Podcasts about sequenzanalyse

Als ein vom Menschen stark beeinflusstes und freizeitlich genutztes Ökosystem sind städtische Grünflächen in Hinblick auf zeckenübertragene Krankheiten von besonderem wissenschaftlichem Interesse. Zu diesem Zweck wurden Zecken monatlich über zwei Jahre in insgesamt neun verschiedenen Parks in fünf bayerischen Städten mit der Flaggmethode gesammelt und die Zeckendichte(Adulte und Nymphen/100m²) ermittelt. Neun Standorte wurden 2009 mittels spezifischer konventioneller und real-time PCRs auf die Anwesenheit von DNA von Babesia spp., A. phagocytophilum, Rickettsia spp.und Bartonella spp. untersucht sowie fünf ausgewählte Standorte zusätzlich auf Babesia spp. und A. phagocytophilum in 2010. Speziesdifferenzierungen wurden mittels Sequenzanalyse und Abgleich der amplifizierten PCR-Produkte mit der GenBank vorgenommen. Es wurden insgesamt 13.403 I. ricinus sowie jeweils eine I. frontalis und I. hexagonus gefangen. Die Zeckendichte variierte zwischen 15 - 53 Zecken/100m² in 2009 bzw 15 - 35 Zecken/100m² in 2010 abhängig vom untersuchten Standort. Eine Stichprobe von 6.593 Zecken (5.569 für A. phagocytophilum) wurde untersucht mit folgenden Ergebnissen: Babesia spp.(2009: 0,4% mit einem Larvenpool (Lp) à 2 Larven; 2010: 0,5-0,7% mit einem Lp à 5 Larven); A. phagocytophilum (2009: 9,5%; 2010: 6,6%); Rickettsia spp. (2009: 6,4-7,7% mit 76 Larven in 16 Lps). Sequenzanalysen ergaben die Anwesenheit von Babesia sp. EU1 (n= 25), B. divergens (n= 1), B. divergens/capreoli (n= 1), B. gibsoni-like (n= 1), R. helvetica (n= 272), R. monacensis strain IrR/Munich (n= 12) und R. monacensis (n= 1). Die Anwesenheit von Bartonella spp konnte nicht nachgewiesen werden. Coinfektionen wurden in 0,7% aller untersuchten Zecken in 2009 festgestellt. Eine weiterführende Analyse positiver A. phagocytophilum-Proben bezüglich des 16S rRNA-Gens ergab sechs verschiedene Sequenzvarianten, von welchen schon zwei mit Erkrankungsfällen im Menschen assoziiert wurden. Prävalenzschwankungen zwischen Jahren und Standorten sowie ein außergewöhnliches Speziesauftreten von Babesia spp. zeigen, dass das Vorkommen von zeckenübertragenen Pathogenen von einer Vielzahl biotischen und abiotischen Faktoren abhängig sein kann und das Habitat „Stadtpark“ dabei eine besondere Stellung einnimmt.

