Podcasts about die detektion

Die Detektion der perioperativen Myokardischämie ist gar nicht so einfach, Thorben hat ein kleines Kochrezept wie man die Detektionswahrscheinlichkeit erhöhen kann. Viel Spaß damit! Der Beitrag „titriert“ Poorman’s V5 erschien zuerst auf pin-up-docs - don't panic.

Wed, 13 Jun 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14546/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14546/1/Lochner_Christiane.pdf Lochner, Christiane

Podosomen sind aktinreiche Adhäsionsstrukturen, die vor allem in monozytären Zellen, aber auch in dendritischen Zellen, Osteoklasten, Endothelzellen oder glatten Muskelzel-len vorkommen. In primären humanen Makrophagen gibt es zwei Subpopulationen von Podosomen: größere, hochdynamische Precursor in der Peripherie sowie kleinere, sta-bilere Podosomen im Zellzentrum. Die Regulation der Podosomendynamik in der Zell-peripherie erfolgt durch das Mikrotubuli-basierte Motorprotein KIF1C, wahrscheinlich durch den Transport von Regulationsfaktoren. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Ar-beit lag daher in der Identifizierung dieser Regulatoren. • Die Aufreinigung KIF1C-GFP positiver Vesikel mittels FACS ist grundsätzlich funk-tionell. Die Analyse zahlreicher Vesikel-assoziierter Proteine spricht weiter für die Hypothese, dass es sich bei der von KIF1C transportierten Fracht um vesikuläre Struk-turen handelt. Die Detektion zahlreicher unspezifischer Proteine zeigt jedoch auch, dass die Methode der Aufreinigung zukünftig noch verbessert werden muss. • RabGTPasen, die auch am Transport von Vesikeln beteiligt sind, haben oftmals eine ähnliche subzelluläre Lokalisation wie KIF1C. Vor allem zwischen Rab6a und KIF1C war ein häufiger und länger dauernder Kontakt in der Zellperipherie zu beobachten. Mittels GFP-Immunpräzipitation konnte eine Interaktion bestätigt werden. • Auf der Suche nach weiteren potentiellen Interaktionspartnern von KIF1C wurde das Protein HAX1 identifiziert. Sowohl in fixierten als auch in lebenden primären humanen Makrophagen konnte eine eindeutige Kolokalisation der Proteine in der Zellperipherie beobachtet werden. Bei Einsatz der Rigormutante von KIF1C (KIF1C-K103A) akku-mulierten beide Proteine am MTOC. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion zwi-schen KIF1C und HAX1 schließen. Das Motorprotein KIF9 lokalisiert vor allem an den stabileren Podosomen im Zentrum der Zelle. Bei der Ermittlung der Rolle von KIF9 hinsichtlich der Regulation dieser Po-dosomensubpopulation wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: • Knock-down von KIF9 reduziert die Anzahl der Podosomen und inhibiert bei noch bestehenden Podosomen den Abbau extrazellulärer Matrix. Für KIF9 konnte demnach nicht nur eine Beteiligung an der Podosomenregulation sondern auch eine Rolle im Matrixabbau zugewiesen werden. • KIF9-GFP positive Vesikel assoziieren mit Mikrotubuli und kontaktieren mehrere Podosomen nacheinander. Dies spricht für eine direkte Verbindung von KIF9-vermitteltem, mikrotubuli-basiertem Transport mit Podosomen, die durch KIF9 regu-liert werden. • Durch Immunpräzipitationsversuche wurden Hinweise gefunden, dass KIF9 mögli-cherweise in unterschiedlichen Spleißvarianten oder verschieden phosphorylierten Zu-ständen existiert. • Als Interaktionspartner für KIF9 konnte Reggie-1 identifiziert werden. Durch knock-down von Reggie-1 und auch Reggie-2 konnte diesen Proteinen eine Beteiligung am Abbau extrazellulärer Matrix zugeschrieben werden. Die Teilung der Podosomen-Precursor sowie Auflösung der regulären Podosomen sind grundlegende Vorgänge. Unterschiede in der molekularen Zusammensetzung der Podo-somen-Subpopulationen waren bisher allerdings unbekannt. • Supervillin konnte als erstes Protein identifiziert werden, das differentiell an die unter-schiedlichen Subpopulationen lokalisiert. Dies zeigt zum ersten Mal eine unterschiedli-che molekulare Zusammensetzung der Podosomen-Subpopulationen. • Podosomen reichern Supervillin an, bevor diese sich auflösen. Überexpression von GFP-Supervillin führte außerdem zu einem Verlust von Podosomen, wohingegen shRNA-basierter knock-down die Lebensdauer verlängerte. Supervillin scheint somit eine Rolle in der Regulation von Podosomen zu spielen. • Die Myosin IIA-Bindedomäne ist sowohl für die Anzahl der Podosomen als auch für die differentielle Rekrutierung an die unterschiedlichen Subpopulationen essentiell. • Supervillin steht mit Myosin IIA und der phosphorylierten leichten Kette von Myosin in Verbindung und koppelt kontraktiles Myosin an Podosomen, was deren Auflösung auslöst. • Durch siRNA-basierten knock-down konnte gezeigt werden, dass Supervillin erst zu-sammen mit Myosin IIA und/oder Gelsolin die Effektivität der Podosomen hinsichtlich Matrixabbau beeinflusst. Die Podosomenanzahl hingegen war nicht verändert.

