Podcasts about polymerase kettenreaktion

Der momentan verfügbare Test auf eine Infektion mit dem neuartigen Coronavirus SARS-CoV-2 basiert auf der Polymerase-Kettenreaktion. Obwohl diese Methode sehr präzise funktioniert, können nur frisch infizierte Menschen damit getestet werden. Menschen in einer späteren Phase der Infektion oder bereits geheilte Menschen erfasst der Test hingegen nicht. Um dennoch die Ausbreitung des Virus innerhalb der Bevölkerung nachvollziehen zu können, sind sogenannte Antikörpertests nötig.

In dieser Studie wurden mikrobiologische und molekularbiologische Untersuchungsergebnisse von Pferden mit Verdacht auf eine systemische Infektion gegenübergestellt. Als mikrobiologische Methode wurde die als Goldstandard geltende Blutkultur verwendet, als molekularbiologische Methode eine Multiplex-end-point-Polymerase-Kettenreaktion. Außer dem Vergleich der Methoden sollte innerhalb dieser Studie auch die Praktikabilität der PCR im Praxis- und Klinikalltag bewertet werden. Wenn möglich, wurden parallel zu den Blutproben sogenannte Sekundärproben entnommen. Als Sekundärprobe wurde Probematerial eines potentiellen Infektionsherdes definiert. Wie bei den Blutproben wurde auch bei den Sekundärproben eine PCR durchgeführt. Die bedeutendsten Vorteile der PCR gegenüber der Blutkultur liegen bei der enormen Zeitersparnis von mehreren Stunden im Vergleich zu Tagen und bei einer besseren Korrelation zu den klinischen Symptomen. Außerdem wurde gezeigt, dass eine antibiotische Vorbehandlung nur geringe Auswirkungen auf das Ergebnis einer PCR-Untersuchung hat. Im Gegensatz dazu wurde in der Blutkultur aufgrund der durch die Vorbehandlung, geschwächten Erreger nur ein sehr langsames oder gar kein Wachstum festgestellt. Die Positivraten der beiden Methoden unterschieden sich signifikant. Mit PCR untersuchte Blutproben wiesen eine Positivrate von 49,5 % auf, Blutkulturen zeigten hingegen nur bei 23,8 % ein Wachstum. Die positiven Ergebnisse der Blutkulturen wurden meist als Hautkeime identifiziert. Im Gegensatz dazu wurden mit Hilfe der PCR oft pathogene Keime detektiert, welche mit dem klinischen Bild des jeweiligen Pferdes assoziiert werden konnten. Die Ergebnisse dieser Studie lassen den Schluss zu, dass die molekulardiagnostische PCR eine geeignete Methode für die Sepsisdiagnostik darstellt. Vor allem in Kombination mit Sekundärproben könnte sie bei vergleichbarem Arbeitsaufwand bei Fieberpatienten unspezifischer Herkunft und in der Fohlenmedizin eingesetzt werden.

Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine kumulative Doktorarbeit, die zwei Studien umfasst. Ziel der Arbeit war die Untersuchung der Aussagekraft des Nachweises von felinem Coronavirus (FCoV) mit Hilfe einer real-time Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) in verschiedenen Körperflüssigkeiten zur Diagnose der felinen infektiösen Peritonitis (FIP). Im ersten Teil der Arbeit wurde die real-time RT-PCR für den Nachweis von FCoV in mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC), in Serum und Erguss verwendet. Im zweiten Teil wurde die gleiche Methode aus Liquor von Katzen mit und ohne neurologischen und/oder ophthalmologischen Symptomen durchgeführt. Die Studien verwendeten Katzen mit definitiv diagnostizierter FIP. Die Diagnose wurde entweder mittels histopathologischer Untersuchung oder mittels Immunfluoreszenznachweis von Virusantigen in Makrophagen im Erguss gestellt. In die Kontrollgruppe wurden Katzen eingeschlossen, die FIP-ähnliche klinische Symptome zeigten, bei welchen aber eine andere Krankheit definitiv diagnostiziert wurde. Alternativ lebten die Katzen länger als ein Jahr nach Probenentnahme. Die Arbeit ermittelte eine Sensitivität von 29 % in PBMC, 15 % in Serum und 89 % im Erguss. Die Sensitivität im Liquor lag unter Einbeziehung aller Katzen bei 42 %, bei Katzen mit neurologischen und/oder ophthalmologischen Symptomen bei 80 %. Die Spezifität der RT-PCR in allen Proben betrug 100 %. Die Ergebnisse zeigen, dass die real-time RT-PCR eine verlässliche Bestätigungsmethode in der Diagnose der FIP darstellt. Die Sensitivität der real-time RT-PCR war in dieser Arbeit in PBMC und im Serum niedrig. Im Erguss und im Liquor von Katzen mit neurologischen und/oder ophthalmologischen Symptomen war die Sensitivität ausreichend hoch. Daher ist anhand der hier vorliegenden Daten zu empfehlen, Ergussmaterial für den Nachweis von FCoV zu nutzen. Sollte kein Erguss vorhanden sein, ist eine Verwendung von zellhaltigen Blutproben zur Untersuchung anzuraten. Bei Katzen mit neurologischen und/oder ophthalmologischen Symptomen kann Liquor verwendet werden. Bei Katzen ohne neurologische Beteiligung ist dies aufgrund der aufwändigen Gewinnung von Liquor und der vielen falsch-negativen Ergebnisse nicht zu empfehlen.

Sat, 18 Jul 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18595/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18595/1/Schulz_Catharina.pdf Schulz, Catharina

Hemogregarines are protozoan blood parasites, belonging to the phylum Apicomplexa. They have a life cycle which includes two or three hosts. The merogony and gamogony takes place in the reptile host and the sporogony takes place in an invertebrate host. Therefore reptiles always represent intermediate hosts, while invertebrates act as definitive hosts. In reptiles, the genera Haemogregarina, Hepatozoon, Karyolysus and Hemolivia have been described including about 400 different species in reptiles. Most of the genera and species have been described based only on morphological characteristics and the reptilian host species. However, usefulness of these features for genus or species diagnosis is currently under debate. The parasite stages that are located in the erythrocytes of reptiles can, however, very often not be distinguished by their morphology. In the present study, therefore, a molecular biological approach was chosen to distinguish the hemogregarines from blood samples of reptiles, which were recently imported to Germany. Blood samples, which had been previously found to contain hemogregarines by microscopical investigation, were included in the investigation. As a target sequence the 18S rRNA gene was chosen. Using three different primer pairs HEMO1/HEMO2 (Perkins and Keller, 2001), HepF300/Hep900 (Ujvari et al., 2004) and A mod / 18AP1488.R (Medlin et al., 1988; Wozniak et al., 1994). PCR amplification was performed and phylogenetic analyses were based on the sequences obtained directly from the PCR amplification products. Blood samples from 13 ball pythons (Python regius), 23 emerald tree boas (Corallus caninus), seven African mud turtles (Pelusios castaneus) and one tokay gecko (Gekko gecko) were analysed. Three sequences from ball pythons, nine different sequences from emerald tree boas, and two sequences from African mud turtles could be obtained. Only one of these sequences was completely identical with one of the sequences available at the NCBI genbank originating from a Hepatozoon sp. from an elegant sand racer (Psammophis elegans). The remaining sequences thus seem to be first molecular description and characterisations of hemogregarines.In a phylogenetic tree the sequences obtained from the snakes clustered with Hepatozoon sp. but formed several separated groups indicating the existence of several species. The sequences obtained from parasites of the African mud turtles formed a sister clade to Haemogregarina sp. but were also close to species described as Hepatozoon sp. The formation of this clade was not supported by high bootstrap values. The taxonomic position thus seems to be unsolved. The present study shows that a variety of hemogregrine species have been introduced into Germany via imported reptiles. Using molecular methods most hemogregarines detected here were unequivocally characterized for the first time. Since the exact identification is fundamental for determination of pathogenicity of these hemogregarines in reptiles and for the development of a therapy, this study represents an important prerequisite for future investigations.