Die überwiegende Mehrzahl der chloroplastidären Proteine ist im Nukleus kodiert und muss folglich posttranslational in das Organell importiert werden. Der Transport dieser Vorstufenproteine in die Chloroplasten wird von zwei multimeren Proteinkomplexen bewerkstelligt, den Toc- (Translocon at the outer envelope of chloroplasts) und Tic- (Translocon at the inner envelope of chloroplasts) Komplexen. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte des Proteinimports analysiert: (i) die Evolution des Proteintransports, (ii) die Importwege von Proteinen der inneren Hüllmembran und (iii) die Struktur und Funktion des Kanalproteins Tic110. Zur Untersuchung der Evolution des Proteinimports wurde die Translokation verschiedener Vorstufenproteine in Chloroplasten höherer Pflanzen mit der in Chloroplasten des Mooses Physcomitrella patens verglichen. Dabei wurden Kinetik, Energiebedarf und Prozessierung analysiert. Dies ermöglicht Aussagen über die Entwicklung des Proteintransports, da bekannt ist, dass die Zusammensetzung der Toc- und Tic-Komplexe in der nicht-vaskulären Pflanze P. patens Unterschiede zu den Importapparaten höherer Pflanzen aufweist. Es konnte verdeutlicht werden, dass die untersuchten Vorstufenproteine dennoch das gleiche Importverhalten in den analysierten Modelsystemen zeigen, was darauf hinweist, dass die Importwege trotz der Unterschiede in den Translokationskomplexen konserviert sind. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde der Import von Proteinen der inneren Hüllmembran analysiert, für welche zwei unterschiedliche Wege beschrieben wurden: im „conservative-sorting“-Weg werden die Proteine über die Toc- und Tic-Komplexe in das Stroma transportiert, wo das Erkennungssignal von der stromalen Prozessierungspeptidase vom maturen Protein getrennt wird, bevor anschließend die Insertion der Proteine in die Membran erfolgt. Beim „stop-transfer“-Weg dagegen stagnieren die Proteine auf Höhe des Translokationskanals der inneren Hüllmembran und werden von dort lateral in die Membran inseriert. Eine systematische Charakterisierung der Importwege hydrophober Proteine der inneren Membran in Chloroplasten von Pisum sativum bezüglich Energiebedarf, Nutzung von Rezeptorkomponenten, sowie Bildung löslicher Intermediate konnte zeigen, dass die Insertion der untersuchten Vorstufenproteine in die innere Hüllmembran mittels des „stop-transfer“-Weges erfolgt. Des Weiteren wurde die Struktur und Funktion des Kanalproteins der inneren Chloroplastenmembran - Tic110 - näher untersucht, wobei vor allem die Verankerung von Tic110 in die Membran von Interesse war. Tic110 besitzt zwei N-terminale, hydrophobe Transmembranhelices, welche für die Verankerung in die Membran verantwort-lich sind, sowie vier C-terminale, amphipatische Transmembrandomänen. In dieser Arbeit konnte mittels Sequenzanalyse ein konservierter Bereich am Ende der ersten amphipatischen Helix identifiziert werden, welcher ebenfalls maßgeblich an der Membranverankerung beteiligt ist. Eine Mutation dieser Domäne führt zu einer Konformationsänderung des Proteins, woraufhin es nicht mehr in der Lage ist, stabil in Membranen zu inserieren. Die Topologie von Tic110 macht deutlich, dass große Teile des Proteins sowohl in den Intermembranraum, als auch in das Stroma hineinragen, wohingegen die amphipatischen Transmembrandomänen den Translokationskanal bilden. In dieser Arbeit konnte ein künstliches Importsystem mittels in Liposomen rekonstituiertem Tic110 etabliert werden, wodurch nicht nur gezeigt werden konnte, dass Tic110 in der Lage ist, Vorstufenproteine zu binden, sondern auch, dass eine Translokation der Proteine erfolgen kann. Die Daten weisen auf eine bedeutende Rolle von Tic110 als Proteinimportkanal der inneren Hüllmembran hin.