In der vorliegenden Arbeit wurde das Nahrungssuchverhalten der in der Neotropis verbreiteten Blumenfledermausart Glossophaga commissarisi untersucht. Die Tiere ernähren sich zu einem großen Teil von Nektar, den sie, ähnlich wie Kolibris, im Schwirrflug aus Blüten speziell adaptierter, chiropterophiler Pflanzen entnehmen. Weil die räumliche Verteilung dieser Pflanzen im tropischen Regenwald sehr unregelmäßig und zerstreut ist, legen die Tiere auf der Suche nach Nahrung enorm lange Flugstrecken zurück und die von ihnen umgesetzten Energiemengen sind extrem hoch. Die Lebensweise der Tiere erscheint daher stark limitiert von energetischen Grenzbedingungen. Die individuelle Fitness einer Blumenfledermaus hängt ganz entscheidend von der Effizienz ihres Nahrungssuchverhaltens ab. In den letzten Jahren haben sich daher zunehmend Arbeiten mit der Energetik und dem Nahrungssuchverhalten von Blumenfledermäusen beschäftigt, hauptsächlich wurden dabei Laborversuche unter der Anwendung von künstlichen Blüten durchgeführt - eine individuenspezifische Beobachtung der Tiere im Freiland war bisher durch ihre nächtliche Lebensweise und der schnellen Fortbewegung in den gleichzeitig schwer zugänglichen Regenwaldhabitaten kaum möglich. Mit dem hier vorgestellten Kunstblütensystem habe ich einen neuen Ansatz gefunden, Nahrung suchende Fledermäuse im Freiland zu beobachten. Dabei wurde eine große Zahl künstlicher, computergesteuerter Blüten im natürlichen Lebensraum der Tiere großflächig ausgebracht. Die Blüten waren mit einem Zuckerwasservorrat versehen und konnten dadurch genau definierte Mengen von "Nektar" an besuchende Tiere abgeben. Die Detektion der besuchenden Fledermäuse wurde mit Hilfe von Infrarot-Lichtschranken vorgenommen. Zusätzlich waren die Tiere mit Transponderhalsbändern individuell markiert und die Blüten mit entsprechenden Lesegeräten ausgestattet, so dass bei jedem Blütenbesuch eine Identifikation des Besuchers vorgenommen wurde. Die resultierenden Daten enthalten individuelle, zeitlich und örtlich präzise Informationen über die Suchrouten, die die Tiere im Freiland zurücklegen. Mit dem künstlichen Blütenfeld wurden unterschiedliche energetische und kognitive Fragestellungen zum Nahrungssuchverhalten von nektarivoren Fledermäusen untersucht: Die Zeit- und Energiebudgets der beteiligten Tiere an den künstlichen Blüten konnten präzise bestimmt und verglichen werden mit entsprechenden Angaben aus früheren Arbeiten, die mit anderen Verfahren ermittelt wurden. Aus den individuellen Besuchsdaten wurden außerdem die von den Tieren bevorzugten Fluggeschwindigkeiten ermittelt und mit den Vorhersagen von aerodynamischen Modellen verglichen. Außerdem beschreibt die Arbeit die individuelle räumliche Verteilung der Tiere, die sich bei stabiler Ressourcenverteilung auf der Untersuchungsfläche einstellte. Die Größe und die Konstanz der von den Individuen besuchten Areale und die Anzahl der von ihnen besuchten Blüten werden bestimmt und diskutiert. Das Erlernen verschiedener räumlicher Nahrungsverteilungsmuster durch die Tiere in Umwelten unterschiedlicher Variabilität ist Inhalt eines weiteren Abschnittes. Die in diesem Experiment aufgezeichneten Bewegungsmuster der Tiere wurden individuell analysiert, um die große Variabilität der Suchstrategien zwischen den Individuen darzustellen und zeitlich und räumliche angepasste Suchstrategien der Tiere zu charakterisieren und deren Effizienz abzuschätzen.