Sat, 8 Feb 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16954/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16954/1/Michels_Jessica.pdf Michels, Jessica ddc:59

Die erfolgreiche Infektion von Tubifex tubifex (Annelida) mit M. cerebralis (Myxozoa), dem Erreger der Drehkrankheit der Salmoniden, und die anschließende Entwicklung des Parasiten zur Triactinomyxon-Sporen im Darmepithel der Oligochaeten werden von verschiedenen Umweltfaktoren beeinflusst. Geeignete Bedingungen zur Haltung der Oligochaeten spielen während der Kultivierung im Labor eine entscheidende Rolle. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des Bodensubstrats und der Futterzusammensetzung auf die Infektionsdynamik der Oligochaeten und die anschließende Sporenproduktion zu untersuchen. Einen weiteren Aspekt stellte die Auswirkung der Parasitose und der Haltungsbedingungen auf die Entwicklung und Reproduktion der Tubificiden dar. Die mit gleicher Sporendosis infizierten Oligochaeten wurden in Becken mit Sand, Schlamm oder einem Gemisch aus Sand und Schlamm als Substrat gehalten. Unabhängig davon wurden verschiedene Futterzusammensetzungen auf dem Substrat aus Sand und Schlamm getestet. Zum Ende des Versuchs wurde das Gesamtgewicht der in den einzelnen Becken verbliebenen Tubificiden ermittelt, sowie die Bildung von Kokons in den Becken erfasst. Zur Feststellung der Infektionsrate, sowie der Prävalenz wurden 20 und 60 Tage nach der Exposition 20 Oligochaeten entnommen und mittels Histologie und einer für M. cerebralis spezifischen Polymerase-Kettenreaktion auf den Infektionserfolg hin untersucht. Die höchste Infektionsrate zeigten die im Schlamm gehaltenen Oligochaeten, gefolgt von denjenigen in den Sandbecken. Jedoch stellte sich heraus, dass Sand als Bodengrund für die Haltung der Tubificiden weniger geeignet ist; ein Gemisch aus Sand und Schlamm führte zu einem deutlich besseren Ergebnis. Bei der quantitativen Sporenerfassung erwies sich der Schlamm als am besten geeignetes Substrat für die Haltung der Tubificiden und somit die Entwicklung der Parasiten unter Laborbedingungen. Im Futterversuch führten die kommerziellen Zierfisch-Futtermittel zur besten Sporenproduktion, während frisch zubereitete Futtermischungen aus Fisch oder Salat sich als weniger geeignet erwiesen. Am Ende der Versuchsreihe war das Gewicht der verbliebenen Oligochaeten in den Schlammbecken im Vergleich zum Versuchsbeginn nur leicht vermindert. Des Weiteren war die Produktion von Kokons in diesen Becken sehr hoch. In den Sandbecken hingegen war nur ein Siebtel der Tiere nach dem Versuch vorhanden und es waren keine Kokons zu finden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Schlamm als Substrat und kommerzielle Zierfisch-Futtermittel für die Ernährung der Tubificiden unter Laborbedingungen vorzuziehen sind um die höchste Sporenproduktion zu erreichen.

