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Ziel der vorliegenden Studie ist es, den Einfluss von 17β-Östradiol und/oder Progesteron auf die neurologische Funktion in vivo sowie auf die neuronale Morphologie und auf molekulare Aspekte der zerebralen Inflammation und Exzitotoxizität in vitro im Zeitraum von 4 Tagen nach herzchirurgisch typischer extrakorporaler Zirkulation (EKZ) mit 45 min tief hypothermem Kreislaufstillstand („deep hypothermic circulatory arrest“, DHCA) in einem Versuchsmodell an der Ratte zu untersuchen. 100 weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden in 5 Versuchsgruppen (n = 20) randomisiert: Eine Gruppe wurde scheinkastriert (Gruppe „Intakt“); die 4 weiteren Gruppen wurden kastriert und je nach Gruppenzugehörigkeit mit einem subkutanen Hormonimplantat versehen: Plazebo (Gruppe „Plazebo“), 17β-Östradiol (Gruppe „Östrogen“), Progesteron (Gruppe „Progesteron“) sowie 17β-Östradiol- und Progesteron (Gruppe „Progesteron + Östrogen“, „P+Ö“). 4 Wochen nach Kastration/Scheinkastration und gegebenenfalls nach Hormon-/Plazebo-Supplementierung wurden die Tiere mit Isofluran (2,0 – 2,5 Vol% in 40 % O2) anästhesiert, intubiert, katheterisiert, mithilfe der EKZ über 30 min auf 16 °C rektale Körpertemperatur abgekühlt und der DHCA wurde für einen Zeitraum von 45 min durchgeführt. Anschließend wurden die Tiere mittels EKZ über 40 min auf 35,5 °C rektale Körpertemperatur wiedererwärmt, die EKZ beendet, die Tiere 1 Stunde nachbeatmet und eine Telemetrie-Transmittersonde intraperitoneal eingesetzt, bevor die Anästhesie beendet, und die Tiere bei Einsetzen der Spontanatmung extubiert wurden. Die postoperative telemetrische Überwachung umfasste Körpertemperatur und Herzfrequenz, letztere gekoppelt mit einem Alarmsystem, um Tiere bei Bedarf (Herzfrequenz < 150 Schläge/min) rechtzeitig euthanasieren zu können. Alle Tiere wurden am präoperativen Tag 1 (Tag –1) neurologisch untersucht sowie an den postoperativen Tagen 1, 2, 3 und 4, sofern sie überlebt haben. Am postoperativen Tag 4 wurden die Tiere in tiefer Isoflurannarkose zur Blut- und Serum-Gewinnung entblutet sowie deren Gehirne entnommen und tiefgefroren (–80 °C). In Hämatoxylin-Eosin (HE-) gefärbten Gehirnschnitten wurde die Anzahl intakter und geschädigter Neurone lichtmikroskopisch in den Bereichen Striatum (Bregma –0,3 mm), Kortex und Hippokampus (Bregma –3,3 mm) ermittelt. Die TNFα-Konzentration im Serum der Tiere wurde mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay bestimmt. Die zerebrale Expression von Östrogenrezeptor α (ERα), von Östrogenrezeptor β (ERβ), von „Excitatory Amino Acid Transporter 1“ (EAAT1), von „Glutamat Transporter 1b“ (GLT-1b), von „CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 2“, (CXCR2), von Interleukin-8 (IL-8) und von induzierbarer Stickoxid Synthase (iNOS) erfolgte mit dem Western-Blot-Verfahren. Die durchgeführten Auswertungen erfolgten für eine nach spezifischen Kriterien getroffene Auswahl von jeweils 5 überlebenden Tieren und 5 euthanasierten Tieren pro Versuchsgruppe. Die statistische Datenanalyse wurde mithilfe allgemeiner linearer Modelle mit post-hoc einfaktorieller Varianzanalyse und Bonferroni-t-Tests bzw. Kruskal-Wallis und post-hoc Mann-Whitney U (p < 0,05) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen keine Versuchsgruppen-spezifischen Unterschiede bei den intra- und postoperativen physiologischen Parametern. Die