für die Stabilisierung und Insertion in die peroxisomale Membran notwendig zu sein, da die Aminosäure-Regionen 1-110 und 67-164 ein Fusionsprotein an das Peroxisom dirigieren können. GFP-Fusionsproteine der dem 67-164 ALDP entsprechenden Regionen des humanen peroxisomalen Membran-Proteins 69 und des Pxa1 der Hefe wurden ebenfalls an das Peroxisom geführt. Damit konnte eine partielle Konservierung der Targeting-Region innerhalb der humanen peroxisomalen ABC-Transporter und zwischen Hefe und Mensch gezeigt werden. Die Targeting-Region beinhaltet ein 14 Aminosäuren (71-84) umfassendes konserviertes Motiv. Eine Deletion des gesamten Motivs oder von Teilen dieses Motivs führt zu einem Verlust des peroxisomalen Targetings des ALDP. Von den getesteten Mutationen einzelner Aminosäuren bewirkt lediglich die Substitution L78F eine signifikante Verminderung der Targeting-Effektivität. Dagegen führt die bei zwei X-ALD Patienten beobachtete Deletion von drei Aminosäuren innerhalb des Motivs zu einem Verlust des peroxisomalen Targetings mit einer partiellen Anreicherung des GFP-Fusionsproteins in Mitochondrien und gibt somit Aufschluss über die molekulare Ätiologie ihrer Erkrankung.

Die Superfamilie der ABC-Proteine ist eine der größten bisher bekannten Proteinfamilien. Ihre Mitglieder enthalten ein oder zwei nukleotidbindende Domänen mit je einem Walker A- und B-Motiv, sowie das charakteristische ABC-Motiv. Ein Großteil darunter sind Membranproteine, die zusätzlich ein oder zwei Transmembrandomänen besitzen. Diese ABC-Transporter sind vor allem in Mensch und Hefe charakterisiert, wo sie in zahlreichen Transportprozessen über die Membranen involviert sind. Über die Funktion der ABC-Transporter in pflanzlichen Organismen ist wenig bekannt, jedoch gibt es Hinweise dass diese Proteinfamilie in Pflanzen auch an der Kompartimentierung von Fremdstoffmetaboliten beteiligt ist. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana wurden 103 ABC-Transportergene annotiert, die sich in 9 Subfamilien aufteilen. Experimentell nachgewiesen wurden bisher lediglich 6 Mitglieder aus 2 Subfamilien. In dieser Arbeit wurden 28 ABC-Transporter aus 6 Subfamilien, davon 4 bisher nicht untersuchte, hinsichtlich organspezifischer Expression und Induktionsverhalten nach Herbizid- bzw. Safenerbehandlung untersucht. Dazu wurde ein DNA-Array ("Detox-Array") mit genspezifischen Sonden zur parallelen Transkriptanalyse etabliert. Zusätzlich wurden in Zusammenarbeit mit anderen Projekten weitere Genfamilien mit einbezogen, die potenziell an der Detoxifizierung von Xenobiotika beteiligt sind (Cytochrom P450 Monooxygenasen, Glutathion-S-Transferasen und UDP-Glycosyltransferasen), um Koregulationen einzelner Mitglieder der unterschiedlichen Genfamilien untersuchen zu können. Um die Unterscheidung auch hoch homologer Mitglieder dieser Familien zu ermöglichen, wurden Sonden aus dem 3‘-untranslatierten Bereich dieser Gene entwickelt und auf ihre Eignung zur Transkriptmessung untersucht. Die Expressionsanalyse der ABC-Transporter in Wurzeln, Stängeln, Blättern, Blütenständen und Schoten zeigte neben den sechs bereits bekannten ABC-Transportern Transkripte von 21 weiteren Vertretern. Die meisten waren in der Wurzel (26 von 28) nachzuweisen, die wenigsten (7 von 28) im Blatt. Am höchsten exprimiert waren AtMRP12 und AtPDR8 in der Wurzel und AtMRP5 in der Schote. Die Induktion der ABC-Transporter durch Xenobiotika wurde an Pflanzen 24h oder 36h nach Behandlung mit unterschiedlichen Chemikalien (Primisulfuron, Bromoxynil, Benoxacor) in sublethalen Dosen untersucht. Für die beiden Herbizide typische Schäden konnten erst 3 Tage nach der Behandlung beobachtet werden. Neben der in der Literatur beschriebenen Primisulfuron-Induktion von AtMRP3 (Tommasini et al., 1997) waren AtPDR8, AtMRP5, AtMRP4 und AtAOH1 transient nach 24h induziert. Mit einem Antiserum, das gegen die Subfamilie der PDR-Transporter erzeugt worden war, konnte deren Induktion durch Primisulfuron und Benoxacor auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Eine spezifische 6-fache Induktion nach Bromoxynil-Behandlung zeigte der ABC-Transporter AtTAP1. Die sechs genannten ABC-Transporter stellen somit Kandidaten dar, die an der Kompartimentierung von Metaboliten beteiligt sein können. Dabei kann es sich entweder um Primisulfuron- bzw. Bromoxynilmetabolite oder durch die Behandlung mit den Xenobiotika entstandene endogene Metabolite handeln. Eine Hauptkomponentenanalyse der Expressionsprofile zeigte, dass auf der Basis der auf dem Detox-Array vertretenen, aus dem Entgiftungs- und Sekundärmetabolismus ausgewählten Genfamilien eine eindeutige Unterscheidung der Antwort auf die verschiedenen Herbizide abgeleitet werden kann. Weitere Daten aus Kollaborationen mit anderen Projekten wurden in einer zweiten Hauptkomponentenanalyse mit einbezogen und zeigen, dass die Unterschiede vor allem auf die sekundären Auswirkungen der Herbizide zurückzuführen sind. Die dabei gefundene Koregulation der Primisulfuron-Behandlung mit der Reaktion auf das Signalmolekül Salicylsäure und ein bakterielles Pathogen ließ weiter schließen, dass Primisulfuron einen Elicitor-ähnlichen Effekt auf die Pflanze hat. Zur weiterführenden Funktionsanalyse von ABC-Transportern wurden parallel zu diesen Arbeiten knock-out Mutanten gesucht. In einer Kollektion des MPI für Züchtungsforschung in Köln konnten zwei Mutanten identifiziert werden, die jeweils ein En-Transposon innerhalb der offenen Leserahmen von AtPDR4 bzw. AtMDR4 besitzen.