Syphilis is one of the longest recognized sexually transmitted diseases of the world. After the discovery of Treponema pallidum (1905), the causative agent of syphilis, and the effective use of the antibiotic penicillin to treat the disease (1943), the diagnosis and elimination of syphilis appeared to be easy. The intervening years have shown that the syphilis remains a widespread infectious disease, which may occur in epidemics. Despite progress in the immunologic and serologic diagnosis, syphilis can still be difficult to diagnose of, especially in its latent stage. Routine diagnosis of syphilis may also in patients with co-infection by human immunodeficiency virus (HIV) or with concomitant autoimmune disorders. Because of its sensitive biological structure, T. pallidum cannot be cultured. Once the polymerase chain reaction (PCR) became available (1985), it became possible to identify T. pallidum with certainty on the basis of it specific DNA. Since 1990 PCR was used for diagnosis of syphilis in patients with genital ulcers, in congenital syphilis, and neurosyphilis. The PCR diagnosis of syphilis is not yet available for routine use. The goal in this work was to establish and evaluate PCR for the molecular diagnosis of syphilis on patient samples. The sensitive and specific nested PCR method was used for detection of the 47 kDa treponema pallidum protein (tpp47) gene. No gene polymorphisms were identified for tpp47 gene. After Southern blotting of the amplicon, an internal DNA probe should be used as an additional control. The tpp47 PCR was tested in various samples from patients. For the first time, PCR was used for samples of isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC), granulocytes, lymph nodes aspiration biopsy, and ejaculates. The PCR investigation of PBMC blood fraction had a highest sensitivity of 87.5 %, even in latent infection, if the PBMC was isolated by Ficoll following by high speed centrifugation. The previously published studies of PCR with serum and whole blood samples had a sensitivity of 61 – 66 %. The lymph nodes biopsy after Schaudinn and Hoffmann (1905) combined with PCR allowed the detection of T. pallidum DNA in patients without clinical symptoms of syphilis (latent stage). This approach is very important for the differential diagnosis of widespread lymphadenopathy which may also be caused by HIV infection. This work also showed for the first time by molecular biological methods that the ejaculate in syphilis is infectious, being positive for T. pallidum. In addition, this work showed that skin biopsy specimens from syphilitic lesions should not be embedded into paraffin before the DNA is extracted, but instead should be shock frozen for more sensitive detection of T. pallidum DNA. In addition, swab PCR was used to demonstrate that the pharyngeal mucosa in angina syphilitica of secondary syphilis does not contain T. pallidum. In patients without signs of syphilis and with unclear serological test results, sometimes because of HIV co-infection, latent syphilis was diagnosed by PCR analysis of PBMC, allowing institution of therapy rather than waiting for traditional tests to become positive again. This doctor thesis shows that syphilis diagnosis based on PCR is a sensitive and clinically important method, which can be especially important, if the syphilis serology is inconclusive.

Zum Nachweis von dissemnierten Tumorzellen im Blut bei gastro-intestinalen Karzinomen wurde die real-time PCR von Cytokeratin 20 untersucht. Die Evaluation der Methode erfolgte durch die Untersuchung von Negativkontrollen sowie von hergestellten Positivproben mit HT29-Zellen. Hierbei zeigte sich eine Spezifität von 100%. In 10ml Vollblut konnten noch fünf Tumorzellen nachgewiesen werden. Von den untersuchten Patientenproben wurden 16,2% positiv auf Cytokeratin 20 getestet. Es gab keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem positiven Nachweis von Cytokeratin 20 im Blut und klinisch-pathologischen Parametern.