Zielsetzung der Arbeit war es, zu untersuchen ob porciner Fas-Ligand auf nativen aortalen Schweineendothelzellen (PEC) und immortalisierten aortalen Schweineendothelzellen (PEC-A) exprimiert wird und ob dieser mit humanem Fas auf der T-Lymphozytenzelllinie Jurkat interagiert. Unter Einsatz von Matrix-Metalloproteinase-Inhibitoren sowie nach Permeabilisierung und Fixierung der Zellen konnte FasL sowohl auf PEC als auch auf PEC-A in geringem Maße nachgewiesen werden. Die Detektion von FasL erfolgte mit anti-FasL-AK. Bei der Koinkubation von PEC sowie PEC-A mit Jurkat-Zellen in Effektor/Target-Verhältnissen von 4:1, 3:1 und 2:1 konnte weder im APO2.7-Assay noch im Annexin-Assay Apoptose beobachtet werden. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der FACS-Analyse. Der JAM-Test erwies sich in unserem System aus technischen Gründen als nicht geeignet für den Nachweis von Apoptose. Versuche PEC-A mit hFasL zu transfizieren waren mit hoher Zelltoxizität verbunden. Der transfizierte FasL wurde teilweise auch intrazellulär gespeichert. Der costimulatorische Signalweg B7/CD28 kann ein dem Fas/FasL-Signalweg entgegengesetztes Signal vermitteln. Auch nach Blockade der möglichen Interaktion zwischen B7 auf PEC-A und CD28 auf Jurkat-Zellen konnte keine Apotose gezeigt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Vektor (pGrec) zur Messung der homologen Rekombination (HR) in mitotischen Säugerzellen kloniert und etabliert. pGrec enthält eine HR-Kassette mit zwei Allelen des GFP (green fluorescent protein)-Gens, die durch differentielle Mutagenese inaktiviert wurden. Diese Allele können nur durch HR zu einem Wildtyp-Allel rekonstituiert werden, dessen zelluläre Expression mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie nachweisbar ist. Die Detektion mittels Durchflusszytometer erlaubt es, seltene GFP+-Zellen zu isolieren und als rekombinante Subklone zur weiteren molekularbiologischen, biochemischen und zellulären Analyse zu etablieren. Das pGrec-HR-Meßsystem wurde an zwei isogenen Zellpärchen angewendet. Nach chromosomaler Integration in die Nager-Zelllinien V79B und deren mutierte Variante CL-V4B (Rad51C(-/-) (Godthelp et al., 2002)) konnte die vermutete Störung der HR in den Rad51C-defizienten CL-V4B-Zellen (Masson et al., 2001; Takata et al., 2001; French et al., 2002; Godthelp et al., 2002) eindeutig nachgewiesen werden: Im Vergleich zur Wildtyp-Zelllinie V79B ist die intrachromosomale Rekombinationsfrequenz der HR-Kassette in der Rad51C-Mutante statistisch signifikant erniedrigt (6-fach). Ebenso scheint die Rate der homologen Rekombination in Fluktuations-Analysen reduziert zu sein (2,7-fach). Somit konnte erstmalig direkt eine Beteiligung von Rad51C an HR gezeigt werden, deren Störung mit der Mutagenüberempfindlichkeit (MMS) und chromosomalen Instabilität von CL-V4B-Zellen korreliert. Kultivierte Zellen von A-T-Patienten sind charakterisiert durch chromosomale Hyper-Rekombination (Meyn, 1993; Luo et al., 1996). Das pGrec-System wurde in AT-Zellen auf seine Anwendbarkeit zur Messung extrachromosomaler Rekombination getestet, um ungleiche Einflüsse der Chromatinstruktur an einem spezifischen Integrationsort zu umgehen. Das Zellpärchen AT-pEBS (Atm(-/-), transfiziert mit leerem Kontroll-Vektor) und AT-YZ (Atm(-/-), ATM ektopisch komplementiert (Ziv et al., 1997)) wurde mit der für humane Zellen episomalen Version des pGrec-Vektors transfiziert. Die Rekombinationsrate in zwei untersuchten Subklonen der AT-pEBS-Zelllinie war im Vergleich zu zwei AT-YZ-Subklonen statistisch signifikant erhöht (34 - 43-fach). Somit wäre erstmals eine Hyperrekombination von AT-Zellen auch in episomalen Loci gezeigt. Die Bestimmung der Rekombinationsfrequenz ergab jedoch, dass diese in der Gesamtpopulation ATM-komplementierter AT-Zellen erhöht zu sein scheint (6-fach). Mögliche Gründe für die unterschiedlichen Ergebnisse, die mit verschiedenen experimentellen Ansätzen in den AT-Zelllinien erhalten wurden, werden diskutiert. Das pGrec-System ist als leicht modifizierbarer Vektor konzipiert und somit prinzipiell in allen Säugerzellen anwendbar. Insgesamt stellt pGrec also ein sehr sensitives und nützliches Werkzeug zur Charakterisierung von HR auf molekular-biologischer, biochemischer und zellulärer Ebene dar.

