Podcasts about bakteriorhodopsin

Die Erde ist heute der "blaue" Planet. Früher aber könnte sie vielleicht lila gewesen sein. Und das hat Auswirkungen auf unsere Suche nach außerirdischem Leben. Mehr dazu erfahrt ihr in der neuen Folge der Sternengeschichten. Wer den Podcast finanziell unterstützen möchte, kann das hier tun: Mit PayPal (https://www.paypal.me/florianfreistetter), Patreon (https://www.patreon.com/sternengeschichten) oder Steady (https://steadyhq.com/sternengeschichten)

Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000 Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden. Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H. sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren. Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA (Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung, bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden. Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle aufgestellt und verbessert werden.

Die zeitaufgel"oste Fluoreszenzspektroskopie stellt einen Zugang zur Dynamik von Molek"ulen dar. Da schnelle molekulare Vorg"ange, wie z.B. Isomerisierungen, innerhalb weniger 100 fs oder sogar darunter ablaufen k"onnen, erfordert ihre Untersuchung Techniken, die Zeitaufl"osungen in diesem Bereich erlauben. Elektronische Me"sverfahren erreichen derartige Zeitaufl"osungen jedoch nicht. Daher wird bei zeitaufgel"osten Fluoreszenzmessungen auf optische Methoden zur"uckgegriffen. In dieser Arbeit wird der Aufbau und die Weiterentwicklung eines Me"ssystems f"ur die zeitaufgel"oste Beobachtung von Fluoreszenzspektren molekularer Proben auf der Basis des Kerr-Effekts vorgestellt. Nach Anregung der Proben mit Laserimpulsen im ultravioletten oder sichtbaren Spektralbereich kann bei einer Zeitaufl"osung von ca. 100 fs gleichzeitig eine Messung "uber einen sehr breiten Spektralbereich vom nahen Ultravioletten bis ins nahe Infrarote durchgef"uhrt werden. Auf dieser Grundlage wird die Fluoreszenz einer Reihe von Proben untersucht, die nach optischer Anregung isomerisieren. Es handelt sich hierbei um die Molek"ule 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol, Bakteriorhodopsin und Proteorhodopsin. Das Push-Pull substituierte Azobenzolderivat 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol (NA) isomerisiert nach Photoanregung ebenso wie das unsubstituierte Azobenzol. Trotz stark unterschiedlicher elektronischer Struktur offenbart sich eine erstaunliche "Ahnlichkeit in der Dynamik beider Molek"ule. Beide Systeme besitzen in der Emission ein "ahnliches biphasisches Verhalten. F"ur NA wurden Zeitkonstanten von 0.08 ps und 0.8 ps und ein verz"ogerter Anstieg der Fluoreszenz im langwelligen Teil der Spektren bestimmt. Ein Unterschied zu unsubstituiertem Azobenzol besteht in den um etwa den Faktor drei k"urzeren Zeitkonstanten von NA. Der prim"are Schritt im Photozyklus von Bakteriorhodopsin (BR) besteht in der Isomerisierung des Retinalmolek"uls, welches als Chromophor dient. W"ahrend die Zeitskalen dieser Isomerisierung aus transienten Absorptionsexperimenten bereits bekannt sind, unterliegen die damit assoziierten molekularen Prozesse weiterhin einer kontroversen Diskussion. In den hier durchgef"uhrten Emissionsmessungen wurde neben den bereits bekannten Zeitkonstanten von < 0.15 ps und 0.45 ps f"ur den Fall niedriger Anregungsdichten das erste Mal ein dynamischer Stokes-Shift auf der Zeitskala von 0.2 ps entdeckt. Im Falle hoher Anregungsdichten k"onnen die deutlichen "Anderungen der zeitaufgel"osten Spektren Mehrphotonenabsorptionen zugeordnet werden. Erst vor kurzer Zeit wurde das Proteorhodopsin (PR) als neues Mitglied der Familie der rhodopsinartigen Proteine entdeckt. Ebenso wie bei BR ist der prim"are Schritt des Photozyklus die Isomerisierung seines Retinalmolek"uls. Hier wurden zum ersten Mal zeitaufgel"oste Fluoreszenzmessungen an PR durchgef"uhrt. Es wurde, wie auch bei BR, ein dynamischer Stokes-Shift gefunden. Im Gegensatz zu BR besitzt PR in der Emission jedoch drei Zeitkonstanten von < 0.15 ps, 0.45 ps und 4 ps. Die dritte Zeitkonstante kann mit einem spektral dunklen Zwischenzustand assoziiert werden.