1. Der Aufbau des Membranpotentials und die ATP-Synthese in H. halophilus wurden durch Cl- nicht beeinflußt. Zusammen mit den Ergebnisse früherer Studien gibt es keinen Hinweis darauf, daß Cl- an der primären Bioenergetik von H. halophilus beteiligt ist. 2. Es wurde ein unter Hochsalzbedingungen induziertes, Cl--abhängiges Transportsystem für das kompatible Solut Betain identifiziert und charakterisiert. Dieses System transportiert Betain mit einer maximalen Geschwindigkeit von Vmax.= 14,0 ± 0,2 nmol/min x mg Protein und hat einen Km-Wert für Betain von 72,8 ± 10,4 µM. Die Ergebnisse der durchgeführten Hemmstoffstudien deuten darauf hin, daß die Betain-Aufnahme in H. halophilus über einen primären Transportmechanismus erfolgt. 3. Die Beweglichkeit von H. halophilus auf Weichagarplatten zeigt eine klare Cl--Abhängigkeit. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte festgestellt werden, daß die Flagellenbildung in H. halophilus Cl--abhängig ist. Das Flagellin wurde gereinigt, und es wurde ein spezifisches Antiserum dagegen hergestellt. 4. Immunologische Analysen ergaben, daß die Synthese des Flagellins Wachstumsphasen-abhängig war. In der log-Phase und in der frühen stationären Phase wurden große Mengen an Flagellin nachgewiesen, während die Flagellinkonzentration in der späten stationären Phase zurückging. Interessanterweise war die Flagellinsynthese zu jedem Zeitpunkt des Wachstums Cl--abhängig; in Abwesenheit von Cl- war kein Flagellin nachzuweisen. Dies ist der erste Nachweis einer Cl--abhängigen Proteinproduktion in einem Prokaryonten. 5. Es wurde eine Plasmid-Genbank aus chromosomaler DNA von H. halophilus generiert, die 5807 Klone mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 4415 Bp enthält. Dies entspricht einer Wahrscheinlichkeit von 99,8%, daß sämtliche Bereiche des Genoms von H. halophilus abgedeckt wurden. Die für das Flagellin (fliC) und die β-Untereinheit der F1FO-ATP-Synthase (atpD) aus H. halophilus kodierenden Gene wurden mit Hilfe von Koloniehybridisierungen in der Genbank identifiziert. Anschließend wurden Teile dieser Gene kloniert und sequenziert. 6. Northern-Blot- und RT-PCR-Analysen zeigten, daß die Transkription von fliC durch Cl- um den Faktor 2 stimuliert wird. Dies ist der erste Nachweis einer durch Cl- stimulierten Transkription eines Gens mit bekannter Funktion. 7. Versuche zur Substitution von Cl- durch kompatible Solute ergaben, daß Glutamat, Succinat und Fumarat die Cl--Abhängigkeit des Wachstums von H. halophilus aufheben können. Für Glutamat wurde gezeigt, daß dies auf die nicht Cl--abhängige Aufnahme von Glutamat zurückzuführen ist. Für die Beweglichkeit und die Flagellinsynthese wurde gezeigt, daß Glutamat Cl- nicht effektiv substituieren kann. 8. Mit Hilfe von 2D-gelelektrophoretischen Studien konnten 5 weitere Cl-- abhängig synthetisierte Proteine in H. halophilus nachgewiesen werden. Die Identifizierung dieser Proteine erfolgte durch N-terminale Sequenzierung und nachfolgender Suche nach ähnlichen Proteinen in Datenbanken. Zwei davon, YvyD und SodA, gehören zum σB-Regulon von B. subtilis. YvyD ist von besonderem Interesse, da es als σ-Faktor modulierendes Protein an der Cl-- abhängigen Signaltransduktionskette, die von der Wahrnehmung des Reizes zur Genexpression führt, beteiligt sein könnte. Ein drittes Protein (YhfK) ist Aspartatund Glutamat-Semialdehyd-Dehydrogenasen sehr ähnlich. Das vierte Protein ist der ATP-bindenden Untereinheit verschiedener ABC-Transporter sehr ähnlich. Das fünfte identifizierte Protein, LuxS, ist in Gram-negativen an der Biosynthese von Autoinduktoren beteiligt. 9. Teile der Gene, die in H. halophilus für YvyD bzw. LuxS kodieren, wurden mit Hilfe von degenerierten Oligonukleotiden per PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. 10. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, daß 11 von 44 darauf untersuchten Arten Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien eine Cl-- abhängige Osmotoleranz aufweisen. Dies waren: Aeromonas hydrophila, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Paracoccus denitrificans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Thermus thermophilus und Vibrio fischeri.