Podcasts about g proteinen

Die vorliegend präsentierten Experimente hatten zum Ziel, die hypothetische Rolle von Gq/11- bzw. G12/13-koppelnden heptahelikalen Transmembrandomänenrezeptoren (7TMR) als Mechanosensoren für die Initiation des myogenen Tonus zu untersuchen. Um festzustellen, welche 7TMR hierfür besonders relevant sind, wurden Leitungsgefäße mit Widerstandsgefäßen in ihren RNA-Leveln für eine Reihe von 7TMR verglichen. Dies geschah auf der Grundlage, dass Leitungsgefäße einen geringeren myogenen Tonus aufweisen als Widerstandsgefäße. Eine aus höheren RNA-Leveln ableitbare größere Anzahl an putativen Sensormolekülen sollte also über eine größere Mechanosensitivität des Gefäßes zu einem höheren Ausmaß an myogener Vasokonstriktion führen. Die RNA-Level wurden mittels quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) bestimmt. Die Quantifizierung erfolgte relativ zum geometrischen Mittel dreier Haushaltsgene. Die untersuchten Widerstandsgefäße umfassten kleine Mesenterialarterien, Nierenarterien und Gehirnarterien. Die untersuchten Leitungsgefäße umfassten die A. mesenterica superior, Bauchaorta, A. carotis communis und die Pulmonalarterie. Folgende Rezeptoren stellten sich in der qRT-PCR aufgrund ihres Expressionsprofils als vielversprechende molekulare Sensorproteine in Widerstandsgefäßen heraus: AT1B-Angiotensinrezeptor, ETA-Endothelinrezeptor, V1A-Vasopressinrezeptor, �1A-Adrenozeptor. In einem zweiten Schritt wurde versucht, über pharmakologische Inhibition der vorgenannten Rezeptoren eine Reduktion des myogenen Tonus zu erreichen. Die eingesetzte Methode war die isobare Konstriktionsmessung (Arteriographie) an isolierten kleinen Mesenterialarterien. Die Methode erforderte vor der eigentlichen Applikation der Pharmaka die Registrierung eines myogenen Tonus in Abwesenheit jeglicher Pharmaka. Dann erst wurde der myogene Tonus unter Anwesenheit von Pharmaka ein zweites Mal registriert. Bei der genaueren Analyse des ersten myogenen Tonus fiel dessen bisigmoider Verlauf auf. Möglicherweise liegt dieser charakteristischen Form eine zeitversetzte Aktivierung der an die putativen mechanosensitiven 7TMR koppelnden G-Proteine zugrunde: Zunächst werden wahrscheinlich Gq/11-Proteine aktiviert, dann G12/13-Proteine. Bei der Analyse des Kurvenverlaufs zum zweiten myogenen Tonus zeigte sich unter Kontrollbedingungen, d.h. unter Abwesenheit von Pharmaka, eine Linksverschiebung relativ zum ersten myogenen Tonus. Darüberhinaus änderte sich die Kurvenform von bisigmoid zu monosigmoid. Wahrscheinlich sind auch für diese Charakteristika Eigenheiten der an die putativ mechanosensitiven 7TMR koppelnden G-Proteine verantwortlich: Die im Zuge des ersten myogenen Tonus aktivierten G12/13-Proteine inaktivieren möglicherweise langsamer durch GTP-Hydrolyse als die Gq/11-Proteine. Deshalb könnten zu Beginn des zweiten myogenen Tonus beide G-Protein-Spezies aktiv sein und so die Mechanosensitivität der glatten Muskelzellen drastisch erhöhen, was die Linksverschiebung erklären würde. Die nun konzertiert erfolgende G-Protein-Aktivierung