Die hohe genetische Variabilität von HIV stellt ein großes biologisches Hindernis für die Entwicklung erfolgreicher Medikamente und Impfstoffe dar. Im Laufe seiner Evolution hat HIV eine Vielzahl von Untergruppen und Subtypen entwickelt, die in unterschiedlichen geographischen Regionen und Bevölkerungsgruppen eigenständige Epidemien geschaffen haben, aus denen sich die weltweite Pandemie zusammensetzt. Die hohe Evolutionsrate von HIV wird verursacht durch seine Fähigkeit, schnell zu mutieren, zu rekombinieren und sich mit einer sehr kurzen Generationszeit zu replizieren. Während die kontinuierliche Akkumulation von Punktmutationen eher zu allmählichen Veränderungen der biologischen Eigenschaften des Virus führt, können durch Rekombinationsereignisse zwischen verschiedenen Virusisolaten plötzlich größere Genomabschnitte ausgetauscht und damit eventuell fittere Varianten generiert und selektiert werden. Eine rasche Bildung von Fluchtmutanten oder Resistenzen gegen antiretrovirale Therapie sind die Konsequenz. Voraussetzung für die Bildung derartiger Mosaikgenome ist zum einen die zeitgleiche Infektion einer Zielzelle mit mehreren Virionen und zum anderen die Koinfektion eines Individuums mit mehr als einer HIV-Variante. Koinfektionen und Rekombinationen mit verschiedenen HIV-1 Subtypen sind besonders wahrscheinlich in Regionen, in denen mehrere Virusvarianten kozirkulieren, wie in Tansania, wo man die HIV-1 Subtypen A, C und D nebeneinander findet. Zur Untersuchung der genauen Subtypenverteilung mit besonderem Fokus auf rekombinante Formen und Mehrfachinfektionen wurde in der Region Mbeya im Südwesten Tansanias eine Hochrisikokohorte von 600 Barfrauen gebildet, die alle drei Monate über einen Zeitraum von vier Jahren nachuntersucht wurden (HISIS-Studie). Die initiale HIV-1 Prävalenz in dieser Kohorte betrug 67,8%. 75 zufällig aus dieser Studie ausgewählte HIV-1 positive Frauen wurden in dreimonatigen Intervallen mit dem Multiregion-Hybridisation-Assay (MHAACD) auf ihren HIV-1 Subtyp hin getestet. Dieser sensitive und durchsatzstarke Subtypisierungstest beruht auf dem Prinzip einer real-time PCR mit subtypenspezifischen Hybridisierungssonden, die an die HIV-DNA in fünf Genomregionen binden. Neben reinen Subtypen kann der MHAACD auch rekombinante Viren und Doppelinfektionen mit hoher Vorhersagekraft nachweisen. Die Verteilung der reinen (nichtrekombinanten) Subtypen zu Beginn der Studie wurde dominiert von C mit 34%, gefolgt von A mit 9% bzw. D mit nur 5%. Damit wird der größere Einfluß der südlichen Nachbarn, in denen ebenfalls der Subtyp C überwiegt, auf die Region Mbeya im Vergleich zu den nördlich angrenzenden vor allem von Sutyp A und D dominierten Staaten deutlich. 52% aller Infektionen sind entweder verursacht durch rekombinante Viren (32%) oder Mehrfachinfektionen mit Beteiligung von Rekombinanten (20%). Dieser Prozentsatz liegt sehr viel höher als in der Allgemeinbevölkerung dieser Region und impliziert daher eine Korrelation zwischen dem Risikoverhalten der Infizierten und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-1 Mehrfachinfektion und dem Auftreten von rekombinanten Formen. Die Mehrheit der Koinfektionen schienen nicht auf einer simultanen, sondern einer sequentiellen (Superinfektion) Transmission verschiedener Virusvarianten zu beruhen, was durch den Vergleich zweier Gruppen von Barfrauen belegt wird. Erstere befanden sich in einem mittleren Infektionsstadium der HIV-1 Infektion und wiesen eine signifikant geringere Prävalenz an Mehrfachinfektionen (9%) auf als die zweite Gruppe der Teilnehmerinnen, die sich zu Beginn der Studie schon in einem Spätstadium bzw. im AIDS-Stadium befand und mit 30% einen deutlich höheren Anteil an Mehrfachinfektionen zeigte. Aus den durch den MHAACD detektierten Mehrfachinfektionen wurde eine Studienteilnehmerin mit einer fortgeschrittenen HIV-1 Infektion zur detaillierten Analyse der viralen Populationen ausgewählt. Sie entwickelte innerhalb von 12 Monaten nach