Podcasts about virush

Viren können ihre eigene Erbinformation in unseren Zellkern einschleusen, damit unsere Zellen den Virus vermehren. Wenn man deshalb einen Schnupfen bekommt, ist das lästig. Aber was, wenn man sich diese Eigenschaft der Viren auch zu Nutze machen kann? Können Viren verwendet werden, um Gene in Zellen zu bringen, damit man so genetische Erkrankungen heilen kann? Genau das ist das Konzept der Gentherapie. Mehr dazu erfahren Sie in dieser Podcastfolge von unserem Gast Dr. Immanuel Seitz.

https://www.instagram.com/drkasten/ Zunächst einmal möchten wir einen Irrtum aufklären☝

Siste nytt fra VG kl. 07.00.

Herpesviren umfassen eine große Gruppe von human- sowie tierpathogenen Erregern. Auf Grund ihrer hohen Durchseuchungsrate und Fähigkeit zur Etablierung einer latenten Infektion stellen humane Herpesviren vor allem für immunsupprimierte Patienten eine ernsthafte Bedrohung dar. Deshalb ist eine umfassende Aufklärung des viralen Replikationszyklus für die Entwicklung von antiviralen Therapiestrategien zwingend erforderlich. Besonders die membran-assoziierten Vorgänge der Virionmorphogenese - primäre Umhüllung an der inneren Kernmembran mit darauffolgendem Verlust der Virushülle an der äußeren Kernmembran sowie sekundäre Umhüllung an cytoplasmatischen Membranen - sind nur unvollständig entschlüsselt. Um das komplexe Zusammenspiel der viralen Proteine während des Replikationszyklus an den verschiedenen zellulären Membranen aufzudecken, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine genomweite Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) der durch Herpes simplex-Virus 1 (HSV-1) kodierten Membranproteine durchgeführt. Außerdem lieferte die Identifizierung von PPI zwischen dem HSV-1 Proteom und Untereinheiten der zellulären ESCRT-Maschinerie (endosomal sortingcomplex required for transport) weitere Belege für die Ausbeutung von Wirtsfaktoren durch das Virus zur Knospung der Partikel. Zur Detektion der genomweiten PPI sowohl intraviral als auch zwischen Virus und Wirt wurde das Hefe-2-Hybridsystem (Y2H) im Hochdurchsatz angewandt. Beide Datensätze konnten eine Vielzahl neuer PPI aufdecken und somit eine solide Grundlage für Interaktionsnetzwerke und zukünftige funktionale Studien schaffen. Auch wurde duch das breite Interaktionsspektrum des Virus mit den z.T. funktionell redundanten ESCRT-Proteinen erneut veranschaulicht, wie die Nutzung flexibler Strategien zur Stabilität des HSV-1 beiträgt. Anhand der Y2H-Analysen wurde ein virales Membranprotein als interessanter Kandidat zur funktionalen Charakterisierung ausgewählt. Glykoprotein M (gM/UL10) von HSV-1 ist ein Typ-III Transmembranprotein, das während der Infektion in verschiedenen Membrankompartimenten lokalisiert. Obwohl evolutionär konserviert, ist es zumindest für HSV-1 nicht-essenziell und seine molekulare Funktion unklar. Auch die funktionale Relevanz einiger potenzieller trafficking Motive von gM ist noch nicht aufgeklärt. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das targeting von gM zum trans-Golgi Netzwerk (TGN) unabhängig von anderen viralen Faktoren sowie seinen potenziellen C terminalen trafficking Motiven erfolgt und keiner Homooligomerisierung bedarf. Erstaunlicherweise führt die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (gMΔC) zu seiner Retention im ER, wohingegen der Vorwärtstransport durch eine kurze, nicht-verwandte Sequenz wiederhergestellt wurde. Demzufolge enthält die C-terminale Domäne von gM wahrscheinlich keine Sequenzinformation für das targeting vom ER zum Golgi-Apparat, jedoch scheint die Faltung und Integrität des Proteins dafür von Bedeutung zu sein. Im Kontext der Virusinfektion führte die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (HSV-1 gMΔC) zur Akkumulation von nicht-umhüllten Partikeln im Cytoplasma, verminderter Freisetzung von Viruspartikeln und in ihrer Infektiosität beeinträchtigten reifen Virionen. Alle Effekte wurden durch eine Revertante wieder aufgehoben und sind demnach spezifisch. Im Gegensatz dazu zeigten zwei zusätzliche Mutanten, HSV-1 ΔgM mit einem frühzeitigen Stoppcodon an Position 3 von UL10 und gMΔac ohne potenzielle trafficking Motive, Wildtyp-ähnliche Wachstumskinetiken. Daraus lässt sich schließen, dass zwar gM entbehrlich ist, gMΔC jedoch einen dominant-negativen Effekt ausübt. Daher wird eine Beteiligung der N-terminalen Bereiche von gM (Aminosäuren 1-361) an der Rekrutierung von viralen und/oder zellulären Faktoren zum Ort der sekundären Umhüllung postuliert. Diese Daten enthüllen neue unbekannte Eigenschaften von HSV-1 gM.