Serumkonzentrationen von TNFα, die Gehirnmorphologie und die neurologische Funktion zeigten sich vom Versuchsansatz unbeeinflusst. Beim Nachweis der Expression von Rezeptor-, Transporter- und Entzündungsproteinen im Gehirngewebe mittels Western-Blot-Verfahren zeigten sich bei einigen Proteinen Versuchsgruppen-spezifische Unterschiede: Die vorzeitig euthanasierten Tiere der Gruppe „Plazebo“ zeigten eine niedrigere Expression von ERβ als die überlebenden Tiere dieser Gruppe und als die ebenfalls vorzeitig euthanasierten Gruppen „Östrogen“ und „P+Ö“. Des Weiteren exprimierten die überlebenden Tiere der Gruppe „P+Ö“ signifikant mehr EAAT1 im Gehirn als die vorzeitig euthanasierten Tiere dieser Gruppe und auch als die überlebenden Tiere der „Plazebo“-Gruppe. Zusätzlich zeigte sich, dass physiologische hormonelle Schwankungen im Rahmen des Zyklusgeschehens bei der gemeinsamen Wirkung von 17β-Östradiol und Progesteron (Gruppe „Intakt“) im Rahmen der postoperativen zerebralen Inflammation sowohl vorteilhaft (reduzierte iNOS-Expression) als auch von Nachteil (erhöhte IL-8-Expression) gegenüber einer Substituion dieser beiden Hormone (Gruppe „P+Ö“) sein können. Zusammenfassend gesehen bieten aus der Vielzahl der untersuchten Parameter und Faktoren insbesondere die für die zerebrale Inflammation und Exzitotoxizität typischen spezifischen Proteine ausreichend Potential für weiterführende, tierexperimentell ähnlich gestaltete Untersuchungen. Langfristig könnten hier zusätzliche Tierversuchsmodelle wie z. B. Alterung, Diabetes, Atherosklerose und Hypertension eine weitere Annäherung an humanklinische Verhältnisse ermöglichen.

Bandscheibenbedingte Rückenschmerzen stellen eine Gesundheitsstörung von herausragender Bedeutung dar. Innovative Therapiekonzepte sind darauf ausgerichtet, schmerzhaft degenerierte Bandscheiben in ihren natürlichen Strukturen zu regenerieren. Allein durch den chirurgischen Eingriff zur Anwendung dieser Therapiekonzepte wird jedoch die mechanische Kompetenz der Bandscheibe empfindlich gestört. Derzeit ist nicht bekannt, ob neue Nukleusersatzmaterialien für Tissue engineering Strategien an der Bandscheibe diesen Verlust kompensieren können. Daher war es das Ziel der Dissertation in einem kombinierten experimentellen Versuchsansatz aus In-vivo-, Ex-vivo-, In-vitro- und In-silico- Untersuchungen, neu entwickelte Hydrogele als Nukleusersatz im Tiermodell Schaf zu untersuchen und das Schaf als Tiermodell im Bereich der Bandscheibenforschung näher zu charakterisieren. Um ein physiologisches Lastprotokoll für die In-vitro-Untersuchungen zu etablieren, wurde an drei Schafen der intradiskale Druck (IDP) über je 24 Stunden gemessen. Der gesamte Datenpool des ersten Schafes wurde in eine Aktivitäts- und Erholungsphase unterteilt und ex vivo aus den IDP-Durchschnittswerten beider Phasen die entsprechenden axialen Kompressionskräfte abgeleitet. In vitro wurde ein Kriech-Relaxations-Test an 36 ovinen lumbalen Bewegungssegmenten durchgeführt. Die Segmente wurden drei Belastungszyklen ausgesetzt, die jeweils aus einer 15-minütigen Belastungsphase (130 N) und einer 30-minütigen Erholungsphase (58 N) bestanden. IDP-Verlauf und Höhenverlust der Segmente wurden in sechs verschiedenen Versuchsgruppen untersucht: (i) INTAKT; (ii) DEF-AN: Eine schräge Anulusinzision. Der Defekt wurde durch Naht und Cyanoacrylatkleber verschlossen. (iii) DEF-NUKn+k: Nukleusgewebe wurde entfernt und