Eintritt in die Studie AIDS definierende Symptome und verstarb kurz darauf an den Folgen der Immunschwäche. Der an fünf aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (0, 3, 6, 9, 12 Monate) durchgeführte MHAACD-Test enthüllte eine AC-Doppelinfektion in der vpu-Region. Diese konnte durch die Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von drei Genomfragmenten (gag/pol, vpu/GP120, GP41/nef) bestätigt werden. Eine detaillierte phylogenetische Sequenzanalyse der Region 2 (vpu/GP120) enthüllte eine zweite A-Variante, weshalb von einer Dreifachinfektion der Patientin ausgegangen werden kann. Zusätzlich wurden in allen drei untersuchten Genomregionen eine Reihe von aus den Elternformen gebildeten rekombinanten Viren identifiziert. Die komplexeste virale quasispecies mit mindestens acht verschiedenen molekularen Formen wurde in der Region 2 (vpu/GP120) gefunden. Die Anteile der verschiedenen viralen Varianten in den analysierten Regionen fluktierten sehr stark über den Untersuchungszeitraum von einem Jahr, weshalb eine longitudinale einer cross-sektionalen Analyse zur zuverlässigen Detektion von Koinfektionen vorzuziehen ist. Eine eindeutige Tendenz zu stärkerer Homogenisierung bzw. Diversifizierung der quasispecies mit der Manifestierung von AIDS und damit sinkendem Immundruck konnte nicht festgestellt werden. Für die Amplifikation der drei untersuchten Genomfragmente im Rahmen einer verschachtelten PCR wurden jeweils vier verschiedene Primerkombinationen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz multipler Primerpaare eine Selektion bestimmter Virusvarianten während der PCR verringern und damit die Wahrscheinlichkeit der Detektion einer Mehrfachinfektion im Vergleich zu einer konventionellen PCR erhöhen kann. Eine weitere Sensitivitätssteigerung der Methodik wäre zukünftig durch zusätzliche Primerpaare denkbar. Die detaillierte Untersuchung der viralen Formen spielt eine bedeutende Rolle vor allem im Hinblick auf zukünftige Studien zur Evaluierung von HIV-Vakzinen, wie sie unter anderem in der Region Mbeya in Tansania stattfinden werden. Ein unvollständiges Bild der zirkulierenden HIV-Varianten kann zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse solcher Studien und in der Folge zu einer falschen Einschätzung der Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten führen.

Autotrophe Bacteria sind von zentraler Bedeutung für den terrestrischen Kohlenstoffkreislauf, da sie dem an verfügbaren organischen Kohlenstoffverbindungen armen Boden Biomasse zuführen und einen Beitrag zur Reduzierung des atmosphärischen CO2 leisten könnten. Doch während die autotrophen Prozesse und die daran beteiligten Mikroorganismen in aquatischen Habitaten bereits gut untersucht und verstanden sind, besteht noch erheblicher Forschungsbedarf zur Diversität und Abundanz autotropher Bakterienpopulationen in Böden. In dieser Arbeit sollten zentrale Fragen zur Charakterisierung der autotrophen Gemeinschaften mit Werkzeugen der molekularen mikrobiellen Ökologie bearbeitet werden. Die meisten Prokaryota, die mit CO2 als einzige Kohlenstoffquelle zu wachsen vermögen, fixieren dieses über den Calvin-Benson-Bessham Zyklus. Das Schlüsselenzym dieses Zykluses ist die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO). Die große Untereinheit der Form I-RubisCO wird von dem Gen cbbL kodiert, welches phylogenetisch in zwei Hauptentwicklungslinien unterteilt wird: ‚green-like’ und ‚red-like’. Um einen Einblick in die genetische Diversität CO2-fixierender Bakterien in unterschiedlich gedüngten Agrarböden des Dauerdüngungsversuchs Ewiger Roggenbau in Halle/Saale zu erlangen, wurde eine auf PCR basierende Methodik entwickelt, die auf der Erfassung des Funktionsgens cbbL zielt. Es wurden Datenbankrecherchen durchgeführt und mittels den anschließenden vergleichenden Sequenzanalysen und phylogenetischen Untersuchungen bekannter cbbL-Sequenzen spezifische Oligonukleotid-Primerpaare konstruiert, die ausgewählte cbbL-Sequenzen