Das Tollwutvirus (Rabies Virus (RV)) ist ein neurotropes Virus aus der Familie der Rhabdoviridae innerhalb der Ordnung Mononegavirales. RV Partikel werden an der Zelloberfläche durch Membran-Budding gebildet. Dabei wird der virale Ribonukleoproteinkomplex (RNP) durch das Matrixprotein (M) in eine Membranhülle verpackt in der Trimere des Transmembran-Glykoproteins (G) selektiv inkorporiert werden. Die G Spikes vermitteln die Bindung der Virionen an zelluläre Rezeptoren und die Fusion der viralen und zellulären Membran. Auch in Abwesenheit des G werden Viren freigesetzt, da der Budding-Prozess hauptsächlich durch das M Protein vermittelt wird. Das G-unabhängige Budding der Rhabdoviren erlaubt den Austausch der Oberflächenproteine (Envelope-Switching), wodurch es zu einem veränderten Tropismus (Re-targeting) der RV kommt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die G Proteine der Lyssaviren Mokola, Bat Hamburg und Lagos Bat, aber auch des RV-Stammes Challenge Virus Strain (CVS) für den spezifischen Neurotropismus dieser Viren verantwortlich sind. Der für die Inkorporation von Fremdproteinen in die Virushülle essentielle Bereich des RV G (tm) wurde verwendet, um chimäre Typ I Transmembranproteine aus dem rot-fluoreszierenden Protein (RFP) und RV G (tm-RFP) zu konstruieren und in die Virushülle G-defizienter und Wildtyp Tollwutviren zu inkorporieren. Fusionsproteine aus tm und zellulärem Prionprotein (tm-PrPC) wurden nicht an die Bereiche der Zellmembran transportiert, an denen Tollwutvirus-Budding stattfindet. Diese Konstrukte könnten daher verwendet werden, um den Ort des RV-Budding näher zu bestimmen, während die Inkorporation fluoreszierender Proteine in die Virushülle die direkte Visualisierung von einzelnen Stadien des Tollwutvirus-Lebenszyklus wie z.B. Virustransport oder Entry in lebenden Zellen ermöglicht. Aufgrund der G-vermittelten transsynaptischen Ausbreitung der Rhabdoviren in neuronalen Netzwerken, wurden die Fluoreszenz-markierten RV Partikel auch als neuronale Marker zur Untersuchung der Physiologie und Morphologie neuronaler Netzwerke verwendet. Der retrograde, axonale Transport der RV zum Zentralen Nervensystem ist eine essentielle Voraussetzung für die letale RV-Erkrankung. Durch die Verwendung von RV Partikeln mit tm-RFP-markierter Virushülle und eGFP-markiertem RNP konnte gezeigt werden, dass zweifarbige, also umhüllte Virionen entlang der neuronalen Ausläufer von in vitro differenzierten und primären Neuronen transportiert wurden, wobei der retrograde Transport in den in vitro differenzierten Neuronen mit einer konstanten Durchschnittsgeschwindigkeit von 0,1 µm/sek und einer durchschnittlichen Transportlänge von 25 µm erfolgte.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der UL11- und UL20-Homologe des equinen Herpesvirus Typ 1 (EHV-1). Dabei sollte vor allem auf deren Funktionen in späten Stadien des Replikationszyklus und auf ein mögliches Zusammenspiel eingegangen werden. Zunächst wurde das UL20-Protein identifiziert und sowohl strukturell als auch funktionell charakterisiert. Ein in Kaninchen hergestelltes Antiserum reagierte in Western Blot-Analysen spezifisch mit zwei Proteinen mit apparenten Molekulargewichten