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Cetuximab ist ein monoklonaler Antikörper, der zunehmend in der Krebstherapie eingesetzt wird. Die typischste Nebenwirkung ist ein steriles makulo-papulöses Exanthem, das in vielen Studien positiv mit der Prognose korreliert. Auf die Therapie mit Cetuximab spricht jedoch nur ein begrenzter Anteil der Patienten an. Aufgrund der Nebenwirkungen und der nicht unerheblichen Kosten der Therapie wäre es von Interesse im Vorfeld die Patienten einzugrenzen, die am meisten von der Therapie profitieren. Ein Biomarker, der es erlaubt, vor Beginn der Therapie mit Cetuximab die Wirksamkeit der EGF-Rezeptor Inhibition bei einzelnen Patienten vorherzusagen, war bislang nicht bekannt. Das Exanthem, das in vielen Studien mit der Prognose korreliert, tritt erst einige Tage bis Wochen nach Behandlungsbeginn auf und ist daher als Entscheidungshilfe für oder gegen eine Cetuximab-Therapie ungeeignet. Bei dem Exanthem handelt es sich um eine sterile Entzündung und damit um ein immunologisches Geschehen. So entstand der Ansatz, einen immunologischen Marker zu suchen, der vor Therapiebeginn Aufschluss über die Wirksamkeit von Cetuximab bei unterschiedlichen Patienten geben kann. Für die vorliegende Arbeit wurden bei Cetuximab-behandelten Patienten Subpopulationen von Lymphozyten und dendritischen Zellen in Blut und Haut und antimikrobielle Peptide in der Haut durchflusszytometrisch und immunhistochemisch untersucht und mit gesunden Kontrollpersonen und Patienten unter einer Standard-Chemotherapie verglichen. Diese immunbiologischen Parameter wurden außerdem auf einen Zusammenhang mit Exanthemstärke und dem Therapieansprechen untersucht. Im Rahmen unserer Untersuchungen war es uns möglich, das Cetuximab-induzierte Exanthem näher zu charakterisieren. Das Zellinfiltrat wird epidermal durch immigrierte IDEC und regulatorische T-Zellen, dermal durch T-Helferzellen und Memory-Zellen dominiert. Zusätzlich treten plasmazytoide dendritische Zellen auf. Epidermal ist die Expression von humanem β-Defensin 2 erhöht. Der negative Zusammenhang zwischen der Anzahl dermaler zytotoxischer T-Zellen und dem Schweregrad des Exanthems ist ein Hinweis, dass es sich bei der Genese des Cetuximab-induzierten Exanthems nicht um eine Typ IV Immunreaktion handeln könnte. Unsere Untersuchungen im Blut haben keine Ergebnisse erbracht, die allein auf die Therapie mit Cetuximab zurückzuführen wären und als Biomarker für die biologische Wirksamkeit des Cetuximab verwendet werden könnten. Manche Veränderungen, wie die Induktion der CD11c+CD1a+ myeloiden dendritischen Zellen im Blut, korrelieren mit der Exanthemausprägung und sind auf das generalisierte Cetuximab-induzierte Exanthem zurückzuführen. Ergebnisse anderer Studien, die eine Zunahme der regulatorischen T-Zellen bei Tumorpatienten als negativen prognostischen Faktor etabliert haben, wurden durch unsere Untersuchungen bestätigt. In der Mehrzahl der klinischen Studien korreliert das Auftreten des Exanthems positiv mit der Prognose. Die Untersuchungsergebnisse zum Zusammenhang zwischen Exanthemausprägung und der Überlebensdauer sind hingegen zwiespältig. In unsere Studie wurden ausschließlich Patienten mit Cetuximab-induziertem Exanthem eingeschlossen. Die Ausprägung des Exanthems korrelierte in unseren Unter-suchungen nicht mit dem Tumoransprechen. Nach neueren Untersuchungen kann eine fehlende Korrelation zwischen Hautexanthem und Therapieansprechen auf Cetuximab mit Unterschieden im Dimerisationsstatus und im Dimerisationspartner des EGF-Rezeptors in der Haut und im Tumorgewebe zusammenhängen. Auf Keratinozyten übernehmen mehrheitlich EGF-Rezeptor Homodimere die Liganden-vermittelte Signalweiterleitung, während diese im Tumorgewebe von anderen EGFR-Heterodimeren vermittelt wird. Die Ergebnisse der Korrelationsanalysen zwischen Exanthemausprägung und dem Tumoransprechen in der Literatur stellen jedoch meist keine Korrelation zwischen Exanthemausprägung und dem Therapieansprechen her. Zusätzlich wurden die von uns erhobenen Daten an einem besonderen Patientenkollektiv erhoben. Ein systematischer Fehler aufgrund der Rekrutierungsbedingungen kann nicht ausgeschlossen werden. Ein Zusammenhang zwischen einem Auftreten des Exanthems und dem Therapieansprechen kann daher aufgrund des hier erhobenen Datenmaterials nicht beurteilt werden, da wir nur Patienten mit bestehendem Exanthem in unsere Studie eingeschlossen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die von uns untersuchten immunologischen Parameter keinen neuen prädiktiven Wert für das Auftreten des Exanthems oder das Ansprechen auf Cetuximab erbracht haben. In der Literatur ist neben dem negativen K-Ras-Status bisher kein Biomarker beschrieben, der das Ansprechen auf Cetuximab zuverlässig vorhersagen würde.