terrestrischer Bakterien der ‚red-like’ bzw. der ‚green-like’ RubisCO-Linien amplifizieren. Mit Hilfe dieser Primer gelang es cbbL-Genbanken anzulegen, die mittels der Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse und Diversitätindices untersucht und verglichen wurden; ausgewählte Sequenzen wurden einer phylogenetischen Zuordnung unterzogen. Mit den entwickelten Primerpaaren konnten in den untersuchten Böden nur eine geringe Diversität an ‚green-like’ cbbL-Sequenzen festgestellt werden, die phylogenetisch zu den cbbL-Sequenzen von Nitrobacter vulgaris und Nitrobacter winogradskyi nahe verwandt waren. Im Vergleich dazu zeichneten sich die ‚red-like’ cbbL-Sequenzen aus den Böden durch eine hohe Diversität aus, wobei sie phylogenetisch über die gesamte ‚red-like’-Gruppe verteilt waren und sich häufig als nur entfernt verwandt zu bekannten cbbL-Sequenzen herausstellten. Während mit der RFLP-Analyse Bodenbehandlungs-spezifische Muster identifiziert wurden, war nach der phylogenetischen Sequenzanalyse keine Cluster-Bildung in Abhängigkeit von der Bodenbehandlung zu beobachten. Um den Datensatz an vorhandenen ‚red-like’ cbbL-Sequenzen zu erweitern, wurden cbbL-Gene aus verschiedenen kultivierten α- und β-Proteobacteria sowie aus Bakterienisolaten, die in dieser Arbeit aus Boden gewonnen wurden, amplifiziert. Die phylogenetische Sequenzanalyse gruppierte diese cbbL-Sequenzen Taxon-unabhängig zu den verschiedenen Clustern des ‚red-like’-Baums einschließlich der neuen cbbL-Gencluster aus den Halle-Böden. Bakterielle Bodenisolate, die als cbbL-positiv identifiziert wurden, konnten basierend auf ihrer 16S rDNA-Sequenz als Organismen der Gram-positiven Gattungen Bacillus, Streptomyces und Arthrobacter klassifiziert werden. Vertreter dieser bakteriellen Gruppen waren bisher nicht als CO2-Fixierer charakterisiert worden. Der physiologische Beweis eines aktiven CO2-fixierenden Metabolismus über RubisCO steht noch aus. Die Ergebnisse der ‚red-like’ cbbL-Diversitäts-Studie dienten als Grundlage zur Konstruktion weiterer Oligonukleotide, die in der „real-time“ TaqMan-PCR zur Quantifizierung von ‚red-like’ cbbL-Genen aus Boden eingesetzt wurden. Dabei wird ersichtlich, dass in den untersuchten Bodenvarianten bis zu 107 cbbL-Genkopien/g Boden enthalten sind. Die unterschiedlichen Bodenbehandlungen scheinen keinen Einfluss auf die Abundanz von ‚red-like’ cbbL-Genen in Böden zu nehmen.

RNA (rRNA), die eine wichtige, primär funktionale Rolle in der Zellphysiologie einnimmt. Die Gene dieser rRNA lassen sich in hochkonservierte und hochpolymorphe Bereiche unterscheiden. Während in den konservierten Regionen kaum Mutationen zu finden sind, werden in den polymorphen Abschnitten je nach Grad der Verwandtschaft große Sequenzunterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Individuen einer Art zeigen diese Unterschiede nicht. Somit können diese artspezifischen Abweichungen dazu genutzt werden, biologische Materialien unbekannter Herkunft einer bestimmten Tierart zuzuordnen. Mit der Amplifikation und anschließenden Sequenzierung eines Bereiches innerhalb des mitochondrialen 12S-Gens sowie der Auswertung bereits publizierter Sequenzen gelingt die Identifizierung einer Spezies anhand von 20 – 25 Basen. Dazu kann neben der etablierten Methode der Sequenzierung nach Sanger auch die Technik der Pyrosequenzierung genutzt werden. Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit der Identifizierung verschiedener Arten durch die Analyse kurzer Fragmente ihrer 12S-Gen-Sequenz. Dazu reicht die Amplifikation des gewünschten Fragmentes mit Hilfe eines Primerpaares. Für degradierte DNA wurde ein alternativer Rückprimer getestet, der die Amplifikation eines kürzeren Sequenzabschnittes ermöglicht. Es wurden insgesamt 91 Proben verschiedener Tiere analysiert, die sich aus 8 Säugetier-Arten, 2 Fisch-Arten und 3 Vogel-Arten zusammen setzten. Zudem kann und wird die Methode bereits bei Fragestellungen in der forensischen Routine angewendet.

Die HCN Kanäle spielen als molekulare Basis des Ih Stroms eine bedeutende Rolle bei der Entstehung rhythmischer Erregungen. Die HCN Familie der Säugetiere besteht aus vier Mitgliedern (HCN1-HCN4), die in unterschiedlichem Ausmass in verschiedenen Regionen von Herz und Gehirn exprimiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Bildung von Heteromeren zwischen den einzelnen Isoformen, die Glycosylierung der Kanäle und deren Funktion, die Modulation durch cAMP, die Aktivierung in Bezug auf Kinetik und Spannungsabhängigkeit, sowie die Rolle von HCN Kanal-Genen im Rahmen von genetischen Erkrankungen untersucht. Sowohl im Mausgehirn wie auch in HEK Zellen können die HCN Kanal-Untereinheiten miteinander interagieren. Im Mausgehirn wurde die Heteromerisierung von HCN1 und HCN2 durch Ko-Immunpräzipitation nachgewiesen. Durch konfokalmikroskopische Studien an EGFP- bzw. RFP-markierten HCN Isoformen in HEK Zellen konnte für alle HCN-Zweierkombinationen ausser mHCN2 mit mHCN3 eine Kolokalisation im Bereich der Plasmamembran beobachtet werden. Bestätigt wurden diese Ergebnisse durch Ko-Immunpräzipitation. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte verifiziert werden, dass mHCN2 und mHCN3 nicht interagieren. Die HCN Kanäle werden in vivo (Mausgehirn) und in vitro (HEK Zellen) N-glycosyliert. Am Beispiel des mHCN2 wurde die physiologische Relevanz dieser posttranslationalen Modifikation untersucht. Ein mutanter, unglycosylierter mHCN2 Kanal wird nicht mehr zur Plasmamembran transportiert und generiert keinen charakteristischen Einwärtsstrom mehr. Nach Koexpression mit hHCN4 ist die Membranständigkeit dieser Mutante wieder gegeben, sowie auch die Kolokalisation der beiden Kanäle. Im Gegensatz hierzu konnte mHCN3 den unglycosylierten mHCN2 nicht zur Zellmembran transportieren, da zwischen den beiden Kanälen ganz offensichtlich keine Bindung bestehen kann. Die für die Bindung von cAMP an den mHCN2 Kanal essentielle Aminosäure Arginin 591 wurde durch gerichtete Mutagenese und Patch-Clamp-Untersuchungen identifiziert. Der Ersatz des Arginin 591 führt zu mHCN2 Kanälen, die bei Anwesenheit von cAMP nicht mehr wie der Wildtyp Kanal eine Verschiebung der halbmaximalen Aktivierung zu positiveren Potentialen zeigen. Durch elektrophysiologische Charakterisierung von verkürzten mHCN2 Kanälen und Chimären aus mHCN1 und mHCN2 konnten den Unterschieden in Aktivierungskinetik und Spannungsabhängigkeit der HCN Isoformen konkrete Kanalteile zugeordnet werden. Für die Geschwindigkeit der Aktivierung sind die Kernregion und ein Stück des C-Terminus verantwortlich, während der C-Terminus die Spannungsabhängigkeit bestimmt. Die genomische Analyse des HCN2 von Cayman Ataxie-Patienten, die zerebrale Dysfunktionen ähnlich denen von HCN2-knockout Mäusen zeigen, ergab keine Unterschiede im Vergleich zu einem gesunden Probanden. Eine Mutation im HCN2 Gen als Ursache der Cayman Ataxie kann somit ausgeschlossen werden, es besteht jedoch die Möglichkeit einer Störung der Proteinsynthese oder posttranslationaler Modifikationen. Auch bei zwei Patienten, die an familiär bedingtem Sick Sinus Syndrom leiden, konnte die Ursache der Erkrankung nach genomischer Sequenzanalyse nicht durch einen Defekt des HCN2 Gens oder des HCN4 Gens erklärt werden.

Mon, 28 Apr 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/978/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/978/1/Hupfer_Holger.pdf Hupfer, Holger