von 25 und 75 kDa, und trotz zweier Konsensussequenzen im offenen Leserahmen UL20 führte eine Hemmung der N-Glykosylierung des Proteins zu keiner Veränderung dieser Laufeigenschaften. Das Protein, das ab 6 h p.i. in Zellen nachweisbar war, wurde der Klasse der γ1-Proteine zugeordnet und als Bestandteil der Virushülle identifiziert. Eine Assoziation des UL20-Proteins mit zellulären Membranen zeigte sich nach Fraktionierung infizierter Zellen und nach Immunfluoreszenzfärbung UL20-exprimierender Zellen. UL20-Deletionsmutanten der EHV-1-Stämme RacL11 und RacH wurden über BAC-Mutagenese hergestellt. Die negativen Viren führten in Einschritt-Wachstumskinetiken zu bis zu 1000fach geringeren extrazellulären Titern als die entsprechenden Wildtyp-Viren. Die intrazelluläre Infektiosität war dagegen nur um das 3fache erniedrigt. Diese Ergebnisse wiesen auf eine Funktion von pUL20 beim späten "viral egress" hin. Eine Bedeutung des Proteins im "cell-to-cell-spread" wurde durch Untersuchung des Plaquephänotyps gezeigt. Während die Ausgangsviren und Revertanten zu deutlichen Plaques führten, bestanden die Plaques der Deletionsmutanten aus nur wenigen infizierten Zellen. Eine initiale Charakterisierung des UL11-Proteins von EHV-1 liegt bereits vor. Das Tegumentprotein, das eine Konsensussequenz für eine N-Myristylierung aufweist, assoziiert in infizierten Zellen mit Membranen und spielt eine Rolle im "viral egress" und vor allem im "cell-to-cell-spread". Zur genaueren Einordnung dieser Funktionen wurden die Auswirkungen der Deletion des Großteils der UL11-spezifischen Sequenzen auf die Replikation von EHV-1 in Zellkultur vor dem genetischen Hintergrund verschiedener EHV-1-Isolate (RacL22, RacL11), -Stämme (KyA) und -Mutanten (L11Δ49) untersucht. Sämtliche rekombinante Viren waren auf nicht komplementierenden Zelllinien vermehrungsfähig. Das UL11-Protein ist daher auch in Verbindung mit der Deletion der für die Glykoproteine E und I kodierenden Gene (KyA) bzw. der fehlenden Expression des UL49-Proteins für die Replikation von EHV-1 in Zellkultur als nicht essentiell anzusehen. Die Bestimmung eines Wachstumswertes der Deletionsmutanten und Ausgangsviren ergab jedoch Hinweise auf eine mögliche Interaktion von pUL11 mit den Glykoproteinen E und I bzw. dem Tegumentprotein pUL49. Die Funktion des UL11-Proteins im "cell-to-cell-spread" konnte durch Untersuchung des Plaquephänotyps, bei dem die UL11-deletierten Viren zu deutlich kleineren Plaques als die Ausgangsviren führten, bestätigt, jedoch nicht genauer definiert werden. Untersuchungen eines in seiner Myristylierungs-Sequenz mutierten UL11-Proteins ergaben weder eine Verschiebung der Laufeigenschaften im Western Blot, noch eine veränderte Verteilung in der transfizierten Zelle. Allerdings konnte eine Assoziation von pUL11 mit Lipid Rafts gezeigt werden. Diese muss über eine Modifikation des Proteins durch Myristylierung oder Palmitylierung vermittelt sein. Das UL20-Protein dagegen war nicht spezifisch in den Lipid Rafts angereichert. Von einem Zusammenspiel der beiden Proteine in diesen Membranbereichen in ihrer Funktion beim "cell-to-cell-spread" ist daher nicht auszugehen.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.