Unsere Untersuchungen zeigen erstmalig eine Vierfach-Immunfluoreszenz auf humanen mesenchymalen Stammzellen. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren und die Lokalisation der nachgewiesenen Antigene zu untersuchen. Die markierten Proteine Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV und CD 44 gehören dabei zum typischen Expressionsmuster von mesenchymalen Stammzellen. Durch die Kombination von Filtersets und dem Einsatz des spektralen Bildanalyseprogramms SpectraView (ASI, Israel) gelang es selbst Wellenlängen, die näher als 20nm beieinander lagen, voneinander zu unterscheiden. Bei der Auswertung bestätigte sich, dass hMSC aus einem heterogenen Zellpool bestehen. Dies zeigte sich unter anderem in der unterschiedlichen Expression des Markers Kollagen IV. Erweitert man nun das Färbeprofil um zusätzlichen Marker, so können diese Zellen auf Einzelzellebene eingehender untersucht und von anderen Zellarten und Vorläuferstufen abgegrenzt werden. Die in dieser Arbeit neu für diese Applikation etablierte Methode stellt einen erfolgsversprechenden Ansatz zur Identifikation und Charakterisierung von humanen mesenchymalen Stammzellen dar.

Durch den Transfer tumorspezifischer T-Zellen können solide Tumore nicht nur in Tieren, sondern auch im Menschen erfolgreich behandelt werden. Dudley et al. konnten kürzlich nach dem autologen Transfer stimulierter tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) nach vorheriger non-myeloablativer Konditionierung in zwei von zwölf Patienten mit Melanomen eine Tumorregression erreichen (Dudley et al. 2002). Änliche Erfolge konnten Chang et al. bei der Behandlung von fortgeschrittenen Nierenkarzinomzellen erzielen (Chang et al. 2003). Sie vakzinierten Patienten mit Calmette-Guérin Bacillus versetzten Tumorzellen und ernteten anschließend die T-Zellen aus den angrenzenden Lymphknoten der Vakzinierungsregion. Nach autologem Transfer der vorwiegend CD8+ T-Zellen, welche in vitro mit anti-CD3 stimuliert wurden, sprach die Therapie bei neun von 34 Patienten an. Die Mechanismen der T-zellvermittelten Tumorregression sind aber bis heute noch unklar. Gegenstand dieser Arbeit war es daher Faktoren zu untersuchen, welche eine Rolle bei der Regression von D5-Melanomlungenmetastasen durch den adoptiven Transfer CD4+/CD8+ T-Zellen aus Tumorvakzin drainierenden Lymphknoten (TVDLN) nach Vakzinierung mit D5G6 (einem GM-CSF transduzieren D5-Subklon) spielen. Hierzu wurden D5-Zellen in vitro mit Zytokinen, welche von Effektor T-Zellen (TE) produziert werden, stimuliert. Wir konnten zeigen, dass D5-Tumorzellen die als proapoptotisch geltenden Rezeptoren TNF-R I sowie Fas nach IFN-g-Stimulation exprimieren. Die Inkubation mit den Liganden dieser Rezeptoren TNF-a, LT-a und FasAb bewirkt keine Apoptoseinduktion. Gleichzeitige Inkubation dieser Liganden führt nur zu einer Apoptoserate von 25% in D5. Mögliche Gründe der relativen Apoptoseresistenz von D5 könnten die intrazellulären Apoptoseinhibitionsproteine c-IAP I, c-IAP II und Survivin sein, welche wir in D5 nachweisen konnten. Da nach adoptivem Transfer tumorspezifischer TE Makrophagen die pulmonalen Tumormetastasen infiltrieren, untersuchten wir, ob TE Chemokine exprimieren. Unsere Untersuchungen ergaben, dass TE die Chemokine MIP-1a, MIP-1b und RANTES tumorspezifisch exprimieren. Nach Stimulation von D5-Tumorzellen mit den Zytokinen TNF-a und IFN-g, welche von TE tumorspezifisch exprimiert werden, wird die Chemokin-mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig in D5 exprimiert. Auch die Koinkubation von D5 mit TE induziert die Expression der mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig. Deutlich erhöhte KC und MCP-1 Proteinkonzentrationen wurden im Überstand von D5-Tumorzellen mittels ELISA nach TNF-a Stimulation gegenüber unstimulierten und IFN-g stimulierten D5-Zellen festgestellt. Um zu prüfen, ob die von D5 gebildeten Substanzen auch tatsächlich chemotaktisch auf Makrophagen wirken, führten wir einen chemotaktischen Assay durch. Wir konnten zeigen, dass es zu einer signifikanten Steigerung der Anzahl migrierter Makrophagen in Richtung D5- Tumorzellen nach deren Stimulation mit IFN-g und TNF-a kommt. Da wir in TE die Expression von TNF-a-mRNA und die Sekretion von IFN-g tumorspezifisch nachweisen konnten, besteht Grund zur Annahme, dass in vivo TE in der Lage sind Tumorzellen zur Chemokinbildung anzuregen, was zu einer Invasion von Makrophagen in die Tumorregionen führt. Dass Makrophagen möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Tumorregression spielen, deckt sich auch mit der Beobachtung von Feinmesser et. al., welche mit einer peritumorösen Injektion von Multikinen (Zytokin-/Chemokinmischung) Kopf und Halstumore behandelten (Feinmesser et al. 2003). Nach dieser Therapie zeigte sich in den Tumorregionen der erfolgreich behandelten Patienten im Gegensatz zu Non-Respondern eine hohe Anzahl migrierter und aktivierter Makrophagen. Wir fanden mit den Ergebnissen unserer Studie erstmals Hinweise darauf, dass im murinen Melanommodell B16BL6-D5 nicht ausschließlich die direkte T-zellabhängige Zytotoxizität zur Tumorregression führt, sondern dabei weitere Zellarten wie Makrophagen/Monozyten involviert sind, welche mittels tumorspezifischer Chemokine rekrutiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung der Mechanismen T-zellvermittelter Tumorregression. Die Kenntnisse dieser Mechanismen haben entscheidende Bedeutung bei der Entwicklung neuer, effektiver Behandlungskonzepte gegen solide Tumore.

Strukturelle Skoliosen sind durch komplexe dreidimensionale Wirbeldeformitäten und eine gestörte Statik der Wirbelsäule charakterisiert. Trotz des Einsatzes vielfältiger diagnostischer Möglichkeiten sind die biomechanischen Erklärungsmodelle zur vorliegenden Gelenksmechanik nicht ausreichend und vollständig. Ziel der Arbeit war es, anhand der Untersuchung von Endplatten und Facettengelenken bei strukturellen Skoliosen bisher fehlende präzise Informationen über die Beanspruchungssituation an den Gelenken der Wirbelsäule zu erhalten, den Zusammenhang zum Schweregrad der Erkrankung herzustellen und davon ausgehend die Kräfteverhältnisse in skoliotischen Wirbelsäulen zu beurteilen. Hierzu wurden 72 Brust- und 30 Lendenwirbel von sechs skoliotischen Wirbelsäulen unterschiedlicher Ausprägungsgrade untersucht. Durch die 3-D-Rekonstruktionen von CT-Datensätzen der Wirbel und Winkelmessungen auf den CT-Schnittbildern wurden zunächst die Wirbeldeformitäten analysiert. Mittels der CT-Osteoabsorptiometrie (CT-OAM) (Müller-Gerbl 1989) – einem etablierten Verfahren für die Beanspruchungsanalyse von Gelenken – konnte die individuelle Mineralisierungsverteilung der gelenkigen Verbindungen als Maß der längerfristigen Spannungsverteilung in der subchondralen Knochenlamelle dargestellt werden. Es konnten die skoliosetypischen Wirbeldeformitäten nachgewiesen werden und dabei präzise Aussagen über an den Facettengelenken vorhandene Asymmetrien gemacht werden. Zudem beobachteten wir osteophytäres Knochenwachstum vor allem an den Wirbelsäulen mit stärkerem Krümmungsausmaß. Die Messung des Facettengelenkwinkels an den lumbalen Scheitelwirbeln wies auf eine deutlich frontalere Orientierung der konkavseitigen Facettengelenke hin, wobei die Differenz zwischen linkem und rechtem Winkel ein direkt proportionales Verhalten zum Cobb-Winkel zeigte. Der intraindividuelle Vergleich des Mineralisierungsverhaltens an den Scheitelregionen zeigte eine deutliche Bevorzugung der konkaven Endplattenhälften, sowohl hinsichtlich der Lokalisation der Mineralisierungsmaxima, als auch des Kalziumgehaltes (mg Ca/ml). An den Facettengelenken beobachteten wir ebenfalls eine konkavseitige Erhöhung der Mineralisierung, am apikalen Wirbel selbst wurden jedoch auch vereinzelte Erhöhungen auf der konvexen Seite gefunden. Unsere Untersuchungen zeigen, dass in einer skoliotischen Wirbelsäule sowohl hinsichtlich der Wirbelmorphologie, wie auch hinsichtlich der subchondralen Mineralisierung von Endplatten und Facettengelenken deutliche Asymmetrien nachweisbar sind. Zudem konnten wir eine Abhängigkeit vom Schweregrad der Skoliose und dem Ausmaß der strukturellen Fixierung feststellen. Wir verstehen die von uns beschriebenen Mineralisierungsmuster als Ergebnis der langfristig veränderten Lastverhältnisse in einer skoliotischen Wirbelsäule. Ausgehend von den beobachteten Befunden stellen wir ein eigenes Kräftemodell vor, das die in einer skoliotischen Wirbelsäule vorherrschenden Kräfte darstellt und biomechanische Erklärungen zur Gelenksmechanik skoliotischer Wirbelsäulen liefert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen zudem, dass der Einsatz der CT-OAM in Klinik und Forschung wertvolle Erkenntnisse für die Beurteilung und Planung operativer Wirbelsäuleneingriffe insbesondere bei skoliotischen Wirbelsäulen liefert.

Thema der vorliegenden Arbeit ist die Beschreibung von Ladungstransporteigenschaften molekularer Systeme, wenn diese das Verbindungsstück zweier Elektroden bilden. Einen technologischen Meilenstein setzte auf diesem Gebiet die Rastertunnelmikroskopie, welche ursprünglich für die Abbildung von Oberflächen mit atomarer Auflösung entwickelt wurde (Binnig et al., 1981). Heute ermöglicht sie die gezielte Untersuchung von Transporteigenschaften einzelner, auf Oberflächen adsorbierter Moleküle. Parallel dazu hat der immense Fortschritt in der Miniaturisierung klassischer elektronischer Bauteile in jüngster Zeit ermöglicht, Zuleitungsstrukturen auf der Nanometerskala zu bauen, und diese mit einzelnen oder wenigen Molekülen zu überbrücken (Reed et al., 1997). Es besteht die Hoffnung, mit solchen Systemen Schaltungselemente zu realisieren, die heutigen elektronischen Bauteilen in Hinblick auf ihre Effizienz und den Grad ihrer Miniaturisierung deutlich überlegen sind. Experimente mit diesen molekularelektronischen Apparaten werfen die Frage auf, wie sich die chemische Natur eines Moleküls sowie seine Kopplung an die Oberfläche der Elektroden auf die Leitungseigenschaften auswirkt. Eine theoretische Beantwortung dieser Frage erzwingt eine quantenmechanische Beschreibung des Systems. Ein genaues Verständnis dieser Zusammenhänge würde ein gezieltes Entwerfen molekuarelektronischer Bauteile ermöglichen. Trotz bedeutender experimenteller wie theoretischer Fortschritte besteht zwischen den Ergebnissen bisher allerdings nur beschränkt Übereinstimmung. Diese Arbeit beginnt mit einem Überblick über die gängigen Methoden zur theoretischen Beschreibung von Ladungstransport durch molekulare Systeme und charakterisiert sie hinsichtlich der ihnen zugrundeliegenden Annahmen und Näherungen. Dabei findet eine Unterteilung in