könnte ferner den monosigmoiden Kurvenverlauf erklären. Die Applikation der Pharmaka erfolgte zunächst als Kombination von antagonistischen Substanzen an AT1-, ETA-, V1A- und �1-Rezeptoren. Eingesetzt wurden Candesartan, BQ-123, Relcovaptan und Prazosin. Diese Kombination reduzierte den myogenen Tonus signifikant in seiner Amplitude. Anschließend wurde Prazosin als Monosubstanz getestet. Der Hemmeffekt unterschied sich nicht von der ursprünglichen Viererkombination. Schließlich erfolgte eine Testung der ursprünglichen Kombination unter Auslassung von Prazosin. Auch hier war der hemmende Effekt derselbe. Zur Erklärung dieser Befunde wurde das Konzept der negativen Interferenz herangezogen: Dabei konkurrieren 7TMR um einen limitierten Pool an G-Proteinen. Inverse Agonisten (wie sie die Substanzen Candesartan und Prazosin darstellen) führen zu einer Sequestrierung von G-Proteinen an den jeweiligen Rezeptoren ohne folgende Signaltransduktion. Dabei könnte die Applikation eines inversen Agonisten dieselben Effekte erzielen wie eine kombinierte Applikation. Letztlich konnte durch den hemmenden Effekt von Prazosin für �1-Adrenozeptoren bestätigt werden, dass sie eine mechanosensitive Funktion ausüben. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse des qPCR-Teils handelt es sich wahrscheinlich um �1A-Adrenozeptoren. Deren Mechanosensitivität kann einen Teil der Kontraktion glatter Muskelzellen auf einen steigenden intravasalen Druck vermitteln und damit einen entsprechenden Anteil am myogenen Tonus erklären.

Die kotranslationelle Dekodierung des Kodons UGA als Selenocystein erfolgt durch eine spezifische tRNA (tRNASec), die von Seryl-tRNA Synthetase mit Serin beladen und anschließend von Selenocystein Synthase (SelA) zu Selenocysteyl- tRNASec umgesetzt wird. Selenophosphat, das als Selendonor für diese Reaktion dient, wird von Selenophosphat Synthetase (SelD) aus Selenid und ATP generiert. Der anschließende Transfer der beladenen tRNA zum Ribosom erfolgt durch den spezialisierten Elongationsfaktor SelB, dessen N-terminale Region Homologie zu EF-Tu zeigt und wie dieses Guanosin-Nukleotide und tRNA bindet. Der C-terminale Teil interagiert zusätzlich mit einer als SECIS-Element bezeichneten mRNA- Sekundärstruktur, die in Bakterien unmittelbar auf das für Selenocystein kodierende UGA-Triplett folgt und für dessen Rekodierung als Sinnkodon verantwortlich ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Mechanismen, die der Interaktion von SelB mit seinen Liganden sowie der Regulation der Selenocystein- Biosynthese durch SelB zu Grunde liegen. Im Einzelnen wurden dabei folgende Resultate erhalten: 1) Die strikte Diskriminierung zwischen Seryl- und Selenocysteyl-tRNASec durch SelB ist essentiell für das Funktionieren des Selenocystein inkorporierenden Systems. Eine gerichtete Mutatagenese der Aminoacyl-Bindetasche von SelB zeigte, dass die Selektivität der tRNA-Bindung vermutlich nicht auf einer spezifischen Erkennung des Aminoacyl-Rests beruht. Nach Zufallsmutagenese konnten vier SelB-Varianten isoliert werden, die in vivo eine erhöhte Aktivität mit Seryl-tRNASec besitzen. Zwei der Mutationen waren in der G-Domäne von SelB lokalisiert, die anderen beiden in Domäne 4a. Die biochemische Charakterisierung der mutierten Proteine ergab noch keinen Hinweis auf eine erhöhte Affinität der SelB-Varianten für Seryl-tRNASec, so dass andere Mechanismen für die Erweiterung der Aminosäure-Spezifität verantwortlich sein müssen. 