Die spektroskopische Untersuchung einzelner Moleküle in kondensierter Phase erstreckt sich erst über einen Zeitraum von zehn Jahren. In dieser verhältnismäßig kurzen Zeit vollzog sich eine rasante Entwicklung mit einer Vielzahl von Ergebnissen. Dies findet seinen Ausdruck in eigenen Tagungen und Zeitschriften und nicht zuletzt auch in einer Nobelkonferenz im Jahre 1999. Während sich anfangs die Untersuchungen auf eine Reihe faszinierender Tieftemperaturexperimente mit spektraler Selektion der einzelnen Moleküle beschränkten, verschob sich seit Mitte der 90er Jahre der Schwerpunkt der Forschung auf diesem Gebiet hin zu Experimenten mit räumlicher Selektion bei Raumtemperatur, die seit kurzer Zeit auch relativ uneingeschränkt bei Tieftemperatur möglich sind. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in dieser Dissertation wider. Zu Beginn dieser Arbeit stand eine spektral hochauflösende Apparatur zur Einzelmolekülspektroskopie bei kryogenen Temperaturen zur Verfügung. Mit dieser wurden Einzelmoleküluntersuchungen an dem neu synthetisierten Farbstoff Terrylendiimid (TDI) durchgeführt. TDI ist kein reiner Kohlenwasserstoff, wie die bis dahin üblicherweise verwendeten Chromophore, und lässt sich durch seine Seitengruppen an andere Systeme anbinden. Er zeigt neben exzellenten Fluoreszenzeigenschaften die zur spektralen Selektion nötigen schmalen Absorptionslinien. Wegen seiner Struktur lässt sich TDI nicht in einen Kristall einlagern. Mit Polyethylen und Hexadecan wurden jedoch zwei Matrizen gefunden, die es erlauben, Fluoreszenzanregungsspektren von einzelnen Molekülen zu detektieren. In Hexadecan konnte bei Sättigungsuntersuchungen das theoretisch vorhergesagte Verhalten nachgewiesen werden. Dabei wurden Zählraten von fast 500 000 Counts pro Sekunde von einem einzelnen Molekül erreicht. Durch die Aufnahme und Auswertung der Fluoreszenzintensitäts-Autokorrelationsfunktion konnten die Populations- und Depopulationsraten der Triplett-Subniveaus bestimmt werden. Dabei wurde auch spektrale Diffusion der Moleküle beobachtet, die mit Hilfe von Two-Level Systems (TLS) erklärt werden konnte. Mit einem komplexen theoretischen Modell und aufwendigen numerischen Berechnungen konnte die bei 2,5 K auftretende Verteilung von Linienbreiten der beobachteten Moleküle simuliert werden. Damit konnte den beiden Matrizen über die Analyse ihrer TLS-Dichte ein unterschiedlicher Grad an Unordnung zugeordnet werden. In temperaturabhängigen Untersuchungen der Linienform konnte der Unterschied im Ordnungsgrad der Matrizen bestimmt werden. Ferner konnten die Theorie von Hsu und Skinner in der Tieftemperaturnäherung bestätigt werden und ein tieferer Einblick in die auftretende Dynamik gewonnen werden. In der Auswertung der temperaturabhängigen Linienverschiebung wurde erstmals der Einfluss von Matrixexpansion berücksichtigt und als unverzichtbar für eine gute Beschreibung des Systems erkannt. Parallel zu den ersten Experimenten wurde eine aktive Stabilisierung des Farbsto?asers aufgebaut. Damit konnte eine Verfälschung der Ergebnisse durch Laserdrift ausgeschlossen werden. Weitere Tieftemperaturuntersuchungen hatten die Beobachtung von Förster Energietransfer (oder FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) an einem individuellen Donor-Akzeptor-Paar in seiner speziellen Konformation zum Ziel. Als Farbstoffmolekül stand ein Bichromophor aus Perylen und kovalent angebundenem TDI zur Verfügung. Obwohl beide Chromophore sich für Einzelmoleküluntersuchungen eignen und inzwischen schon mehrfach verwendet wurden, gelang es nicht, ein bezüglich Linienbreite und Frequenzposition identisches Fluoreszenzanregungsspektrum sowohl