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Der 5-HT3-Rezeptor gewinnt zunehmend pharmakologische Bedeutung, z.B. hinsichtlich der Wirkmechanismen von Antidepressiva. Diese wirken u.a. als 5-HT3-Rezeptor-Antagonisten oder hemmen die präsynaptische Serotonin-Wiederaufnahme. Darüber hinaus werden 5-HT3-Antagonisten in der Therapie des Zytostatika-induzierten Erbrechens eingesetzt. 5-HT3-Rezeptoren haben auch eine Bedeutung im Schmerzgeschehen. Die Beurteilung der Interaktion eines Pharmakons mit einem Rezeptor-gekoppelten Ionenkanal erfordert die Kenntnis über die Rezeptorkinetik. Deshalb untersuchten wir die Aktivierung- und Deaktivierungskinetik des heteromeren 5-HT3-Rezeptors. Der in HEK 293-Zellen exprimierte 5-HT3AB-Rezeptor diente als Modell für den nativen Rezeptor. Anhand der Rezeptor-vermittelten Antworten ermittelten wir die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik des 5-HT3AB-Rezeptors. Zu deren Beschreibung erstellten wir ein Reaktionsschema. Dieses verdeutlicht insbesondere die Unterschiede zwischen dem homomeren 5-HT3A-Rezeptor und dem heteromeren 5-HT3AB-Rezeptor. Beim 5-HT3AB-Rezeptor erfolgt die Desensitisierung als „klassische“ Desensitisierung, beim homomeren 5-HT3A-Rezeptor durch einen Offen-Kanal-Block. Darüber hinaus sind 5-HT3A-Rezeptoren und 5-HT3AB-Rezeptoren unterschiedlich sensitiv für den Agonisten 5-HT und zeigen eine unterschiedliche Resensitisierungszeit. Der 5-HT3-Rezeptor-spezifische Agonist mCPBG bewirkt hingegen bei 5-HT3A- und 5-HT3AB-Rezeptoren einen Offen-Kanal-Block. Dies bedeutet, dass der Desensitisierungs-Mechanismus nicht nur von der Quartärstruktur des Rezeptors, sondern auch vom Agonisten bestimmt wird. Funktionelle Unterschiede zwischen heterolog exprimierten und nativen 5-HT3-Rezeptoren konnten lange nicht erklärt werden und man machte unbekannte zelluläre Faktoren dafür verantwortlich (van Hooft et al., 1997). Erst die Entdeckung der 5-HT3B-Rezeptoruntereinheit (Davies et al., 1999) legte nahe, dass der native 5-HT3-Rezeptor ein Heteromer aus 5-HT3A- und 5-HT3B-Untereinheiten ist. Man nimmt auch an, dass sowohl homomere als auch heteromere 5-HT3-Rezeptoren in sensorischen Neuronen exprimiert werden (Morales et al., 2001). Dadurch gewinnen die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen unterschiedlichen Eigenschaften homomerer und heteromerer Rezeptoren zusätzlich an Bedeutung. Zudem könnten unsere Ergebnisse dazu beitragen, Interaktionen zwischen Pharmaka und dem 5-HT3-Rezeptor besser zu verstehen.

Bei einer Vielzahl neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen wird eine Beteiligung des dopaminergen Systems postuliert. Daraus resultiert ein zunehmendes Interesse an einer weiteren Charakterisierung dieses wichtigen Neurotransmitter-systems mittels bildgebender Verfahren. Eine funktionelle Diagnostik des dopamin-ergen Systems bei Patienten in-vivo kann nuklearmedizinisch sowohl durch die Anwendung von SPECT- als auch durch PET-Bildgebung erfolgen. Dabei erlaubt die Anwendung verschiedener Radiopharmaka die Darstellung des prä- und des postsynaptischen Anteils. Hierdurch wird die Diagnosefindung erleichtert, da sich verschiedene Krankheitsbilder besser voneinander unterscheiden lassen. Die Involvierung des Dopamintransporters (DAT) bei Morbus Parkinson, Aufmerksam-keitsdefizit-/Hyperaktivitäts-Störung (ADHS) und ebenfalls bei Schizophrenie ver-deutlicht den Bedarf eines klinisch leicht anwendbaren und kostengünstigen Tracers. Die für die Bildgebung des DAT wünschenswerte Entwicklung eines 99mTc-markierten Radiopharmakons, statt der üblichen 123I-markierten Tracer oder PET-Liganden, gelang erstmals Kung et al. mit der Synthese von [99mTc]TRODAT-1. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die erste präklinische Anwendung dieses Radio-pharmazeutikums an gesunden Probanden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit waren Untersuchungen der Bindung von [99mTc]TRODAT-1 an den DAT vor und nach Therapie mit Methylphenidat bei Patienten mit ADHS. Des weiteren wurde das prä- und postsynaptische System (DAT und Dopamin-D2-Rezeptoren) durch simultane Darstellung mittels [99mTc]TRODAT-1 und [123I]IBZM bei Patienten mit Schizophrenie ohne Neuroleptika-Medikation sowie nach Therapie mit dem atypischen Neuroleptikum Amisulprid untersucht. Zunächst wurde der ideale Aufnahmezeitpunkt für die Bildgebung des DAT mit Hilfe von [99mTc]TRODAT-1 ermittelt. Die Kinetik der Bindung des Tracers an den DAT wurde hier an gesunden Probanden untersucht. Der optimale Unter-suchungszeitpunkt ergibt sich aus der Berechnung der spezifischen Bindung [(Str-Cer)/Cer] über die Zeit und liegt für die Darstellung des striatalen DAT zwischen der 3. h und der 5. h p.i.. Bei den Untersuchungen an gesunden Probanden zeigte sich eine alters-abhängige Reduzierung des DAT. Es konnte eine stärkere Verminderung des DAT bei jüngeren Probanden mit einem etwa in der Mitte der dritten Lebensdekade liegenden Scheitelpunkt und einer nachfolgend weniger stark ausgeprägten, kontinuierlichen Reduktion im höheren Lebensabschnitt nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis führte somit zum Schluss, dass für eine aussagekräftige Beurteilung der Bindung von [99mTc]TRODAT-1 die Berücksichtigung des Patientenalters notwendig ist. Bei Patienten mit ADHS wurde eine Erhöhung der Bindung von [99mTc]TRODAT-1 an den DAT festgestellt, welche sich, verglichen zu einem Normalkollektiv, als statistisch hoch signifikativ erwies. Die nachfolgende Therapie dieser Patienten mit Methylphenidat senkte die striatale DAT-Bindung durch-schnittlich um 30%. Die Verbesserung der Symptomatik durch dieses Medikament unterstreicht die Mitbeteiligung des DAT bei den pathologischen Prozessen des ADHS. Der letzte Abschnitt der Arbeit befasst sich mit der ersten simultanen Darstellung des DAT und der Dopamin-D2-Rezeptoren durch Verwendung von [99mTc]TRODAT-1 und [123I]IBZM. Durch die Verfügbarkeit dieses neuen 99mTc-markierten Radiopharmakons besteht erstmals die Möglichkeit zur gleichzeitigen funktionellen Darstellung des prä- und postsynaptischen dopaminergen Systems. Neben einer erheblichen Zeit- und Kostenersparnis ergibt sich durch die nahezu perfekte Koregistrierung eine exakte örtliche Übereinstimmung und somit die Möglichkeit zu einer standardisierten Auswertung. Diese Doppelisotopenstudie wies bei unbehandelten schizophrenen Patienten eine signifikante Reduktion des DAT sowie eine tendenzielle Verminderung der Dopamin-D2-Rezeptoren nach. Darüberhinaus wurde die Wirkung des Neuroleptikums Amisulprid untersucht. Hierbei konnte eine eindeutige Reduzierung des DAT und der Dopamin-D2-Rezeptoren gemessen werden. Mit der Entwicklung von [99mTc]TRODAT-1 sowie mit dem erfolgreichen Einsatz von [99mTc]TRODAT-1 zur nuklearmedizinischen Bildgebung steht nun ein neues Radiopharmakon für die Darstellung des DAT zur Verfügung. Für eine gute klinische Anwendbarkeit sprechen zusammenfassend folgende Argumente: · die potentielle Beteiligung des DAT bei vielen neurologischen und psychiatrischen Krankheiten, · die Möglichkeit der simultanen Darstellung des prä- und postsynaptischen dopaminergen Systems durch die Durchführung von Doppelisotopen-Untersuchung mittels [99mTc]TRODAT-1 und [123I]IBZM, · die geringe Strahlenexposition im Vergleich zu anderen Radiopharmazeutika und · die durch die Markierung mit 99mTc hohe Kosteneffektivität bei guter Bildqualität.

Quantenchemische Berechnungen von Carbokationen-Stabilitäten und Elektrophilieparametern E Die Strukturen von zwölf Benzhydrylkationen (XC6H4)2CH+ und ihrer Additionsprodukte mit dem Methylanion (XC6H4)2CH-CH3 wurden auf B3LYP/6-31G(d,p)-Niveau optimiert. Struktur und Reaktivität wurden diskutiert. ClClMeMeMeMeOOOOONMe2Me2NNNNNtol(Ph)CH+(tol)2CH+(ani)2CH+(pcp)2CH+ani(Ph)CH+ani(tol)CH+(fur)2CH+(mfa)2CH+(dma)2CH+(jul)2CH+(lil)2CH+Ph2CH+NNCF3MeMeF3COH3CH3CCH3H3C Abbildung 0-1: Zwölf Benzhydrylkationen; dargestellt ist jeweils das optimierte Konformere.Der Einfluss des Basissatzes wurde bis zum B3LYP/6-311++G(3df,2pd)//B3LYP/6-31g(d,p)-Niveau untersucht. Eine ausgezeichnete lineare Korrelation wurde zwischen dem experimentellen Elektrophilieparameter E (aus der Beziehung lg k = s (N + E)[1]) und den berechneten Methylanion-Affinitäten bereits auf B3LYP/6-31g(d,p)-Niveau gefunden.Abbildung 0-2: Korrelation zwischen den Elektrophilieparametern E verschiedener Benzhydrylkationen mit berechneten Methylanion Affinitäten [∆E0 = E0(Ar2CH–CH3) – E0(Ar2CH+) – E0(CH3–)] auf B3LYP/6-31G(d,p) Niveau (r = 0.9976). Hydrid- und Hydroxidanionaffinitäten von fünf Benzhydrylkationen wurden auf B3LYP/6-31G(d,p)-Niveau berechnet. Diese korrelieren mit den berechneten Methylanion-Affinitäten mit einer Steigung von 1.00; dies zeigt an, dass die relativen Anion-Affinitäten von Benzhydrylkationen von der Lewis-Base unabhängig sind. Um Solvatationseffekte zu berücksichtigen, wurden Hydroxidanionaffinitäten in der Gasphase mit entsprechenden experimentellen Affinitäten in Lösung (d.h. pKR+) verglichen. Dabei ergab sich, dass sich die Stabilitätsunterschiede derCarbokationen in Lösung verkleinern. Zum gleichen Ergebnis gelangt man durch Korrelation von experimentellen Chloridanion-Affinitäten in Lösung mit den berechneten Methylanion-Affinitäten in der Gasphase. Mit Hilfe der Marcus-Gleichung konnte gezeigt werden, dass die intrinsische Barriere konstant bleibt, wenn ein Nucleophil mit dem Steigungsparameter s = 0.67 mit einer Serie von Benzhydrylkationen umgesetzt wird. Größere bzw. kleinere Werte von s als 0.67 zeigen ein Absinken bzw. Ansteigen der intrinsischen Barriere mit zunehmender thermodynamischen Triebkraft der Reaktion an. Diels-Alder-Reaktionen von 1,3-Diarylallylkationen Die Allylkationen 41 und 42 wurden als Tetrafluoroborat-Salze synthetisiert. BF4NMe2Me2NBF4OMeMeO4142 Abbildung 0-3: Allylkationen 41 und 42. Bei den Umsetzungen von 41 und 42 mit one-bond-Nucleophilen (Allylsilane, Allylstannane, Silylenolether, Heteroarene und Hydriddonoren) wurden die erwarteten Produkte erhalten (Schema 0-1).BF4XXXXNuNuX = OMe, NMe241 / 42 Schema 0-1: Umsetzung von 41 und 42 mit one-bond Nucleophilen. 41 reagierte mit den Dienen 61-63 zu Sechsringen (Schema 0-2). Entsprechende Reaktionen mit 42 konnten auch mit elektronenreicheren Dienen nicht beobachtet werden. MeOMeOMeR1R2ZnCl2OMeMeMeOMeOMeOR1R261 62 6364 65 6641MeMeOMeOR1R2ZnCl2OMe68 Me HH HR1 R2H Me61, 6462, 6563, 66 Schema 0-2: Bildung von Cycloaddukten ausgehend von 41. Die Kinetik der Reaktionen von 41 und 42 mit one-bond Nucleophilen wurde UV-spektroskopisch untersucht. Dadurch konnten die Elektrophilieparameter der beiden Allylkationen 41 und 42 bestimmt werden.Aus diesen E-Parametern und bereits bekannten s- und N-Parametern der Diene konnten Geschwindigkeitskonstanten für die Reaktion von 41 und 42 mit Dienen für den Fall vorhergesagt werden, dass nur eine neue Bindung im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt geknüpft wird. Entsprechend berechnete Werte stimmen mit den gemessenen Geschwindigkeitskonstanten überein. Übergangszustände mit hohem Grad an Konzertiertheit können daher ausgeschlossen werden. Quantenchemische Untersuchung der Reaktionspfade der Reaktion von Methyl-substituierten Allylkationen mit 1,3-Dienen Die Reaktion des 1,1-Dimethylallykations mit s-cis-1,3-Butadien[2] wurde auf B3LYP/6-311++G(3df,2pd)//B3LYP/6-311G(d,p)-Niveau studiert. Da die Reaktion keine Barriere bezüglich Etot besitzt, wurden drei Reaktionspfade (lineare-, exo- und endo-Annäherung) vorgegeben und an Strukturen entlang dieser Pfade Frequenzrechnungen durchgeführt. linexoendoHHHHHHHHH Abbildung 0-4: Untersuchte Reaktionspfade der Reaktions des 1,1-Dimethylallykations mit s-cis-1,3-Butadien. Auf diese Weise wurden Barrieren der freien Enthalpie (∆G ‡) zwischen 2 und 3 kcal mol-1 erhalten. Die Reaktion des 1,1,3-Trimethylallylkations mit 1,3-Butadien wurde auf B3LYP/6-311++G(3df,2pd)//B3LYP/6-311G(d,p)-Niveau untersucht. Die Strukturen der Edukte, von vier π-Komplexen, von fünf Übergangszuständen und von vier möglichen Produkten wurden auf B3LYP/6-311G(d,p)-Niveau durch Geometrieoptimierung ermittelt. Die Übergangsstrukturen zeigen ein hohes Maß an Unsymmetrie. Die durchgeführten IRC-Rechnungen (intrinsic reaction coordinate) belegen eine große Asynchronizität der [2++4]-Cycloadditionen. Berechnung der Übergangsstrukturen der Diels-Alder-Reaktion des Kations 41 mit 2,3-Dimethyl-1,3-butadien und Isopren zeigen in Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen keine Mehrzentrenbeteiligung. Experimentelle und theoretische Untersuchungen der Reaktion des N-Methyl-4-vinylpyridinium-Ions mit Cyclopentadien und Diazoessigester N-Methyl-4-vinylpyridiniumtriflat (103) wurde nach Literaturvorschrift synthetisiert. NOTf103 Abbildung 0-5: N-Methyl-4-vinylpyridiniumtriflat (103). Die Reaktionen von 103 mit Morpholinocyclohexen (72), Diazoessigester (89) sowie Cyclopentadien (86) lieferten die Cycloaddukte 105, 109 und 106.OTfNNHNCO2EtNOTfOTfNNO109106105 Abbildung 0-6: Cycloaddukte105, 109 und 106. Die Elektrophilie von 103 wurde aufgrund eigener kinetischer Untersuchungen und literaturbekannter Geschwindigkeitskonstanten ermittelt. Mit Hilfe der Gleichung lg k = s (N + E) wurden Geschwindigkeitskonstanten für die Reaktionen von 103 mit Nucleophilen berechnet, die Mehrzentrenreaktionen eingehen können. Der Vergleich dieser berechneten Geschwindigkeitskonstanten mit experimentellen Werten ergab große Abweichungen für die Reaktionen von 103 mit Cyclopentadien und Diazoessigester. Dies ermöglichte die Berechnung der „free enthalpy of concert“, den Energiebetrag um den die konzertierte (und real ablaufende) Reaktion gegenüber der (hypothetischen) stufenweisen Reaktion bevorzugt ist. Während man für die Diels-Alder-Reaktion des N-Methyl-4-vinylpyridinium-Ions 103 mit Cyclopentadien eine free enthalpy of concert von ca. 11 kcal mol-1 ermittelt, ergibt sich für die 1,3-dipolare Cycloaddition von 103 mit Diazoessigester ein Konzertiertheitsgrad von ca. 4 kcal mol-1. Berechnungen der Reaktion von 103 mit Cyclopentadien auf B3LYP/6-311++G(3df,2pd)//B3LYP/6-31G(d,p) wurden durchgeführt Die endo-Übergangsstruktur ist um 2.9 kcal mol-1 (∆G) gegenüber der Übergangsstruktur des linearen Angriffs von Cyclopentadien bevorzugt.

Zur Strukturanalyse des Typ III-Sekretionssystems, kodiert von der Salmonella- Pathogenitätsinsel 2, wurden polyklonale Antikörper gegen rekombinante Proteine des Sekretionsapparates erzeugt. Zur Entfernung unspezifischer Bindungen wurden die polyklonalen Antiseren an eine CNBr-aktivierte Sepharose 4B, gekoppelt mit Salmonella- Lysaten, präadsorbiert. Anschließend konnten die Antiseren für verschiedene Immunoblotanalysen eingesetzt werden. Durch eine Membranfraktionierung mit N-Lauroyl-Sarcosin konnte die subzelluläre Lokalisation der Apparatsproteine SsaC, SsaN, SsaV und SsaB bestimmt werden. Dabei wurde SsaC in der äußeren, SsaN und SsaV in der inneren Membranfraktion nachgewiesen. SsaB war nur in der löslichen Fraktion detektierbar. Um mögliche Proteinkomplexe innerhalb des Sekretionsapparates zu identifizieren, wurde der membranpermeable Quervernetzer DSS eingesetzt. So konnten für das Sekretin-bildende Protein SsaC und für das putative Translokatorprotein SseD oligomere Strukturen nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung der Effekte von Mutationen in verschiedenen SPI2-Genen auf die Synthese einzelner Proteine des Sekretionsapparates wurde deutlich, dass das Zwei- Komponenten-Regulationssystem SsrAB sowie alle untersuchten Apparatsproteine eine essentielle Rolle in der Synthese bzw. im Aufbau des Sekretionsapparates spielen. Lediglich eine Mutation in ssaV oder ssaG hatte einen weniger starken Effekt auf die Synthese der Apparatsproteine, so dass SsaC in Wildtyp-Mengen detektiert werden konnte. Darüber hinaus wurde die Synthese einzelner Proteine des Sekretionsapparates auch in Abhängigkeit des pH-Wertes analysiert. Nach einer Absenkung des pH-Wertes auf pH 5,8 nahmen die Proteinmengen weitaus stärker zu als ohne pH-Wert-Veränderung. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass dieser Unterschied in den synthetisierten Proteinmengen, in Abhängigkeit des pH-Wertes, nicht auf eine verstärkte Transkription zurückzuführen ist und dass es sich um einen SPI2-spezifischen Effekt handelt. Die Kinetik des Aufbaus des Sekretionsapparates wurde anhand der Sekretion des putativen Translokatorproteins SseB bestimmt. 1 h nach der Absenkung des pH-Wertes auf pH 5,8 wurde eine intrazelluläre Akkumulation von SseB detektiert. Zu diesem Zeitpunkt konnte kein SseB auf der Zelloberfläche lokalisiert werden. Eine Sekretion von SseB wurde erst 3 h nach der Säure-Induktion beobachtet. Demzufolge muss der Sekretionsapparat in diesem Zeitraum vollständig aufgebaut und funktional intakt sein, um die pH-induzierte Sekretion zu ermöglichen. Das SPI2-Protein SsaB (SpiC) ist für die Sekretion der putativen Translokatorproteine SseB und SseC erforderlich. So könnte SsaB eine Komponente des Typ IIISekretionsapparates darstellen oder die Funktion eines Chaperones für die Effektorproteine, bzw. eines GSP-spezifischen Chaperones für das Sekretin-bildende Protein SsaC besitzen. Ebenso wäre es möglich, dass SsaB für die korrekte Lokalisation von SsaC in der äußeren Membran verantwortlich ist. Aus S. typhimurium konnten die als Nadel-Komplexe bezeichneten makromolekularen Strukturen, die den gesamten Sekretionsapparat darstellen, isoliert aber nicht eindeutig identifiziert werden. Da in einer SPI1-Mutante, die einen Defekt im Typ IIISekretionsapparat hat, keine Nadel-Komplexe mehr angereichert werden konnten, liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei den Nadel-Komplexen, isoliert aus S. typhimurium- Wildtyp, um die SPI1-Strukturen handelt.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.

1. In Anlehnung an Literaturvorschriften wurden die 7-aryl-2,6-di-tert-butylsubstituierten Chinonmethide 20a-d synthetisiert.1. In Anlehnung an Literaturvorschriften wurden die 7-aryl-2,6-di-tert-butylsubstituierten Chinonmethide 20a-d synthetisiert. 3. Durch Deprotonierung mit Kaliumethanolat als Base wurden die Kaliumsalze von Meldrumsäure (24a-K + ), Malonnitril (24b-K + ), Dimedon (24c-K + ), Cyanessigsäureethylester (24d-K + ), Acetylaceton (24e-K + ), Acetessigester (24f-K + ), Malonsäurediethylester (24g-K + ) und Nitroethan (24h-K + ) als kristalline Feststoffe isoliert und ihre Struktur in DMSO NMR-spektroskopisch untersucht. 4. Analog Literaturvorschriften wurden die Tetra-n-butylammoniumsalze von Cyanessigsäu-reethylester (24d-NBu4 + ), Malonsäurediethylester (24g-NBu4 + ) und Nitroethan (24h-NBu4 + ) als kristalline Feststoffe erhalten. 5. Die Kinetik der Additionsreaktionen der Carbanionen 24a-h mit den Chinonmethiden 20a-d wurde in Dimethylsulfoxid photometrisch verfolgt. Zusätzlich wurde eine Auswahl der Additionsprodukte isoliert und charakterisiert. In allen Fällen wurde ein Geschwindigkeitsgesetz 2. Ordnung für die Additionsreaktionen beobachtet. 6. Die Reaktionen des Carbanions von Malonsäurediethylester (24g) mit Benzylidenmalon-säurediethylester (7a) sowie den substituierten Benzylidenmalonsäurediethylestern 7b-e wur-den in Dimethylsulfoxid kinetisch und präparativ untersucht. In allen Fällen folgt die Additionsreaktion einem Geschwindigkeitsgesetz 2. Ordnung. Mit den Benzylidenmalonsäurediethylestern 7b und 7e verläuft die Reaktion reversibel und es konnten aus den kinetischen Messungen auch die Geschwindigkeitskonstanten der Rückreak- tionen abgeschätzt werden. 7. Mittels Stopped-Flow-Spektrophotometrie wurden Geschwindigkeitskonstanten für die Koordinationsreaktionen der Carbanionen 24a-g mit den Benzhydrylkationen 2,3,8-11 in Di- methylsulfoxid bestimmt. Zusätzlich wurde eine Auswahl der Reaktionsprodukte isoliert und charakterisiert. 8. Aus literaturbekannten Dissoziationskonstanten für die Kalium- und Tetra-n-butylammoni- umsalze der Carbanionen 24 wurden die Dissoziationsgrade bei den Konzentrationen der ki- netischen Untersuchungen abgeschätzt. Es konnte experimentell bestätigt werden, dass mit Carbanion-Konzentrationen von 10 -4 bis 10 -3 mol L -1 in einer Dimethylsulfoxid-Lösung die Geschwindigkeitskonstanten für die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tetra-n-butyl- ammonium- und Kaliumsalze unabhängig vom Gegenion sind, wenn im Falle der Kalium- salze 18-Krone-6 als komplexierender Ligand zugesetzt wird. 9. Für die Reaktionen der anionischen Nucleophile mit den ungeladenen sowie kationischen Elektrophilen lässt sich neben dem polaren Mechanismus alternativ ein Einelektronentrans- fermechanismus diskutieren (Abbildung 1). Um bei den hier untersuchten Additions- und Koordinationsreaktionen zwischen den beiden Mechanismen zu unterscheiden, wurden aus den Oxidationspotentialen der Carbanionen und den Reduktionspotentialen der Chinon- methide und Benzhydrylkationen die Geschwindigkeitskonstanten für einen SET-Prozess berechnet. Da die berechneten Geschwindigkeitskonstanten um 11 bis 18 Größenordnungen kleiner sind als die tatsächlich beobachteten, wurde gefolgert, dass SET-Prozesse bei den hier betrachteten Reaktionen keine Rolle spielen. 10. Die experimentell bestimmten Geschwindigkeitskonstanten für die Additionsreaktionen der Carbanionen 24a-h an die Chinonmethide 20a-d sowie für die Koordinationsreaktionen mit den Benzhydrylkationen 2,3,8-11 wurden einer Ausgleichsrechnung anhand von Glei-chung (2.1) unterworfen, wobei die bekannten Elektrophilieparameter E der Benzhydrylkat-ionen 2,3,8-11 verwendet wurden. Die dabei erhaltenen Elektrophilieparameter E für die Chinonmethide 20a-d sowie die Nucleophilieparameter N und nucleophilspezifischen Stei-gungsparameter s für die Carbanionen 24a-h erlauben einen direkten Reaktivitätsvergleich mit Neutralnucleophilen und kationischen Elektrophilen (Abbildung 2). lg k2 (20 °C) = s (E + N) (2.1) 11. Mit Hilfe des N- und s-Parameters für das Carbanion von Malonsäurediethylester 24g wurden mit Gleichung (2.1) die Elektrophilieparameter E für die Benzylidenmalon- säurediethylester 7a-e berechnet (Tabelle 1).