anschließend reimplantiert. Der Anulusverschluss erfolgte wie in DEF-AN. (iv) DEF-NUKp: Entsprechend dem Vorgehen in Testgruppe DEF-NUKn+k wurde der Nukleus entfernt und reimplantiert. Um eine Volumenverdrängung reimplantierten Gewebes in den inneren Anulusdefekt zu vermeiden, erfolgte der Verschluss mittels eines Plugs. Abschließend wurden zwei Hydrogele als Nukleusersatz untersucht: (v) DDAHA und (vi) iGG-MA. Zur besseren Interpretation der In-vitro-Ergebnisse wurden Finite-Elemente-Analysen an einem Bandscheibenmodell durchgeführt. In vivo lag der Bandscheibendruck beim Schaf nahezu konstant höher als beim Menschen. Niedrigste Druckwerte wurden intraoperativ mit ~0,5 MPa ermittelt. Höchste Druckwerte wurden für Aufstehen oder Drehen mit 3,6 bzw. 2,6 MPa gemessen und waren damit ungefähr zwei- bis viermal höher in der ovinen Bandscheibe. Die IDP-Mittelwerte der Aktivitäts- und Erholungsphasen des ersten Schafes lagen bei ~0,75 bzw. ~0,5 MPa, welche axialen Kompressionskräften von 130 bzw. 58 N entsprachen. Im Kriech-Relaxations-Test hatte ein isolierter Anulusdefekt (DEF-AN) keinen Einfluss auf Höhenverlust und IDP der Segmente. DEF-NUKn+k, DEF-NUKp, DDAHA und iGG-MA hingegen steigerten den Höhenverlust und verringerten signifikant den IDP im Vergleich zu INTAKT. Die Modellvorhersagen belegten erhebliche Auswirkungen eines reduzierten Wassergehalts, Kompressionsmoduls und osmotischen Potentials des reimplantierten Gewebes auf den Höhenverlust und IDP des Segmentes. Die Lastübertragung innerhalb der Bandscheibe veränderte sich hierdurch deutlich und ging mit einer erhöhten Belastung des Anulus einher. Die vergleichsweise hohen Bandscheibendrücke des Schafes stehen der weit verbreiteten Meinung gegenüber, dass aufgrund der horizontal ausgerichteten Wirbelsäule des Vierbeiners, intradiskale Lasten geringer sein müssten als beim Menschen. In Kenntnis der vorliegenden Untersuchungen sollte die Rechtfertigung bzw. der Ausschluss des Schafes als Modell im Bereich der Wirbelsäule nicht auf Unterschieden im Gang begründet werden, sondern auf mechanischen Überlegungen bzgl. künftiger Einsatzgebiete. Die In-vitro-Ergebnisse zeigen, dass der Erfolg von Hydrogelen als Nukleusersatz nicht nur vom Ersatzmaterial selbst abhängt, sondern auch von der Wiederherstellung zerstörter Bandscheibenstrukturen, wie der Grenzflächen zwischen Nukleus und Umgebung sowie dem gesetzten Anulusdefekt. Die vorliegende Dissertation konnte die Bedeutung iatrogen induzierter struktureller Schädigungen der Bandscheibe für Nukleusersatzstrategien herausarbeiten und stellt somit wesentliche Anforderungskriterien an das zukünftige Designkonzept von Hydrogelen als Nukleusersatz für Tissue engineering Strategien an der Bandscheibe. Hydrogele, die allein das mechanische Verhalten des Nukleus imitieren, können ansonsten bei der Wiederherstellung der Mechanik des Gesamtsegmentes versagen.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine vergleichende Untersuchung der Polymerase Kettenreaktion und der Southern Blot Analyse beim Nachweis der bcl-2 Translokation bei Patienten mit centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen durchgeführt. Erstes Ziel der war die Ermittlung der Häufigkeit der bcl-2 Translokation t(14;18) im Bereich der MBR im Knochenmark bei einer Gruppe von Patienten mit centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen im Einzugsgebiet des Tumorzentrums München. Zweites Ziel war die Untersuchung der Sensitivität und Spezifität der Southern Blot Analyse und der Polymerase Kettenreaktion im Nachweis der t(14;18) Translokation als Indikator für Organbefall im Vergleich mit der histologischen, cytologischen und immuncytologischen Untersuchung des Knochenmarks oder des peripheren Blutes. Drittes Ziel war die Untersuchung der Frage, inwieweit die Polymerase Kettenreaktion bzw. die Southern Blot Analyse zur Verlaufsbeobachtung bei centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen geeignet ist und ob sich Patienten mit oder ohne eine nachgewiesene bcl-2 Translokation bezüglich Allgemeinbefinden nach WHO-Einteilung und des klinischen Krankheitsstadiums unterscheiden. Die Southern Blot Analyse ist eine sensitive, jedoch zeit- und kostenintensive Methode zum Nachweis der bcl-2 Translokation t(14;18). Allein der Schritt der Autoradiographie der Röntgenfilme kann über 7-14 Tage dauern. Daher ist die SBA weniger für Routinediagnostik geeignet. Es wird eine Mindestmenge von 10 µg DNS pro Restriktionsenzym-Verdauprozess, in der Regel 30 µg DNS benötigt, die nicht bei jeder Patientenprobe zur Verfügung steht. Störfaktoren können unter anderem ein unvollständiger Enzymverdau durch Restriktionsenzyme, Verunreinigung der DNS durch Proteine und Salze, Strangbrüche der DNS bei zu langem Enzymverdau oder nach erfolgter Chemotherapie sein. In unserer Untersuchungsgruppe konnte nur bei 17 von 35 Patienten die Southern Blot Analyse genomischer DNS erfolgreich durchgeführt werden; bei einem von 35 Patienten konnte das Ergebnis der SBA nicht beurteilt werden. Die SBA kann die bcl-2 Translokation t(14;18) unabhängig von der Bruchpunktregion nachweisen. Bei 3 von 17 Patientenproben (17.6%) mit negativer PCR gelang ein Nachweis der Translokation t(14;18) in der SBA. Durch die SBA wurde in der vorliegenden Arbeit bei fehlendem Hinweis auf einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie eine deutlich niedrigere Detektionsrate an Zellen mit der Translokation t(14;18) erreicht als mit der PCR (SBA 25.0% versus PCR 66.7%). Die Polymerase Kettenreaktion kann eine maligne Zelle unter 106 Zellen detektieren. Die Methode ist schnell und kostengünstig. In unserem Versuchsansatz lag das Ergebnis im Durchschnitt innerhalb eines Tages vor. Bei allen der untersuchten 35 Patientenproben konnte die PCR erfolgreich durchgeführt werden. Zur Steigerung der Sensitivität und Spezifität der Polymerase Kettenreaktion ist eine Southern Blot Analyse der PCR Amplifikate zu empfehlen, da in der vorliegenden Arbeit bei 6 von 35 Patienten (17.1%), bei denen in der Gelelektrophorese der PCR Amplifikate keine Bande detektierbar war, in der Southern Blot Analyse der PCR Produkte eine Bande dargestellt werden konnte. Die Ermittlung der optimalen Versuchsbedingungen für die individuellen Laborgeräte und Materialien ist unabdingbar. Unter anderem kann die Änderung von Anlagerungstemperatur, MgCl2-Konzentration, DNS-Menge, Konzentration der Nukleotide, Art des Verdunstungsschutzfilms, Konzentration des Agarosegels, Betriebsart des Thermocycler-Gerätes eine Störquelle bilden und zum Teil hohen Zeit- und Kostenaufwand bis zur Optimierung der Versuchsbedingungen erfordern. Da in unserem Patientengut keine cytogenetische Untersuchung durchgeführt wurde, die eine Translokation t(14;18) nachweist, sondern nur Untersuchungen auf einen Befall mit malignen Lymphomzellen im Blut oder Knochenmark (Cytologie, Immuncytologie, Knochenmarkhistologie), die nicht obligat die Translokation t(14;18) tragen, fehlte uns ein Referenzwert zur Untersuchung der Sensitivität und Spezifität der Polymerase Kettenreaktion und der Southern Blot Analyse. Bei 17 von 35 Patientenproben, bei denen die SBA nicht durchgeführt werden konnte waren 11 (31.4%) in der PCR positiv. Bei 3 von 17 (17.6%) Patientenproben, bei denen die SBA positiv ausfiel war die PCR negativ. Bei 5 von 17 (29.4%) Patientenproben, bei denen die SBA negativ ausfiel war die PCR positiv. Sowohl die Southern Blot Analyse als auch die Polymerase Kettenreaktion haben ihre Grenzen der Sensitivität und Spezifität im Nachweis der Translokation t(14;18). Bei 29.4% der PCR positiven Patientenproben entging der SBA der Nachweis, bei 17.6% der SBA positiven Patientenproben entging der PCR der Nachweis. Beide Methoden sollten daher zum Nachweis der bcl-2 Translokation kombiniert angewendet werden. Die Häufigkeit der bcl-2 Translokation in unserer Untersuchungsgruppe mit 35 Patienten im Einzugsgebiet des Tumorzentrums München ist mit 77.1% für die kombinierte Anwendung von PCR und SBA vergleichbar mit der Häufigkeit, die in der Literatur für Patientengruppen in den USA, in Großbritannien und in den Niederlanden angegeben wird. Die bcl-2 Translokation konnte mit der Southern Blot Analyse bei 58.8%, mit der Polymerase Kettenreaktion bei 68.6% der Patienten nachgewiesen werden. Wurden beide Methoden kombiniert, betrug die Nachweisquote 77.1%. Bei 82.9% der Patienten konnte ein peripherer Befall mit Lymphomzellen durch Kombination der morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie oder Immuncytologie nachgewiesen werden, dagegen bei 47.1% durch die Histologie allein. Daher sollten die Histologie, Cytologie und Immuncytologie zum Nachweis eines peripheren Befalls kombiniert eingesetzt werden. Die Detektionsrate der Southern Blot Analyse und der Polymerase Kettenreaktion ist annähernd gleich bei vorliegendem Hinweis auf einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie (SBA 64.3% versus PCR 69.0%). Durch die Southern Blot Analyse wird bei fehlendem Hinweis auf einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie eine deutlich niedrigere Detektionsrate an Zellen mit der Translokation t(14;18) erreicht als mit der Polymerase Kettenreaktion (SBA 25.0% versus PCR 66.7%). Bei fehlendem morphologischem Nachweis eines peripheren Befalls eignet sich die PCR zum Nachweis der bcl-2 Translokation deutlich besser als die SBA. Unter den Patienten mit Nachweis eines Knochenmarksbefalls mit Zellen mit der bcl-2 Translokation waren 3 Pat. mit klinischer kompletter Remission, 4 Pat. im klinischen Stadium I A oder I B, 4 Pat. im klinischen Stadium II A oder II B. Würde die bcl-2 Translokation t(14;18) als typisch für die malignen Lymphomzellen angesehen, müsste die Heraufstufung in das Stadium IV erfolgen. Patienten aus unserer Untersuchungsgruppe mit Nachweis einer bcl-2 Translokation mit der Southern Blot Analyse bzw. der Polymerase Kettenreaktion zeigten keinen auffallenden Unterschied im klinischen Verlauf des CB-CC oder CB Non-Hodgkin Lymphoms im Vergleich zu Patienten ohne Nachweis einer bcl-2 Translokation. Die Ergebnisse sind jedoch aufgrund der großen Varianz der klinischen Verlaufsbeobachtungsdauer und der uneinheitlichen Therapie bei den untersuchten Patienten nur eingeschränkt auswertbar.

10-15% der de novo akuten myeloischen Leukämie (AML) zeigen einen komplex aberranten Karyotyp, der definitionsgemäß mindesten 3 numerische und/oder strukturelle Veränderungen pro Karyotyp beinhaltet. Patienten mit diesem Karyotyp weisen eine besonders ungünstige Prognose auf. Über die Pathogenese bei dieser Subgruppe ist bisher nur wenig bekannt. Ziel dieser Studie war das Aberrationsmuster bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp detaillierter zu charakterisieren. Hierzu wurden 44 AML-Patienten, die in der Routinediagnostik nach der klassischen Zytogenetik (G-Banden Analyse), der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und der 24-Farben-FISH (M-FISH) einen komplex aberranten Karyotyp zeigten, zusätzlich mit der Comparativen Genomischen Hybridisierung (CGH) untersucht. Diese auf der in situ Hybridisierung basierende Methode ermöglicht es, einen Überblick über Verluste und Vermehrungen des genetischen Materials in einem Versuchsansatz zu erhalten und diese den einzelnen Chromosomen auf Bandenebene zu zuordnen. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zeigen, dass bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp besonders Verluste, die durch strukturelle Aberrationen entstanden, häufiger auftreten wie Zugewinne von genetischem Material. Deletionen lagen besonders häufig in den Bereichen 5q (91%), 7q (59%) und 17p (61%), während nur 2% der Patienten keine Veränderung in mindestens einer dieser drei Regionen zeigte. Weiterhin konnten Verluste den Chromsomen 12p, 13q, 16q, 18q zugeordnet werden. Zugewinne lagen besonders in den Chromosomen 8q und 11q. Mit CGH war es zusätzlich möglich bei 6 Patienten Amplifikationen in 11q zu detektieren. Das Aberrationsmuster der AML mit komplex aberrantem Karyotyp konnte mittels CGH genauer beschrieben werden. Die erhobenen Daten lassen eine genauere Definition der AML mit komplex aberranten Karyotyp als eigene Entität sinnvoll erscheinen. Diese beinhaltet das Fehlen einer spezifischen, primär balancierte Aberration, das Vorkommen von mindesten 5 Aberrationen pro Karyotyp und das Vorhandensein einer Deletion in mindestens einer der chromosomalen Banden 5q31, 7q31 und 17p13. Insgesamt konnten Verluste 7 bestimmten Chromosomenbereichen und Zugewinne 2 bestimmten Chromosomenregionen genauer zugeordnet werden. Diese Eingrenzung der involvierten Chromosomenbereiche bei dieser AML-Subgruppe dient der Suche nach relevanten Tumorsuppressor- und Onkogenen. Als weiterer Pathomechanismus scheint der Gendosiseffekt eine besondere Rolle bei der AML mit komplex aberranten Karyotyp zu spielen, da Amplifikationen nur in dieser Subgruppe nachgewiesen wurden. Insgesamt scheint besonders die Komplexität unterschiedlicher Rearrangements und weniger eine spezifische Aberration für die so ungünstige Prognose verantwortlich zu sein.

Hintergrund: Der Ischämie-Reperfusionsschaden ist ein unspezifischer, Antigen unabhängiger pathophysiologischer Prozess, welcher bedeutenden Einfluß auf das Überleben transplantierter Organe hat. Antithymozyten-Globuline (ATGs) werden als Immunsuppressiva in der Therapie akuter Abstoßungsepisoden und zur Unterdrückung der Graft vs Host Disease sowie hämatologischer Funktionsstörungen eingesetzt. ATGs führen zu Apoptose und Komplement vermitteltem Zelltod, wobei die direkte Bindung an Adhäsionsmoleküle die Leukozyten-Adhäsion hemmt. Wir haben mittels Zytologie, Histologie und Immunhistochemie den Einfluß dreier verschiedener ATGs auf die Mikrozirkulation sowie die unterschiedlichen Zellsubpopulationen nach Ischämie/Reperfusion untersucht. Material und Methoden: Arterie und Vene der Extremitäten von Affen (M. fascicularis) wurden isoliert, mit 4 C° kalter Ringer-Laktatlösung gespült und nach einer Ischämiezeit von einer bzw. zwei Stunden über die femorale bzw. brachiale Arterie mit Blutgruppen-kompatiblen Humanblut reperfundiert. Dem mit Krebs-Henseleit-Puffer auf einen Hämatokrit von 30% verdünntem Blut wurden ATGs 20 Minuten vor der Reperfusion zugefügt. Die Perfusion wurde mit Hilfe eines Perfusionssystems rezirkulierend durchgeführt. Die Extremitäten (n=60) wurden entsprechend dem Versuchsansatz vier verschiedenen Gruppen zugeteilt: Biotest-ATG Gruppe (n=16), Fresenius-ATG Gruppe (n=16), Merieux-ATG Gruppe (n=12) und eine Kontroll-Gruppe (ohne ATG; n=16). Während der Perfusion wurde die Mikrozirkulation der perfundierten Muskulatur mittels Intravital-Mikroskopie untersucht. Neben der Bestimmung hämatologischer Parameter, wurden die Anzahl der Rot Blutzellen (RBZ), weiß Blutzellen (WBK), Thrombozyten sowie die Hämatokrit- und Hämoglobinspiegel im Perfusat zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Zytologische Untersuchungen und zyto-immunologisches Monitoring (CIM) wurde in Blutproben, welche zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0,1,5,10,15,30,45,60 Min.) abgenommen wurden, durchgeführt. Nach den Versuchen wurden Biopsien von Muskelgewebe entnommen. Histologische und immunhistologische Techniken wurden angewandt, um den Einfluß der ATGs auf die Integrität des Gewebes und die Infiltration der weißen Blutzellen (WBZ) im vaskulären, perivaskulären und muskulären Gewebe semi-quantitativ zu analysieren. Ergebnisse und Folgerungen: • Die hämatologische Untersuchung ergab eine signifikante Reduktion der zirkulierenden WBZ in den behandelten Gruppen im Vergleich zu der Kontrolle. Die Anzahl der RBZ, sowie der Hämatokrit und der Hämoglobinspiegel waren im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht. • Die Anzahl zirkulierender Thrombozyten in den ATG-Biotest und Merieux-ATG Gruppen war im Vergleich zu Fresenius ATG Gruppe und Kontrolle signifikant reduziert. • Die zytologische Untersuchung sowie das CIM zeigten signifikante Unterschiede hinsichtlich der Lymphzytotoxizität und der Depletion peripherer Lymphozyten in den ATG Gruppen im Vergleich zur Kontrolle. • Die histologische und immunhistochemische Analyse ergab eine reduzierte vaskuläre und perivaskuläre Infiltration, sowie eine Verminderung der Inflammation des muskulären Gewebes nach Behandlung mit ATG. • Die Expression von IL-4 war in den ATG Gruppen signifikant niedriger als in der Kontrolle.

Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand in der Etablierung einer dissoziierten Kultur mesencephaler Vorläuferzellen der Ratte und deren nicht-virale Modifikation mittels kationischer Lipide. In Vorversuchen wurden Faktoren zur Optimierung nicht-viraler Transfektionsverfahren ermittelt. Zur Untersuchung des Einflusses der Zellproliferation auf die Transfektionseffizienz, wurden LAN-5 Neuroblastomzellen in zwei Ansätzen mit unterschiedlichem mitotischen Index mittels Effectene (Qiagen, Hilden) transfiziert. Es konnte gezeigt werden, dass proliferierende LAN-5 Zellen fast 15-fach höhere Transfektionsraten bei der Transfektion mit Effectene erzielen. In dem selben Versuchsansatz wurde die Transfektionsrate des klonierten RSV-GFP, basierend auf dem pRep7-Konstrukt, mit der des bereits bekannten CMV-GFP Plasmids verglichen. Im Gegensatz zu den Erwartungen wurden mit dem pRep7-Konstrukt deutlich niedrigere Effizienzen beobachtet. Das VM-Gewebe wurde in dissoziierten in vitro Kulturen gemäß den Protokollen von Studer und Kollegen (1998) kultiviert. Durch Gabe von bFGF wurden die neuronalen Vorläuferzellen zunächst expandiert, und erst durch Entzug von bFGF und Zugabe von fetalem Kälber Serum setzte die Differenzierung ein. Dies konnte mit immunhistochemischen Markern nachgewiesen werden. Da die Protokolle zur Transfektion von organotypischen VM-Kulturen mit Effectene zu toxisch für dissoziierte Vorläuferzellen waren, musste die eingesetzte Menge an Effectene (Qiagen, Hilden) um das 10-fache reduziert werden. Im Vergleich zu Effectene, erzielten die getesteten Versuchslipide (Qiagen, Hilden) bis zu 31-mal höhere Transfektionseffizienzen. Die immunhistochemische Charakterisierung der transfizierten Zellen belegte die Transfektion TH-positiver Neurone. Durch die vorgelegte Arbeit konnten Methoden zur genetischen Modifikation primären mesencephalen Gewebes etabliert werden, die auf chemisch genau definierten Lipid-Komponenten beruhen und die nicht mit den Risiken viraler Vektorsysteme behaftet sind. Durch den effizienten Einsatz Lipid-vermittelten Gentransfers entstehen damit neue Perspektiven für einen möglichen Einsatz nicht-viraler Transfektionsverfahren in ex vivo Gentherapie-Ansätzen.