2) Die Interaktion von SelB mit seinen Liganden wurde mit Hilfe von biochemischen und biophysikalischen Methoden analysiert. Der Elongationsfaktor zeigt im Gegensatz zu vielen anderen G-Proteinen eine höhere Affinität für GTP (KD = 0,74 µM) als für GDP (KD = 13,4 µM),was zusammen mit der hohen Dissoziationsrate von GDP (kdis = 15 s-1) darauf hinweist, dass der Nukleotidaustausch ohne Katalyse durch einen Austauschfaktor erfolgt. Die Kinetiken der Interaktion mit Guanosin-Nukleotiden werden durch die Gegenwart eines SECIS-Elements nicht beeinflusst. Die Affinität von SelB zu einem fluoresceinmarkierten SECIS-Transkript liegt im nanomolaren Bereich (KD = 1,23 nM), wobei die Assoziations- und Dissoziationskinetiken sehr schnell sind und durch die Gegenwart von Guanosin-Nukleotiden nicht verändert werden. In Gegenwart von Selenocysteyl-tRNASec wurde jedoch eine signifikante Verringerung der Dissoziationsgeschwindigkeit beobachtet, die zu einer Stabilisierung der Bindung führt und eine Interaktion zwischen der SECIS- und tRNA-Bindetasche nahelegt. Diese intramolekulare Wechselwirkung wurde durch Charakterisierung der isolierten mRNA-Bindedomäne von SelB bestätigt. Die Gleichgewichtslage der einzelnen Reaktionen führt zu einer gerichteten Bildung eines Komplexes aus SelB, GTP, Selenocysteyl-tRNASec und dem SECIS-Element, der durch seine hohe Stabilität auf der mRNA fixiert wird und gleichzeitig eine Konformation annimmt, die seine Interaktion mit dem Ribosom zulässt. 3) In der 5´-untranslatierten Region der selAB-mRNA wurde eine Sekundärstruktur identifiziert, die Ähnlichkeit mit dem SECIS-Element aufweist und mit der SelB spezifisch und mit hoher Affinität interagiert. Die Stabilität des Komplexes zwischen SelB und dem SECIS-ähnlichen Element erhöht sich in Gegenwart von Selenocysteyl-tRNASec. Eine Analyse der sel-Genexpression ergab, dass die Synthese von SelA und in geringerem Ausmaß SelB in genetischen Hintergründen, die eine Assemblierung des quaternären Komplexes aus SelB, GTP, Selenocysteyl- tRNASec und dem SECIS-ähnlichen Element erlauben, reprimiert ist. Mutationen in sel- Genen führen dagegen zu einer erhöhten intrazellulären Konzentration dieser Proteine. Mit Hilfe von Reportergen-Fusionen wurde gezeigt, dass die Repression der selA-Expression direkt von der Bildung eines quaternären Komplexes am SECIS-ähnlichen Element abhängig ist. Da diese keinen Einfluss auf die Transkription hat und nur zu einer schwachen Verringerung der mRNA-Menge führt, wurde gefolgert, dass das SECIS-ähnliche Element eine Regulation der Translationsinitiation am selA-Gen in Abhängigkeit vom Selenstatus der Zelle ermöglicht.