störungstheoretische sowie streutheoretische Verfahren statt. Anschließend werden Methoden der Quantenchemie behandelt, da diese in nahezu allen Ansätzen zur Beschreibung von elektronischem Transport durch molekulare Systeme Anwendung finden. Wir liefern eine Zusammenstellung der wichtigsten unter den auf diesem Gebiet in immenser Anzahl entwickelten Methoden und der ihnen zugrundeliegenden Näherungen. Auf diese allgemeinen Darstellungen folgt eine detaillierte Beschreibung des numerischen Verfahrens, das im Rahmen dieser Dissertation zur Berechnung von Stromtransport durch Molekülstrukturen implementiert worden ist. Mit der vorliegenden Arbeit wird eine Verallgemeinerung eingeführt, die eine vormalige Einschränkung der ursprünglichen Methode bezüglich der betrachtbaren Systeme beseitigt. Diese so erhaltene Methode wird dann verwendet, um der durch Experimente von Dupraz et al. (2003) aufgekommenen Frage nachzugehen, welchen Einfluß die verschiedenen geometrischen Anordnungen einer Gruppe von identischen Molekülen auf die Leitfähigkeitseigenschaften eines molekularelektronischen Apparats ausüben. Unsere Untersuchungen zeigen, daß sich die Transporteigenschaften nur bei Bildung von Molekülgruppierungen mit bedeutender intermolekularer Wechselwirkung wesentlich von denen einzelner Moleküle unterscheiden. Damit lassen sich Konsequenzen aus der Stabilität von Molekül-Elektroden Verbindungen für die Reproduzierbarkeit von gewonnenen Meßdaten ableiten. Abschließend befassen wir uns mit der Berechnung von Rastertunnelmikroskop-Bildern. Dabei geben wir zuerst einen Überblick über bisherige Anwendungen von Modellrechnungen zur Erklärung experimenteller Daten. Dann präsentieren wir eigene Berechnungen, die im Rahmen einer Kooperation mit Constable et al. (2004) dazu beitragen sollen, durch Vergleich mit deren experimentellen Bildern verschiedene Konformationen eines auf Graphit adsorbierten Moleküls identifizieren zu können. Die enorme Größe des Moleküls führt zu Gesamtsystemgrößen, die eine numerische Durchführung in der Praxis bisher scheitern ließen. Durch eine neuartige Zerlegung des Eigenwertproblems, das die praktische Durchführung der von uns verwendeten Methode bisher verhinderte, sind wir in der Lage, erstmalig Berechnungen für weitaus größere als die bisher betrachtbaren Systeme durchzuführen.

Verschiedene, am gleichen Patienten durchgeführte Stimulationsteste für die ADH-Sekretion (17-Std.-Durstversuch, Carter-Robbins-Test, osmotische Diurese) zeigen eine ausgezeichnete Korrelation. Auf Grund dieser Ergebnisse werden Richtlinien zur möglichst einfachen Diagnostik einer Konzentrationsstörung vorgeschlagen. In den meisten Fällen kann allein schon auf Grund eines exakt durchgeführten Durstversuchs eine Konzentrationsstörung nachgewiesen (höchste Urinosmolalität < 500 mOsm/kg) bzw. ausgeschlossen (höchste Urinosmolalität > 750 mOsm/kg) werden. Lediglich bei einer höchsten Urinosmolalität im 17-Std.-Durstversuch zwischen 500 und 750 mOsm/kg müssen aufwendigere und den Patienten mehr belastende Tests (z. B. Carter-Robbins-Test) eingesetzt werden, um das Vorliegen bzw. den Grad einer Konzentrationsstörung endgültig diagnostizieren zu können. ADH-Injektionen dienen dabei zur Differenzierung zwischen einem ADH-Mangel und einer mangelhaften ADH-Ansprechbarkeit der Niere. Unsere Untersuchungen an hypophysektomierten Patienten (N=29) zeigen auch bei Patienten ohne polyurisch-polydiptisches Syndrom (N=22) eine gegenüber Normalpersonen signifikant eingeschränkte Konzentrationsleistung im 17-Std.-Durstversuch.