Die genetischen Grundlagen der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen M. Crohn und Colitis ulcerosa sind komplex und noch nicht in allen Einzelheiten aufgeklärt. Hitzeschockproteine (Hsp72) haben eine protektive Wirkung in entzündeter Darmmukosa. Daher könnte ein Mangel dieser Proteine den Verlauf inflammatorischer Darmerkrankungen beeinflussen. Zur Verifikation dieser Hypothese wurde die genomische DNA aus Leukozyten von 61 kaukasischen Patienten mit M. Crohn und 25 Patienten mit Colitis ulcerosa isoliert. Anschliessend wurde durch Polymerase-Kettenreaktion ein Segment des Hsp70-2 Gens amplifiziert, das einen A/G-Transitionspolymorphismus trägt (Allel B), der mit einer geringeren Hsp72-Expression assoziiert ist. Durch eine Restriktionsanalyse (Enzym: PstI) und konsekutiver Elektrophorese konnte das Vorliegen der Transition überprüft werden. Die aus den Krankenakten erhobenen Krankheitsverläufe (Alter bei Erstdiagnose, Ausdehnung und Lokalisation der Erkrankung, extraintestinale Manifestationen, Operationen, Komplikationen, Medikation) wurden mit den Ergebnissen der Genanalyse korreliert. Das Allel B kam bei Patienten mit M. Crohn nicht signifikant häufiger vor als bei gesunden Personen (44 % bei Patienten vs. 42 % bei Gesunden). Die Resultate zeigten jedoch eine signifikante Assoziation (p

Die hypertrophisch obstruktive Kardiomyopathie (HOCM) als Erbkrankheit stellt eine der Haupttodesursachen in der westlichen Welt unter den an Herzkrankheiten plötzlich Verstorbenen dar. Eine intraventrikuläre Obstruktion der Ausflußbahn des linken Ventrikels bedingt eine erhöhte Druckarbeit, was eine Hypertrophie der gesamten Herzmuskulatur des linken Ventrikels nach sich zieht. Klinisch relevant ist die begleitende diastolische Relaxationsstörung. In dieser Arbeit wird untersucht, ob nach erfolgreicher Alkoholablation mit Abnahme der diastolischen Relaxationsstörung Genexpressionsänderungen regulatorischer Proteine der Calciumhomöostase auftreten. Zu diesem Zwecke wurden Herzmuskelbiopsien von Patienten mit HOCM vor und nach Behandlung der Septalastes mit Alkoholablation (TASH) auf den mRNS-Gehalt folgender Gene untersucht: alpha 1c-, beta-, alpha2/delta-Untereinheit, SERCA 2a und das Phospholamban. Die Genexpressionsuntersuchungen wurden quantitativ mit Hilfe der reversen kompetitiven Polymerase Kettenreaktion vorgenommen. Die Ergebnisse zeigen eine prozentuale Abnahme der Genexpression nach Behandlung mit TASH der alpha 1c-Untereinheit um 82,91% (p = 0.05), der alpha2/delta-Untereinheit um 71,64% (p = 0.04) und der beta-Untereinheit um 64,85% (p = 0.03). Die Genexpressionsveränderungen der SERCA 2a und des Phospholambans waren nicht signifikant. Die signifikante Reduktion der Expression der alpha 1c-, alpha2/delta- und beta-Untereinheit nach Alkoholablation der septalen Hypertophie bei Patienten mit HOCM sprechen dafür, dass der L-Typ Calciumkanal eine Rolle im Rahmen der Anpassungsvorgänge bei hypertrophisch obstruktiver Kardiomyopathie spielt. Dies gilt jedoch nicht für die SERCA2a- und die Phospholamban-Genexpression bei den untersuchten Patienten. Eingeschränkt wird die Aussagefähigkeit unserer Untersuchungen durch die geringe Fallzahl. Vorteil der Untersuchung ist jedoch, dass die Genexpressionsänderung der unterschiedlichen Gene jeweils am gleichen Patienten zum Zeitpunkt der Behandlung und sechs Monate danach untersucht wurde. Unsere Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, dass eine Verbesserung der diastolischen Relaxation nach erfolgreicher Intervention mit Genexpressionsänderungen regulatorischer Proteine der Calciumhomöostase einhergeht.

In der hier vorgelegten Arbeit wurden 234 Blutproben von insgesamt 121 HIV- infizierten Patienten auf HHV-8 untersucht. Mit Hilfe der Real-time TaqMan PCR wurde HHV-8 quantitativ bestimmt. Insgesamt konnte in 132 Proben HHV-8 nachgewiesen werden, wobei die HHV-8 Viruslast zwischen 1 Geq/1x104 Zellen und 457.079 Geq/1x104 Zellen betrug. Der höchste Wert wurde bei einem Patienten gemessen, der an der multizentrischen Castlemanschen Erkrankung litt. Zudem wurde untersucht, ob sich bestimmte Einflussfaktoren wie die CD4-Zellzahl, die HIV-1 Viruslast, die Einnahme einer anti-retroviralen (HAART) oder virostatischen (Aciclovir, Ganciclovir oder Foscarnet) Therapie auf die HHV-8 Viruslast auswirken. Da im Rahmen einer erfolgreichen HAART Therapie die CD4-Zellzahl mittelfristig ansteigt, konnten wir einen indirekten Einfluss der HAART Therapie auf die HHV-8 Viruslast nachweisen: Bei den HHV-8 positiven Patienten stellten wir fest, dass die CD4-Zellzahl negativ mit der HHV-8 Viruslast korreliert, d.h. je höher die CD4-Zellzahl und somit je besser die Immunabwehr, desto niedriger war die gemessene HHV-8 Viruslast. Die virostatischen Medikamente Aciclovir, Ganciclovir und Foscarnet hatten in vivo keine signifikante Wirkung auf die HHV-8 Viruslast, wobei Foscarnet aufgrund einer zu niedrigen Fallzahl der damit therapierten Patienten nicht ausreichend beurteilt werden konnte. Zusammenfassend kann die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die quantitative HHV-8 PCR dem Staging und der Verlaufsbeobachtung einer bereits bekannten HHV-8 Infektion mit klinischer Manifestation dienen kann.

In der vorliegenden Arbeit wurde eine vergleichende Untersuchung der Polymerase Kettenreaktion und der Southern Blot Analyse beim Nachweis der bcl-2 Translokation bei Patienten mit centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen durchgeführt. Erstes Ziel der war die Ermittlung der Häufigkeit der bcl-2 Translokation t(14;18) im Bereich der MBR im Knochenmark bei einer Gruppe von Patienten mit centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen im Einzugsgebiet des Tumorzentrums München. Zweites Ziel war die Untersuchung der Sensitivität und Spezifität der Southern Blot Analyse und der Polymerase Kettenreaktion im Nachweis der t(14;18) Translokation als Indikator für Organbefall im Vergleich mit der histologischen, cytologischen und immuncytologischen Untersuchung des Knochenmarks oder des peripheren Blutes. Drittes Ziel war die Untersuchung der Frage, inwieweit die Polymerase Kettenreaktion bzw. die Southern Blot Analyse zur Verlaufsbeobachtung bei centroblastisch-centrocytischen und centroblastischen Non-Hodgkin Lymphomen geeignet ist und ob sich Patienten mit oder ohne eine nachgewiesene bcl-2 Translokation bezüglich Allgemeinbefinden nach WHO-Einteilung und des klinischen Krankheitsstadiums unterscheiden. Die Southern Blot Analyse ist eine sensitive, jedoch zeit- und kostenintensive Methode zum Nachweis der bcl-2 Translokation t(14;18). Allein der Schritt der Autoradiographie der Röntgenfilme kann über 7-14 Tage dauern. Daher ist die SBA weniger für Routinediagnostik geeignet. Es wird eine Mindestmenge von 10 µg DNS pro Restriktionsenzym-Verdauprozess, in der Regel 30 µg DNS benötigt, die nicht bei jeder Patientenprobe zur Verfügung steht. Störfaktoren können unter anderem ein unvollständiger Enzymverdau durch Restriktionsenzyme, Verunreinigung der DNS durch Proteine und Salze, Strangbrüche der DNS bei zu langem Enzymverdau oder nach erfolgter Chemotherapie sein. In unserer Untersuchungsgruppe konnte nur bei 17 von 35 Patienten die Southern Blot Analyse genomischer DNS erfolgreich durchgeführt werden; bei einem von 35 Patienten konnte das Ergebnis der SBA nicht beurteilt werden. Die SBA kann die bcl-2 Translokation t(14;18) unabhängig von der Bruchpunktregion nachweisen. Bei 3 von 17 Patientenproben (17.6%) mit negativer PCR gelang ein Nachweis der Translokation t(14;18) in der SBA. Durch die SBA wurde in der vorliegenden Arbeit bei fehlendem Hinweis auf einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie eine deutlich niedrigere Detektionsrate an Zellen mit der Translokation t(14;18) erreicht als mit der PCR (SBA 25.0% versus PCR 66.7%). Die Polymerase Kettenreaktion kann eine maligne Zelle unter 106 Zellen detektieren. Die Methode ist schnell und kostengünstig. In unserem Versuchsansatz lag das Ergebnis im Durchschnitt innerhalb eines Tages vor. Bei allen der untersuchten 35 Patientenproben konnte die PCR erfolgreich durchgeführt werden. Zur Steigerung der Sensitivität und Spezifität der Polymerase Kettenreaktion ist eine Southern Blot Analyse der PCR Amplifikate zu empfehlen, da in der vorliegenden Arbeit bei 6 von 35 Patienten (17.1%), bei denen in der Gelelektrophorese der PCR Amplifikate keine Bande detektierbar war, in der Southern Blot Analyse der PCR Produkte eine Bande dargestellt werden konnte. Die Ermittlung der optimalen Versuchsbedingungen für die individuellen Laborgeräte und Materialien ist unabdingbar. Unter anderem kann die Änderung von Anlagerungstemperatur, MgCl2-Konzentration, DNS-Menge, Konzentration der Nukleotide, Art des Verdunstungsschutzfilms, Konzentration des Agarosegels, Betriebsart des Thermocycler-Gerätes eine Störquelle bilden und zum Teil hohen Zeit- und Kostenaufwand bis zur Optimierung der Versuchsbedingungen erfordern. Da in unserem Patientengut keine cytogenetische Untersuchung durchgeführt wurde, die eine Translokation t(14;18) nachweist, sondern nur Untersuchungen auf einen Befall mit malignen Lymphomzellen im Blut oder Knochenmark (Cytologie, Immuncytologie, Knochenmarkhistologie), die nicht obligat die Translokation t(14;18) tragen, fehlte uns ein Referenzwert zur Untersuchung der Sensitivität und Spezifität der Polymerase Kettenreaktion und der Southern Blot Analyse. Bei 17 von 35 Patientenproben, bei denen die SBA nicht durchgeführt werden konnte waren 11 (31.4%) in der PCR positiv. Bei 3 von 17 (17.6%) Patientenproben, bei denen die SBA positiv ausfiel war die PCR negativ. Bei 5 von 17 (29.4%) Patientenproben, bei denen die SBA negativ ausfiel war die PCR positiv. Sowohl die Southern Blot Analyse als auch die Polymerase Kettenreaktion haben ihre Grenzen der Sensitivität und Spezifität im Nachweis der Translokation t(14;18). Bei 29.4% der PCR positiven Patientenproben entging der SBA der Nachweis, bei 17.6% der SBA positiven Patientenproben entging der PCR der Nachweis. Beide Methoden sollten daher zum Nachweis der bcl-2 Translokation kombiniert angewendet werden. Die Häufigkeit der bcl-2 Translokation in unserer Untersuchungsgruppe mit 35 Patienten im Einzugsgebiet des Tumorzentrums München ist mit 77.1% für die kombinierte Anwendung von PCR und SBA vergleichbar mit der Häufigkeit, die in der Literatur für Patientengruppen in den USA, in Großbritannien und in den Niederlanden angegeben wird. Die bcl-2 Translokation konnte mit der Southern Blot Analyse bei 58.8%, mit der Polymerase Kettenreaktion bei 68.6% der Patienten nachgewiesen werden. Wurden beide Methoden kombiniert, betrug die Nachweisquote 77.1%. Bei 82.9% der Patienten konnte ein peripherer Befall mit Lymphomzellen durch Kombination der morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie oder Immuncytologie nachgewiesen werden, dagegen bei 47.1% durch die Histologie allein. Daher sollten die Histologie, Cytologie und Immuncytologie zum Nachweis eines peripheren Befalls kombiniert eingesetzt werden. Die Detektionsrate der Southern Blot Analyse und der Polymerase Kettenreaktion ist annähernd gleich bei vorliegendem Hinweis auf einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie (SBA 64.3% versus PCR 69.0%). Durch die Southern Blot Analyse wird bei fehlendem Hinweis auf einen Befall durch maligne Zellen im Blut oder Knochenmark durch die morphologischen Untersuchungsmethoden Histologie, Cytologie und Immuncytologie eine deutlich niedrigere Detektionsrate an Zellen mit der Translokation t(14;18) erreicht als mit der Polymerase Kettenreaktion (SBA 25.0% versus PCR 66.7%). Bei fehlendem morphologischem Nachweis eines peripheren Befalls eignet sich die PCR zum Nachweis der bcl-2 Translokation deutlich besser als die SBA. Unter den Patienten mit Nachweis eines Knochenmarksbefalls mit Zellen mit der bcl-2 Translokation waren 3 Pat. mit klinischer kompletter Remission, 4 Pat. im klinischen Stadium I A oder I B, 4 Pat. im klinischen Stadium II A oder II B. Würde die bcl-2 Translokation t(14;18) als typisch für die malignen Lymphomzellen angesehen, müsste die Heraufstufung in das Stadium IV erfolgen. Patienten aus unserer Untersuchungsgruppe mit Nachweis einer bcl-2 Translokation mit der Southern Blot Analyse bzw. der Polymerase Kettenreaktion zeigten keinen auffallenden Unterschied im klinischen Verlauf des CB-CC oder CB Non-Hodgkin Lymphoms im Vergleich zu Patienten ohne Nachweis einer bcl-2 Translokation. Die Ergebnisse sind jedoch aufgrund der großen Varianz der klinischen Verlaufsbeobachtungsdauer und der uneinheitlichen Therapie bei den untersuchten Patienten nur eingeschränkt auswertbar.

Humanes Herpesvirus Typ 7 wurde bisher mit verschiedenen fieberhaften Erkrankungen im Kindesalter in Verbindung gebracht. Typischerweise kann HHV-7 exanthematöse Erkrankungenverursachen, in wenigen Fällen konnte ein Zusammenhang mit neurologischen Komplikationen beobachtet werden. Unter anderem wurden Fieberkrämpfe, temporäre Hemiparesen oder Meningitiden beschrieben. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob HHV-7 im Liquor pädiatrischer Patienten mit verschiedenen neurologischen Erkrankungen auch ohne Exanthema subitum nachgewiesen werden kann. Dazu wurde ein hochsensitives Nachweisverfahren bestehend aus DNA-Präparation und nested-PCR entwickelt. Nach Demonstration seiner hohen Sensitivität und Spezifität wurden mit dem Verfahren insgesamt 104 Liquorproben untersucht. Bei 6 Patienten konnte HHV-7 DNA im Liquor nachgewiesen werden. Die Krankheitsverläufe dieser Patienten wurde dargestellt und mit den wenigen, bisher in der Literatur beschriebenen Infektionen verglichen. Parallel erfolgte ein Vergleich mit Infektionen des nächsten Verwandten HHV-6. HHV-7 scheint sowohl bei der Primärinfektion als auch bei der Reaktivierung in das ZNS einzudringen und dort zu neurologischen Komplikationen führen zu können. Dies geschieht offensichtlich unabhängig vom Vorliegen eines Virusexanthems (z. B. Exanthema subitum). Wie bei HHV-6 ist ein breites Spektrum an neurologischen Komplikationen möglich. In dieser Untersuchung konnte erstmalig HHV-7 im Liquor von Patienten mit aseptischer Meningitis, ADEM, Infektkrampf, einseitiger peripherer Fazialisparese und einseitiger Störung des N. vestibularis nachgewiesen werden. Bei 3 Patienten lag dabei eine entzündliche Liquorveränderung vor. Alle 6 HHV-7 positiven Patienten waren unter den 67 Patienten der Studiengruppe zu finden. In keiner der 37 Liquorproben der Kontrollgruppe ließ sich das Virus detektieren. Bei Patienten mit neurologischen Komplikationen im Rahmen fieberhafter viraler Erkrankungen mit und ohne Exanthem muß an HHV-7 als Ursache gedacht werden.