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit verschiedenartigen Aspekten zum Thema Opiatentzug. Dabei wurde die Funktionalität µ-Opioidrezeptor-gekoppelter G-Proteine in der intrazellulären Signaltransduktionskaskade im Entzug und unter chronischer Opiatverabreichung untersucht. Als Ergebnis dieser Studie, die mittels einer in situ [S35]-GTPγSAutoradiographie durchgeführt wurde, konnte die Erkenntnis bestätigt werden, nach der eine Adaption auf extern zugeführte Opioide nicht auf einer Veränderung von Rezeptoren oder deren Interaktion mit G-Proteinen beruht (Kapitel 2). Vielmehr scheinen intrazelluläre, durch Genexpression gesteuerte Mechanismen für eine erfolgreiche Adaption an veränderte Umweltbedingungen ausschlaggebend zu sein. Hierbei spielt eine veränderte Transkription von CREB und somit in Folge eine erhöhte Transkription der Adenylatcyclase eine tragende Rolle. Eine weitere Studie beschäftigte sich mit einem neuartigen Konzept zur Verstärkung von opioidagonistischen Wirkungen durch die Zugabe von Opioidantagonisten in geringer Dosierung (low dose Naloxon-Konzept, Kapitel 3). Hier konnte in verhaltensbiologischen Untersuchungen kein Effekt nachgewiesen werden. Insbesondere konnte nicht nachgewiesen werden, dass die Koverabreichung von low dose Naloxon während der Abhängigkeitsentwicklung Entzugserscheinungen moduliert. Beide Studien beschäftigen sich direkt und indirekt mit der in der Wissenschaft intensiv diskutierten Frage der Existenz von Gs-Proteingekoppelten Opioidrezeptoren, die neben den bereits bekannten Gi/o-Protein-gekoppelten Opioidrezeptoren in der Zellmembran lokalisiert sind. Ein autoradiographischer Nachweis hierzu steht bislang aus. Abhilfe könnte eine weiterentwickelte [S35]-GTPγSAutoradiographie schaffen, in der durch selektive Blockade der Gi/o-Protein-gekoppelten Opioidrezeptoren durch Pertussistoxin ein Nachweis Gs-Protein-gekoppelter Opioidrezeptoren in situ möglich sein müsste. Ein direkter Nachweis dieser Kopplung eröffnet völlig neuartige Perspektiven in der modernen Opioidpharmakologie, da durch selektive Liganden dieser Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Opiatwirkung in der klinischen Anwendung verstärkt werden könnte. Möglicherweise findet dieses Wirkprinzip bereits unbeabsichtigt seit Jahren Anwendung: der Opiatagonist Tilidin (Valoron N) kommt bei der Behandlung mittelschwerer bis schwerer Schmerzen zum Einsatz. Als Besonderheit ist diesem Präparat der Opiatantagonist Naloxon im Verhältnis 1:12,5 (Einzeldosis: 4 mg Naloxon/50 mg Tilidin) beigemischt, um eine missbräuchliche Anwendung zu unterbinden. Bei normaler therapeutischer Dosierung unterliegt der Naloxonanteil einem intensivenhepatischen Abbau, so dass Tilidin voll wirksam ist. Bei missbräuchlicher Einnahme hoher Dosen durch Opiatabhängige wird der Naloxonanteil nicht vollständig metabolisiert; Entzugssymptome werden provoziert oder bereits bestehende werden verstärkt. Tilidin selbst wird in der Leber zu Nortilidin und Binortilidin metabolisiert, wobei Nortilidin als der eigentliche Opiatagonist am Rezeptor angesehen wird (Schulz et al. 1978). Möglicherweise passieren aber geringste Spuren von Naloxon bei normalem therapeutischen Einsatz die Leber und könnten folglich im low dose -Bereich wirksam werden. Über die Wirkungsweise low dose Naloxon-vermittelter Verstärkung der analgetischen Wirkung von Opiaten können nur rein hypothetische Ansätze formuliert werden. Neben den bereits diskutierten Gs-Protein gekoppelten Opioidrezeptoren könnte auch ein Einfluss auf die Internalisierung von Opioidrezeptoren möglich sein. Hier steht, neben dem dringend nötigen Nachweis Gs-Protein gekoppelter Opioidrezeptoren, ein völlig neuartiges Forschungsgebiet der Opioidpharmakologie offen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit konnte erstmals das Phänomen konditionierter Opiatentzug näher charakterisiert werden (Kapitel 4). Auch wenn es nicht gelang, aus der Vielzahl an Entzugserscheinungen die wichtigsten Kardinalsymptome zu konditionieren, so besteht dennoch kein Zweifel, dass Entzugssymptome ausreichend konditioniert werden können und dass diese konditionierten Symptome mit einer Aktivierung von Stressmechanismen verbunden sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass mit der Präsentation des konditionierten Stimulus eine massive neuronale Aktivität im Locus coeruleus ausgelöst wird. Dieses Kerngebiet ist seit Jahren ohne Zweifel für die Ausbildung der meisten körperlichen Entzugssymptome während eines Opiatentzugs verantwortlich (Aghajanian, 1978; Maldonado et al., 1992b). Gerade in den letzten Jahren kommt dem konditionierten Entzug die Aufmerksamkeit zu, die ihm möglicherweise in seiner Bedeutung im Rückfallverhalten zusteht. Neueste Studien (Schulteis et al., 2000) zeigen deutlich, dass konditionierte Entzugserscheinungen mit dem Kerngebiet assoziiert werden, die für die hedonistische Beurteilung eines Ereignisses ausschlaggebend sind. Obwohl in frühen Studien durch Befragung von Abhängigen kein Einfluss konditionierter Entzugserscheinungen auf Rückfallverhalten nachgewiesen werden konnte (McAuliffe, 1982), stellt sich berechtigterweise die Frage, ob von Drogensüchtigen bzw. entzogenen Patienten der Reflexbogen, der zum Rückfall führte, überhaupt als solcher erkannt und benannt werden kann. Gerade das stereotype Ablaufen suchtrelevanter Konditionierungs- und Sensibilisierungsmechanismen entzieht sich oftmals dem Bewusstsein des Suchtkranken (Zieglgänsberger und Spanagel, 1999). In frühen tierexperimentellen Studien waren Versuchstiere nicht in der Lage, die im konditionierten Entzug auftretenden Entzugserscheinungen durch Trinken von opioidagonistischer Lösung zu lindern (Stewart et al., 1984). Dabei stellt gerade die orale Verabreichung von z.B. Morphin auf Grund der schlechten Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt eine schlechte Art der Verabreichung von Opiaten dar (Gellert und Holtzman, 1978). In einem konditionierten Entzugsgeschehen kommt daher der schnellen intravenösen Verabreichung von Opiaten tragende Bedeutung zu. Opiatsucht stellt sich als komplexes Krankheitsbild dar, zumal die Patienten nicht nur von einem Opiat abhängig sind, sondern meist Polytoxikomanen sind. Dennoch erscheint gerade der konditionierte Entzug als ein wichtiges Element im Rückfallverhalten, möglicherweise eben nur im Zusammenspiel anderer suchtrelevanter Parameter. Aufschluss inwieweit hier konditionierte Entzugs-erscheinungen eine tragende Rolle spielen, könnte ein Tierexperiment darstellen, in dem auf Entzug konditionierte Versuchstiere gelernt haben, sich über eine intracerebroventriculare Injektion Morphin zuzuführen. Nur ein schneller, unmittelbarer Wirkungseintritt von Morphin greift in den Reflexbogen ein, der von den meisten Patienten im Rückfall nicht kognitiv wahrgenommen wird. Kein anderer Stoff begleitet die Menschheit so lange wie der Saft der Kapseln des Schlafmohns und bei keinem anderen Stoff liegen Wohl und Wehe so eng beisammen. Opium und seine in der modernen Medizin angewandten Derivate stellen nach wie vor die potentesten Schmerzmittel dar. Bis heute gibt es keine vergleichbaren Analgetika. Die erstaunliche Kongruenz zwischen speziellen Rezeptoren im Gehirn und einem sekundären Pflanzenalkaloid bringt die moderne Opioidpharmakologie immer wieder in den Konflikt zwischen maximaler Schmerzlinderung und den fatalen Folgen dieser Therapie, die in Toleranz, Abhängigkeit und Entzug münden kann. Dennoch bemühten sich seit Menschengedenken Ärzte und Wissenschaftler um die Vorteile dieses Prinzips und so sollte es eines Tages gelingen, die schmerzlindernde Komponente der Opiate von den negativen Auswirkungen abzukoppeln.