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Ziel der vorliegenden Studie ist es, den Einfluss von 17β-Östradiol und/oder Progesteron auf die neurologische Funktion in vivo sowie auf die neuronale Morphologie und auf molekulare Aspekte der zerebralen Inflammation und Exzitotoxizität in vitro im Zeitraum von 4 Tagen nach herzchirurgisch typischer extrakorporaler Zirkulation (EKZ) mit 45 min tief hypothermem Kreislaufstillstand („deep hypothermic circulatory arrest“, DHCA) in einem Versuchsmodell an der Ratte zu untersuchen. 100 weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in 5 Versuchsgruppen (n = 20) randomisiert: Eine Gruppe wurde scheinkastriert (Gruppe „Intakt“); die 4 weiteren Gruppen wurden kastriert und je nach Gruppenzugehörigkeit mit einem subkutanen Hormonimplantat versehen: Plazebo (Gruppe „Plazebo“), 17β-Östradiol (Gruppe „Östrogen“), Progesteron (Gruppe „Progesteron“) sowie 17β-Östradiol- und Progesteron (Gruppe „Progesteron + Östrogen“, „P+Ö“). 4 Wochen nach Kastration/Scheinkastration und gegebenenfalls nach Hormon-/Plazebo-Supplementierung wurden die Tiere mit Isofluran (2,0 – 2,5 Vol% in 40 % O2) anästhesiert, intubiert, katheterisiert, mithilfe der EKZ über 30 min auf 16 °C rektale Körpertemperatur abgekühlt und der DHCA wurde für einen Zeitraum von 45 min durchgeführt. Anschließend wurden die Tiere mittels EKZ über 40 min auf 35,5 °C rektale Körpertemperatur wiedererwärmt, die EKZ beendet, die Tiere 1 Stunde nachbeatmet und eine Telemetrie-Transmittersonde intraperitoneal eingesetzt, bevor die Anästhesie beendet, und die Tiere bei Einsetzen der Spontanatmung extubiert wurden. Die postoperative telemetrische Überwachung umfasste Körpertemperatur und Herzfrequenz, letztere gekoppelt mit einem Alarmsystem, um Tiere bei Bedarf (Herzfrequenz < 150 Schläge/min) rechtzeitig euthanasieren zu können. Alle Tiere wurden am präoperativen Tag 1 (Tag –1) neurologisch untersucht sowie an den postoperativen Tagen 1, 2, 3 und 4, sofern sie überlebt haben. Am postoperativen Tag 4 wurden die Tiere in tiefer Isoflurannarkose zur Blut- und Serum-Gewinnung entblutet sowie deren Gehirne entnommen und tiefgefroren (–80 °C). In Hämatoxylin-Eosin (HE-) gefärbten Gehirnschnitten wurde die Anzahl intakter und geschädigter Neurone lichtmikroskopisch in den Bereichen Striatum (Bregma –0,3 mm), Kortex und Hippokampus (Bregma –3,3 mm) ermittelt. Die TNFα-Konzentration im Serum der Tiere wurde mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay bestimmt. Die zerebrale Expression von Östrogenrezeptor α (ERα), von Östrogenrezeptor β (ERβ), von „Excitatory Amino Acid Transporter 1“ (EAAT1), von „Glutamat Transporter 1b“ (GLT-1b), von „CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 2“, (CXCR2), von Interleukin-8 (IL-8) und von induzierbarer Stickoxid Synthase (iNOS) erfolgte mit dem Western-Blot-Verfahren. Die durchgeführten Auswertungen erfolgten für eine nach spezifischen Kriterien getroffene Auswahl von jeweils 5 überlebenden Tieren und 5 euthanasierten Tieren pro Versuchsgruppe. Die statistische Datenanalyse wurde mithilfe allgemeiner linearer Modelle mit post-hoc einfaktorieller Varianzanalyse und Bonferroni-t-Tests bzw. Kruskal-Wallis und post-hoc Mann-Whitney U (p < 0,05) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen keine Versuchsgruppen-spezifischen Unterschiede bei den intra- und postoperativen physiologischen Parametern. Die Serumkonzentrationen von TNFα, die Gehirnmorphologie und die neurologische Funktion zeigten sich vom Versuchsansatz unbeeinflusst. Beim Nachweis der Expression von Rezeptor-, Transporter- und Entzündungsproteinen im Gehirngewebe mittels Western-Blot-Verfahren zeigten sich bei einigen Proteinen Versuchsgruppen-spezifische Unterschiede: Die vorzeitig euthanasierten Tiere der Gruppe „Plazebo“ zeigten eine niedrigere Expression von ERβ als die überlebenden Tiere dieser Gruppe und als die ebenfalls vorzeitig euthanasierten Gruppen „Östrogen“ und „P+Ö“. Des Weiteren exprimierten die überlebenden Tiere der Gruppe „P+Ö“ signifikant mehr EAAT1 im Gehirn als die vorzeitig euthanasierten Tiere dieser Gruppe und auch als die überlebenden Tiere der „Plazebo“-Gruppe. Zusätzlich zeigte sich, dass physiologische hormonelle Schwankungen im Rahmen des Zyklusgeschehens bei der gemeinsamen Wirkung von 17β-Östradiol und Progesteron (Gruppe „Intakt“) im Rahmen der postoperativen zerebralen Inflammation sowohl vorteilhaft (reduzierte iNOS-Expression) als auch von Nachteil (erhöhte IL-8-Expression) gegenüber einer Substituion dieser beiden Hormone (Gruppe „P+Ö“) sein können. Zusammenfassend gesehen bieten aus der Vielzahl der untersuchten Parameter und Faktoren insbesondere die für die zerebrale Inflammation und Exzitotoxizität typischen spezifischen Proteine ausreichend Potential für weiterführende, tierexperimentell ähnlich gestaltete Untersuchungen. Langfristig könnten hier zusätzliche Tierversuchsmodelle wie z. B. Alterung, Diabetes, Atherosklerose und Hypertension eine weitere Annäherung an humanklinische Verhältnisse ermöglichen.

In Zeiten des demografischen Wandels erfahren Krankheiten wie die Alzheimer-Demenz, als deren größter Risikofaktor das Alter gilt, einen rasanten Anstieg der Patientenzahl. Die Erforschung der zugrundeliegenden neurodegenerativen Mechanismen und das Einbringen daraus gewonnener Erkenntnisse in die Entwicklung von Therapieansätzen oder gar Präventionsmaßnahmen sind daher von gesamtgesellschaftlicher Bedeutung - nicht zuletzt auch unter ökonomischen Gesichtspunkten, wie den gleichsam wachsenden Kosten für das Gesundheitssystem. In der vorliegenden Arbeit wurden neuropathologische Prozesse in verschiedenen transgenen Tauopathie-Mausmodellen mittels hochauflösender Mikroskopietechniken untersucht. Der Schwerpunkt lag hierbei auf der Analyse synaptischer Veränderungen im lebenden Tier, ermöglicht durch die Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie. Zunächst wurden in Tau P301S-Mäusen die Auswirkungen FTDP-17-mutierten humanen Tau-Proteins auf die strukturelle Plastizität neokortikaler dendritischer Spines analysiert. Dabei wurde eine im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen verminderte Spinedichte gemessen, welche auf eine geringere Ausbildung neuer Spines zurückzuführen war. Die verbliebenen Spines zeigten morphologische Veränderungen wie ein vergrößertes Kopfvolumen - möglicher Weise zur Kompensation des Synapsenverlusts. Ergänzend wurde eine Methode zur immunhistochemischen Synapsendichtemessung an Gehirnschnitten etabliert, welche jedoch keine Effekte der Transgenexpression auf die Dichte prä- oder postsynaptischer Spezialisierungen offenbarte. Um die Rolle inflammatorischer Prozesse in Tauopathien zu analysieren, wurde die Mauslinie Tau x CXCR erzeugt. Partielle oder vollständige genetische Fraktalkinrezeptor-Deletion in diesen Mäusen erlaubte eine gezielte Modifizierung der Kommunikation zwischen Neuronen und Mikrogliazellen. Die resultierende Aktivitätserhöhung der Mikrogliazellen hatte wider Erwarten keinen signifikanten Einfluss auf die Dichte Phospho-Tau enthaltender Zellen in den untersuchten kortikalen Gehirnregionen. Zur Modellierung der Alzheimer-Demenz wurden Tau P301S-Mäuse mit der Linie APP PS1 verpaart. Die Nachkommen wiesen Alzheimer-typische histologische Läsionen wie extrazelluläre Aβ-Plaques und intrazelluläre Tau-Ablagerungen auf. Es konnte jedoch im Vergleich zur Ursprungslinie Tau P301S keine Aβ-induzierte Verstärkung der kortikalen Tau-Pathologie gemessen werden, welche die Amyloid-Kaskaden-Hypothese suggeriert. Eine intravitalmikroskopische Analyse dendritischer Spines in Tau P301S- und Tau x APP PS1-Mäusen in unterschiedlichen Krankheitsstadien sowie in Wildtyp-Wurfgeschwistern sollte die Abgrenzung Tau-bedingter von Aβ-bedingten Effekten ermöglichen. Dabei wurden Veränderungen in der strukturellen Plastizität gefunden, beispielsweise in der Spine-Neuausbildung oder in bestimmten morphologischen Fraktionen, nicht aber in der absoluten Spinedichte. Schließlich erfolgte eine elektronenmikroskopische Untersuchung neuritischer Dystrophien in einem weiteren Alzheimer-Mausmodell, der Linie 3xTg-AD. Durch immunhistochemische Markierung konnten sowohl Aβ- als auch Tau-Ansammlungen in den pathologischen Anschwellungen nachgewiesen werden. Die präsentierten Befunde zeigen u. a. die ersten intravitalmikroskopischen Langzeitstudien dendritischer Spines in Mausmodellen mit reiner Tau-Pathologie sowie damit kombinierter Aβ-Pathologie. Sie bieten grundlegende, durch Patientenuntersuchungen nicht zu gewinnende Informationen über krankhafte synaptische Veränderungen, welche als frühe Ereignisse in der Alzheimer-Demenz betrachtet werden.

Ziel der Hauptuntersuchung der vorliegenden Arbeit war die Überprüfung der Hypothese, dass sich beim plötzlichen Kindstod („sudden infant death syndrome“; SIDS) im Vergleich zu alters- und geschlechtsgematchten Kontrollen (d.h. bei Kindern, die innerhalb des ersten Lebensjahres nicht an SIDS verstorben waren), im Kleinhirn veränderte Gesamtzahlen von Purkinjezellen und Granularzellen finden. Hintergrund dieser Hypothese waren (i) Spekulationen in der Literatur über eine mögliche Rolle des Kleinhirns in der Pathogenese von SIDS sowie (ii) wiederholte Berichte in der neuropathologischen Literatur über mögliche Veränderungen der oben genannten Parameter bei SIDS. Diese neuropathologischen Berichte widersprechen sich jedoch gegenseitig teilweise erheblich, d.h. manche dieser Studien berichteten Veränderungen der oben genannten Parameter bei SIDS, andere Studien hingegen nicht. Wichtig ist dabei, dass keine dieser Untersuchungen in der Literatur mit „design-based“ stereologischen Methoden (d.h. dem „state of the art“ der quantitativen Histologie) durchgeführt wurde. Dementsprechend muss unklar bleiben, ob (und wenn ja, in welchem Ausmaß) die beschriebenen Widersprüche in der neuropathologischen Literatur zur Beteiligung des Kleinhirns an der Pathogenese von SIDS auf die verwendeten Methoden zurückzuführen sind. Dies machte eine Neuauswertung der genannten Parameter im Kleinhirn bei SIDS mit design-based stereologischen Methoden notwendig. Darüber hinaus wurde in einer Nebenuntersuchung der Frage nachgegangen, ob im menschlichen Kleinhirn von den Purkinjezellen im ersten Lebensjahr Sonic hedgehog exprimiert wird, dem bei Labortieren (Maus, Ratte, Huhn) bei der Entstehung der inneren Granularzellschicht im Kleinhirn eine zentrale Steuerfunktion zukommt. Die Beantwortung dieser Frage bezog sich auf einen Bericht in der jüngeren Literatur, nach dem dies bei der Entwicklung des menschlichen Kleinhirns anders sein sollte. Für die Hauptuntersuchung wurden insgesamt n=23 Kleinhirnhälften (je eine Kleinhirnhälfte pro Fall) von Kindern untersucht, die im ersten Lebensjahr verstorben waren. Von diesen n=23 Kleinhirnhälften stammten n=9 von SIDS-Fällen (im Alter zwischen zwei und zehn Monaten verstorben), n=9 von alters- und geschlechtsgematchten Kontrollen, sowie n=5 weitere von Kontrollen, die entweder in einem früheren oder einem späteren Alter als die SIDS-Fälle gestorben waren (sowie ein Kind, das im Alter von 8 Monaten gestorben war). Die Nebenuntersuchung erfolgte an insgesamt n=6 Kleinhirnhälften (davon n=4 SIDS-Fälle und n=2 Kontrollen, die im Alter zwischen einem und zehn Monaten gestorben waren). Alle Kleinhirnhälften stammten aus einer Sammlung des Instituts für Rechtsmedizin der Ludwig-Maximilians-Universität München und wurden dort in den Jahren 1999 bis 2001 durch Herrn Univ.Prof. Dr.med. Andreas Büttner (heute: Direktor des Instituts für Rechtsmedizin, Universitätsklinikum Rostock) im Rahmen von Autopsien gesammelt. Die Verwendung dieser Kleinhirnhälften für die vorliegende Arbeit wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Universität Rostock unter der Nummer A2012-0053 genehmigt. Bei der Hauptuntersuchung wurden für jede Kleinhirnhälfte an mit Nissl gefärbten 100 µm dicken parasagittalen Serienschnitten die folgenden Parameter mittels „high-precision design-based stereology“ bestimmt: (i) Volumen der Molekularschicht; (ii) Volumen der inneren Granularzellschicht (einschliesslich der Purkinjezellschicht); (iii) Volumen der weißen Substanz; (iv) Gesamtzahl von Purkinjezellen; (v) Gesamtzahl von Granularzellen (in der inneren Granularzellschicht); und (vi) Anzahl von Granularzellen pro Purkinjezelle. Die Bestimmung der Volumina erfolgte mit dem sogenannten Cavalieri-Prinzip, und die Bestimmung der Gesamtzahlen von Purkinjezellen und Granularzellen mit dem sogenannten „optical fractionator“. Bei der Nebenuntersuchung erfolgte ein immunhistochemischer Nachweis von Sonic hedgehog und Calbindin in den Purkinjezellen. Keiner der beschriebenen Parameter zeigte in der Hauptuntersuchung einen statistisch signifikanten (p

Die Alzheimer-Krankheit (AD), die häufigste Form der Demenz, manifestiert sich klinisch meist ab dem 65. Lebensjahr mit langsam progredienten Gedächtnis-, Orientierungs- und Aufmerksamkeitsstörungen. Neuropathologische Korrelate sind die Amyloid-Plaques, die hauptsächlich aus extrazellulären Aggregaten des β-Amyloid-Proteins (Aβ) zusammengesetzt sind, und intrazelluläre neurofibrilläre Bündel, die aus Aggregaten des mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau bestehen. Der „Auslöser“ der Alzheimer-Krankheit ist das β-Amyloid-Protein (Amyloid-Kaskaden-Hypothese), welches durch proteolytische Prozessierung von βAPP (β-Amyloid-Vorläufer-Protein) entsteht. Dies geschieht, indem zuerst BACE-1 (β-site APP cleaving enzyme 1) und anschließend der γ-Sekretase-Komplex βAPP schneiden. Menschen mit Down-Syndrom (DS), welches die häufigste autosomale Chromosomenaberration darstellt, entwickeln bereits ab einem Alter von 40 Jahren die typischen neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und zeigen mit einem Durchschnittsalter von 56 Jahren die klinischen Symptome der Demenz. Die Gründe für das frühe Auftreten der Amyloid-Plaques sind noch nicht vollständig geklärt. Das Gen für βAPP befindet sich auf dem Chromosom 21, welches im DS dreifach vorhanden ist, und wird daher mit der frühen Plaque-Pathologie im Down-Syndrom in Zusammenhang gebracht. BACE-1 konnte durch Überexpressions- und Knock-out-Experimente eindeutig als alleinige β-Sekretase identifiziert werden. In Gehirnen von Alzheimer-Demenz-Patienten konnten im Vergleich zu Kontrollgehirnen erhöhte BACE-1-Proteinmengen und BACE-1-Aktivitäten nachgewiesen werden. Es war deshalb interessant zu untersuchen, ob auch im Gehirn von Down-Syndrom-Patienten die BACE-1-Proteinexpression erhöht ist. Durch eine Hochregulation von BACE-1 im Down-Syndrom könnte vermehrt βAPP prozessiert und somit Aβ gebildet werden. Daher war es das Ziel der vorliegenden Arbeit die Expression von BACE-1 in Gehirnen (Temporal- und Frontallappen) von DS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgehirnen zu analysieren. In der Western-Blot-Analyse der Gewebeproben konnte gezeigt werden, dass die BACE-1-Proteinmengen im Down-Syndrom im Vergleich zu den Kontrollen (K) 1,4-fach erhöht waren. Die Proteinexpressionen von βAPP zeigten sich im DS im Vergleich zu den Kontrollen 1,4-fach erhöht. Diese Ergebnisse erzielten keine Signifikanz, zeigten aber deutliche Trends im Expressionsverhalten. Dies könnte auf die Anzahl der untersuchten Gehirne (Temporal- und Frontallappen je 3 DS, 4 AD und 5 K), Qualitätsmängel der Gehirnproben oder einer ungleichen Verteilung der Proteinexpression im Gewebe zurückzuführen sein. Es ist daher notwendig mehr Gehirne zu untersuchen. Zudem wäre es interessant in Gehirnschnitten das Verteilungsmuster der BACE-1-Expression im DS genauer zu studieren. Die Ergebnisse deuten jedoch auf eine Hochregulation von BACE-1 im DS-Gehirn und somit auf eine Beteiligung der Protease an der Plaquepathologie des Down-Syndroms hin. BACE-1 scheint also sowohl in der Pathogenese der Alzheimer-Demenz als auch in der des Down-Syndroms eine zentrale Rolle einzunehmen. Daher ist es sehr interessant die Regulation von BACE-1 weiter zu analysieren. Da in p25-überexprimierenden Mäusen erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen gezeigt werden konnten, vermutete man eine Beteiligung von p25 an der Regulation der β-Sekretase. p25, das im Gehirn der AD-Patienten vermehrt gebildet wird und aus der Proteolyse von p35 entsteht, bindet und aktiviert die Kinase cdk5. cdk5 phosphoryliert unter anderem das Tau-Protein und wird daher mit der Bildung der neurofibrillären Bündel in Zusammenhang gebracht. Durch die Hochregulation von BACE-1 könnte p25 in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung eine neue Bedeutung zugeschrieben werden. Zur Analyse der p25 induzierten Veränderungen in den Neuronen wurden humane Neuroblastomazellen mit einem induzierbaren p25-Expressionsvektor, Sp25-Zellen, verwendet. In diesen p25-überexprimierenden Zellen konnten sowohl in der Western-Blot-Analyse als auch in der BACE-1-Aktivitätsmessung erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen bzw. BACE-1-Aktivitäten gezeigt werden. Die Northern-Blot-Analyse der Sp25-Zellen ergab erhöhte BACE-1-mRNA-Spiegel, die sich jedoch in einer für endogene BACE-1-mRNA untypische Größe detektieren ließen. p35, das membrangebundene Vorläufer-Protein von p25, war indes nicht in der Lage die BACE-1-Proteinexpression in humanen Neuroblastomazellen zu erhöhen. Die Ergebnisse der Sp25-Zellen konnten in p25-überexprimierenden murinen Neuroblastomazellen, Np25-Zellen, nicht reproduziert werden. Daher ist es notwendig, den p25-induzierten BACE-1-Regulationsmechanismus auf seine Reproduzierbarkeit, z.B. in weiteren In-vivo-Modellen, zu überprüfen.

Im Verlaufe der zellulären Reifung wandern (migrieren) unreife Nervenzellen von der Germinalschicht in ihre Zielschicht, in der sie nach dem Auswachsen von Dendriten synaptische Verbindungen bilden. Diese Reifungsprozesse gehen mit Anstiegen der intrazellulären Kalziumkonzentration, sogenannten Kalziumsignalen, einher. Während die Neurotransmitter GABA und Glyzin Nervenzellen des adulten Gehirns hyperpolarisieren und dadurch Aktivität hemmen, depolarisieren sie paradoxerweise unreife Nervenzellen und rufen dadurch Kalziumsignale hervor. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rolle und der Mechanismus dieser Signale während der Nervenzellreifung mit Hilfe hochauflösender Kalzium- und Chloridfluoreszenzmessungen in Gehirnschnitten und in Zebrafischlarven untersucht. Es zeigte sich, dass GABA im Kleinhirn robuste Kalziumsignale sowohl in Körnerzellen während und nach Vollendung der Migration als auch in Purkinjezellen in einer Phase starken dendritischen Wachstums und ausgeprägter Synapsenbildung hervorruft. Als Mechanismus konnte in unreifen Nervenzellen ein Chloridausstrom identifiziert werden, der zu einer Depolarisation mit nachfolgender Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle führt. Im Gegensatz dazu ruft GABA in reifen Nervenzellen einen Chlorideinstrom und dadurch eine Hemmung von Aktivität durch eine Hyperpolarisation der Zellmembran hervor. Neben der Untersuchung in Gehirnschnitten gelang in der vorliegenden Arbeit erstmals der Nachweis GABA-vermittelter Kalziumsignale in intakten Lebewesen. Dabei evozierten GABA und Glyzin Kalziumsignale in Rückenmarksneuronen von Zebrafischlarven zu einem Zeitpunkt, zu dem sie die ersten koordinierten Schwimmbewegungen vollzogen. Insgesamt zeigte sich, dass GABA, im Gegensatz zu seiner hemmenden Wirkung im adulten Gehirn, in unreifen Nervenzellen, die sich in einer Phase dramatischer morphologischer und funktioneller Veränderungen befinden, Kalziumsignale hervorruft. In Anbetracht der Bedeutung von Kalziumsignalen für die Reifung des Gehirns sprechen diese Ergebnisse für eine Rolle von GABA als trophischer Faktor.