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Primaerreaktion der Photosensoren Sensorrhodopsin I und II aus dem Archaebakterium Halobacterium salinarum und Sensorrhodopsin II aus Natronobacterium pharaonis sowie die Durchfuehrung vergleichender Messungen an dem zur selben Familie gehoerenden Membranprotein Bakteriorhodopsin. Spektral aufgel�oste Anreg-Abtast-Experimente im sichtbaren Spektralbereich ermoeglichten dabei einen umfassenden Einblick in die schnellsten Prozesse nach der Lichtanregung. Da Femtosekundenlasersysteme mit den erforderlichen Spezifikationen zu Beginn dieser Arbeit noch nicht kommerziell erhaeltlich waren, musste zur Realisierung der Experimente ein Ti:Saphir-Laseroszillator und ein CPA-Verstaerker entwickelt werden, der die benoetigten Lichtimpulse von ca. 100 fs Dauer und 1 mJ Ausgangsleistung bei hoher Stabilitaet lieferte. Erste Hinweise auf das Verhalten der elektronisch angeregten Zustaende der Sensorrhodopsine vermittelten die in einem modifizierten hochempfindlichen Ramanspektrometer aufgenomenen Fluoreszenzspektren. Dabei konnten erstmalig die Fluoreszenzquantenausbeuten der Sensorrhodopsine bestimmt werden und unter gewissen Annahmen auch die Lebensdauern ihrer elektronisch angeregten Zustaende abgeschaetzt werden. Die Anreg-Abtast-Experimente wurden mit einer Zeitau �osung von ca. 100 fs im Spektralbereich von etwa 400 nm bis 700 nm durchgef�uhrt, wobei Absorptionsaenderungen im Promillebereich aufgeloest werden konnten. Innerhalb der ersten 200 fs nach der Lichtanregung wurden bei allen untersuchten Proben schnelle, nichtexponentielle Reaktionskinetiken beobachtet, die durch eine stark gedaempfte Abwaertssbewegung des auf der Potential flaeche des elektronisch angeregten Zustands praeparierten Wellenpakets interpretiert werden koennen. Diese Ergebnisse stuetzen mehrdimensionale Modelle der Primaerreaktion, bei denen der Isomerisierung des Retinals eine schnelle Relaxation hochfrequenter Schwingungsmoden vorausgeht. Die Rueckreaktion in den elektronischen Grundzustand und die damit verbundene Isomerisierung des Retinals verlaeuft im Fall des Photosensors Sensorrhodopsin II trotz der unterschiedlichen Grundzustandsspektren sehr aehnlich zu Bakteriorhodopsin. Bei Sensorrhodopsin I wurde jedoch eine sehr langsame Rueckreaktion innerhalb einiger Pikosekunden beobachtet, die bei dem eingestellten pH-Wert vermutlich zumindest teilweise durch eine veraenderte elektrostatische Wechselwirkung mit dem Gegenion der Schiss- schen Base verursacht wird. Ueber den Vergleich mit Literaturdaten an Halorhodopsin und BR-Mutanten konnten Vermutungen, dass die Geschwindigkeit der Primaerreaktion stark von dieser Wechselwirkung beein usst wird, weiter bestaetigt werden. Aus den aufgenommenen Daten konnten weiterhin die erst lueckenhaft bekannten Photozyklen der Sensorrhodopsine um einige Schritte ergaenzt werden und die Absorptionsquerschnite der gefundenen Zwischenzust�ande berechnet werden. Schliesslich konnte ein qualitatives Modell fuer die Prim�arreaktion der Familie der Retinalproteine vorgeschlagen werden, das als Grundlage fuer zuk�unftige Arbeiten dienen kann.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.

In dieser Arbeit wurde die in den letzten Jahren entwickelte Technik der auf dem Kraftmikroskop basierenden Einzelmolekül-Kraftspektroskopie auf zwei spezielle Systeme angewendet: Poly(ethylen Glycol) (PEG) und das Membranprotein Bakteriorhodopsin. Im Vordergrund stand dabei die Analyse der mechanischen Stabilität von Sekundärstrukturen. PEG ist aufgrund seiner ungewöhnlich hohen Wasserlöslichkeit eines der wichtigsten Polymere mit einer Vielzahl von technischen Anwendungen. Es wurden Messungen zur Elastizität einzelner PEG in Abhängigkeit des Lösungsmittels durchgeführt. Mit diesen Messungen konnte der genaue molekulare Mechanismus nachvollzogen werden, der zu der hohen Wasserlöslichkeit führt. Zudem konnte gezeigt werden, wie mit einem einfachen Modell neben Konformationsänderungen auch Konformationsenergien des Polymers quantitativ bestimmt werden können. Die Kraftspektroskopie als Instrument zur Untersuchung von mechanisch induzierten Strukturänderungen, z.B. der Proteinentfaltung, wurde bisher immer nur auf polymere Strukturen angewendet. Ziel der Messungen an Bakteriorhodopsin war es zu zeigen, dass sich diese Technik auch auf Moleküle anwenden lässt, die nicht aus sich wiederholenden Einheiten aufgebaut sind. Es konnte der genaue Entfaltungsweg von Bakteriorhodopsin mit all seinen stabilen Zwischenstrukturen bestimmt werden. Mechanismen der Stabilisierung wie die Nachbarschaft von Helices, hydrophobe Wechselwirkung und der Einfluss räumlicher Einschränkung konnten dabei in ihren Auswirkungen auf die Stabilität der Proteinstruktur beobachtet werden.

Moderne optische Methoden erlauben es, ultrakurze Lichtimpulse mit einer Dauer von wenigen Feitosekunden (10"1 S s) herzustellen. Mit diesen Lichtimpulsen, die nur aus wergen Schwingungsperioden des elektromagnetischen Feldes bestehen, können sftnellste Vorgänge in Physik, Chemie und Biologie direkt zeit aufgelöst beobaciet werden. In diesem Artikel werden die Grundlagen der Ultrakurzzeitspektoskopie erarbeitet und als Beispiel ihrer Anwendung Ergebnisse über die Pimärreaktion der Photosynthese von Bakteriorhodopsin vorgestellt.