über Perylen-Fluoreszenz als auch über TDI-Fluoreszenz (nach Energietransfer) zu detektieren. Der Energietransferprozess scheint mit einem Linienverbreiterungsmechanismus verknüpft zu sein, so dass eine Beobachtung mit dem Aufbau in der Anfangsphase der Dissertation nicht möglich war. Eine Wiederaufnahme dieser Untersuchungen mit der neuen Apparatur ist zukünftigen Doktoranden vorbehalten. Um allgemein temperaturabhängige Untersuchungen an fluoreszierenden Molekülen durchführen zu können, wurde ein Tieftemperaturmikroskop aufgebaut. Dafür wurde die Rastertechnik gewählt. Um die bekannten Probleme des Probenscannens im Kryostaten, wie kleiner Scanbereich und fehlender Zugang im abgekühlten Zustand, zu vermeiden, wurde ein konfokales Laserscanning-Mikroskop entworfen und aufgebaut. Zur Strahlablenkung wurden zwei Galvanometerspiegel gewählt und der Drehpunkt über ein telezentrisches System in das Objektiv abgebildet, das gemeinsam mit der Probe im Kryostaten sitzt. Die Detektion des Fluoreszenzlichts wird von einer hochempfindlichen Avalanche-Photodiode mit geringer Dunkelzählrate übernommen. Die Funktion des Scanners und des gesamten optischen Aufbaus konnte an Testmustern und Testproben erfolgreich demonstriert werden. Einschränkend muss jedoch erwähnt werden, dass die erreichte DetektionseŽzienz die Erwartungen nicht erfüllte. Das liegt im Wesentlichen am Objektiv, aber auch an den Abbildungsfehlern und Reflexionen der zahlreichen Elemente im Strahlengang. Die maximal erreichten Zählraten lagen bei 50 000 Counts pro Sekunde am System Terrylen in Polyethylen. Für Systeme mit einer ausreichend hohen Fluoreszenzrate ist es mit dieser Apparatur möglich, Fluoreszenzbilder, Zeitspuren, spektral hochauflösende Fluoreszenzanregungsspektren, Fluoreszenzspektren und Fluoreszenzkorrelationsfunktionen von einzelnen Molekülen aufzunehmen, um damit spektrale und dynamische Eigenschaften der Moleküle zu bestimmen. Durch Variation der Temperatur können die Temperaturabhängigkeit der Messgrößen und Barrierenhöhen ermittelt werden. Mit der neuen Apparatur wurden Untersuchungen in zwei neuen Themenbereichenbegonnen, nämlich an einzelnen Sondenmolekülen in Nanoporen und an den fluoreszierenden Proteinen GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) und PEC (Phycoerythrocyanin). Erste Fluoreszenzanregungsspektren einzelner Terrylen-Moleküle in den Kanalstrukturen von mesoporösen Systemen der M41S-Klasse konnten beobachtet werden. Dabei ist die hohe spektrale Auflösung von großem Vorteil bei der Untersuchung der spektralen Dynamik der Sondenmoleküle. Im Bereich biologischer Proben konnten einzelne Moleküle des Grün Fluoreszierenden Proteins isoliert beobachtet werden. Die Anzahl an Fluoreszenzphotonen pro Molekül, die vor dem ¨Ubergang in einen Dunkelzustand an diesem System detektiert werden konnten, war allerdings sehr gering. Deshalb wurden Untersuchungen an einzelnen Proteinen aus dem Lichtsammelkomplex von Cyanobakterien begonnen, die in einer laufenden Doktorarbeit von P. Zehetmayer fortgeführt werden. Bei den Proteinproben handelt sich um Untereinheiten von Phycoerythrocyanin: die ‹-Untereinheit und das Trimer bzw. Monomer, in denen offenkettige Tetrapyrrhol-Moleküle als Farbstoffe an die Proteinmatrix angebunden sind. Neben Fluoreszenzbildern und Zeitspuren konnten bereits Anregungsspektren detektiert werden, die starke spektrale Dynamik zeigen und weitere Untersuchungen herausfordern. Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden bereits in internationalen Zeitschriften und auf Tagungen veröffentlicht. Eine Übersicht befindet sich am Ende unter Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge.