Podcasts about fusionsprotein

Thu, 30 Oct 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9306/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9306/1/Franzen_Michael.pdf Franzen, Michael

Thu, 9 Oct 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9180/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9180/1/Heiss-Neumann_Marion_S.pdf Heiß-Neumann, Marion Susanne

Die bisherige Analyse der mini-LCL-stimulierten T-Zelllinien konzentrierte sich hauptsächlich auf die zytotoxischen CD8+ T-Zellen. Klinische Studien haben aber gezeigt, dass für eine lang anhaltende Immunität nach Stammzelltransplantation (SCT) der adoptive Transfer von CMV-spezifischen CD8+ und CD4+ T-Zellen wichtig ist. Neuere Studien unterstreichen die Rolle der CD4+ T-Zellen bei der Etablierung eines funktionierenden CD8+ T-Zellgedächtnis. Darüber hinaus wirken CD4+ T-Zellen antiviral durch die Sekretion von Zytokinen, wie IFN-g und TNF-a, und können ebenfalls zytotoxisch aktiv gegen Virus-befallene Zellen werden. Die vorliegende Arbeit sollte untersuchen, ob das mini-EBV-System geeignet ist T-Zellen zu generieren, die viele verschiedene CMV-Epitope - durch MHC-Klasse-I- und -II-Moleküle präsentiert - erkennen. T-Zellkulturen von Spendern mit unterschiedlichen HLA-Typen sollten etabliert und analysiert werden. Dabei stand eine eingehende Analyse der Epitop-Spezifitäten der generierten T-Zellen im Vordergrund. Des Weiteren sollte geklärt werden, ob sich mLCLs zur Primärstimulation von naiven T-Zellen eignen. Da neben pp65 auch IE1 ein weiteres wichtiges CMV-Antigen darstellt, sollten zwei neue mEBV-Plasmide konstruiert werden, damit auch Spender erreicht werden können, die keine ausgeprägte Immunantwort gegen pp65 besitzen. Es gibt nur wenige gesunde Seropositive, die keine Immunität gegen zumindest eines dieser beiden Antigene besitzen. Ein Vektor sollte eine Expressionskassette für IE1 enthalten, der zweite eine Kassette für ein Fusionsprotein bestehend auch pp65 und IE1 (pp65_IE1). Mit Hilfe der generierten IE1-mLCLs und pp65_IE1-mLCLs sollten autologe T-Zellen stimuliert und ihre Eigenschaften eingehend charakterisiert werden.

Peroxisomales Targeting und Import von Proteinen in Peroxisomen sind für die Entstehung, Wachstum und Funktion von Peroxisomen entscheidend. Ziel dieser Dissertation war, die Region und das Aminosäure-Motiv innerhalb des Adrenoleukodystrophie-Proteins (ALDP) zu identifizieren, welches für das peroxisomale Targeting erforderlich ist. Dieses peroxisomale Membran-Protein ist defekt oder fehlend bei der X-gebundenen Adrenoleukodystrophie, einer überwiegend in der Kindheit auftretenden letalen neurodegenerativen Erkrankung. Unter Verwendung von Deletions- und GFP-Fusionsprotein-Konstrukten konnte die für das peroxisomale Targeting notwendige Region des humanen ALDP auf die Aminosäuren 67-110 eingegrenzt werden. Dabei sind die NH2-terminalen 66 Aminosäuren des ALDP für das peroxisomale Targeting zwar nicht notwendig, sie erhöhen jedoch die Targeting-Effektivität insgesamt. Die für das Targeting notwendige Region ist allerdings alleine nicht auseichend, um ein Fusionsprotein an das Peroxisom zu leiten. Zusätzliche Aminosäuren scheinen für die Stabilisierung und Insertion in die peroxisomale Membran notwendig zu sein, da die Aminosäure-Regionen 1-110 und 67-164 ein Fusionsprotein an das Peroxisom dirigieren können. GFP-Fusionsproteine der dem 67-164 ALDP entsprechenden Regionen des humanen peroxisomalen Membran-Proteins 69 und des Pxa1 der Hefe wurden ebenfalls an das Peroxisom geführt. Damit konnte eine partielle Konservierung der Targeting-Region innerhalb der humanen peroxisomalen ABC-Transporter und zwischen Hefe und Mensch gezeigt werden. Die Targeting-Region beinhaltet ein 14 Aminosäuren (71-84) umfassendes konserviertes Motiv. Eine Deletion des gesamten Motivs oder von Teilen dieses Motivs führt zu einem Verlust des peroxisomalen Targetings des ALDP. Von den getesteten Mutationen einzelner Aminosäuren bewirkt lediglich die Substitution L78F eine signifikante Verminderung der Targeting-Effektivität. Dagegen führt die bei zwei X-ALD Patienten beobachtete Deletion von drei Aminosäuren innerhalb des Motivs zu einem Verlust des peroxisomalen Targetings mit einer partiellen Anreicherung des GFP-Fusionsproteins in Mitochondrien und gibt somit Aufschluss über die molekulare Ätiologie ihrer Erkrankung.

Der programmierte Zelltod (Apoptose), ist ein evolutiv konserviertes Selbstmordprogramm der Zelle, um auf äußere oder endogene Signale zu reagieren. Es dient dazu, überflüssige und/oder geschädigte Zellen zu entfernen. Dieser Prozess ist bei Krankheiten wie z.B. Krebs teilweise außer Kraft gesetzt, und bei Parkinson- oder Alzheimer-Erkrankung zu stark ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Gene biochemisch und molekularbiologisch näher charakterisiert. Bei diesen zwei Genen, die mit Hilfe eines speziell zur Identifikation dominanter, Apoptose–induzierender Gene entwickelten Screnningsverfahrens identifiziert wurden, handelt es sich um CybL, eine Komponente von Komplex II der Atmungskette, und um Saip (Small apoptosis inducing protein) einem Protein, das am endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist. Bisher war bekannt, daß die Atmungskettenkomplexe I und III bei der Fas-Ligand und der Ceramid-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Über einen Zusammenhang von Komplex II und Apoptose-Induktion war zu Beginn dieser Arbeit nichts beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde entdeckt, daß neben CybL kann auch noch die kleine Untereinheit von Komplex II (CybS) Apoptose auslösen kann, wohingegen die übrigen Komponenten von Komplex II, das Flavinprotein (FAD) und das Eisen–Schwefelprotein (FeS), nicht in der Lage sind, Apoptose zu induzieren. Die laut Datenbank vorhergesagten vier Transmembrandomänen von CybL sind für die apoptoseinduzierende Eigenschaft notwendig. Darüber hinaus führt nur eine 3,8–fache Induktion von CybL über dem endogenen CybL zu Apoptose in Säugetierzellen. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, daß CybL einerseits bei Überexpression Apoptose induzieren kann, und andererseits Apoptose durch seine Inaktivierung reduziert wird. Daß CybL damit ein spezifischer Sensor für Apoptose ist, konnte dadurch ermittelt werden, daß eine Reihe verschiedener Apoptosestimuli (Doxorubicin, Etoposid, Menadion, Cisplatin, Taxol) und der Fas-Rezeptor einen intakten Komplex II zur Signalvermittlung benötigen. Dazu wurde mit sogenannten B9/B30 Zellen gearbeitet. B9/B30-Zellen sind Lungenfibroblasten aus Hamsterzellen, in denen CybL inaktiv ist (B9), wohingegen die B30-Zellen ein Fusionsprotein zwischen CybL und GFP enthalten, welches die physiologische Aktivität von Komplex II wiederherstellt. In den B9-Zellen ist die Apoptoseinduktion durch Cytostatika (Ausnahme Arsentrioxid) bzw. durch den Fas-Rezeptor reduziert, verglichen mit den B30-Zellen. Auch Untersuchungen an HeLa WT- bzw. HeLa 0-Zellen (die keine intakte Atmungskette besitzen) zeigten, daß für die Apoptoseinduktion mit den oben genannten Reagenzien eine intakte Atmungskette benötigt wird. Im Jahre 2000 wurde CybL als Tumosupressor beschrieben. Es ist daher zu vermuten, daß die Tumorsuppressor-Eigenschaften von CybL auf der Fähigkeit von Komplex II beruhen, proapoptotische Signale aufzunehmen und weiterleiten zu können. Bisher war bekannt, daß eine transiente Inhibition einiger Atmungskettenkomplexe (Komplex I, II, III) zur Bildung von reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROI) führt. Es konnte gezeigt werden, daß auch CybL bei Überexpression reaktive Sauerstoffintermediate produziert, und daß viele proapoptotische Signale zur spezifischen Inhibition von Komplex II führt. Da bereits eine geringe Expression von CybL ausreichend ist, um Komplex II zu inhibieren, und dadurch Apoptose ausgelöst wird, kann Komplex II als spezifischer Sensor für Apoptose angesehen werden. Das bisher unbekannte Gen mit dem Namen Saip löst dominant Apoptose in Säugetierzellen aus. Die proapoptotische Eigenschaft von Saip ist vermutlich auf einen evolutiv konservierten Mechanismus zurückzuführen, da auch ein Homolog aus C.elegans nach transienter Transfektion in Säugerzellen Apoptose auslöst. Dabei induziert Saip Caspase-abhängige Apoptosewege, die zur Apoptose-typischen DNA–Fragmentierung und Bildung von apoptotischen Körperchen (Membran blebbing) führt. Es konnte auch eine physikalische Protein-Proteininteraktion (mittels Co-Immunpräzipitation) mit Bap31 gefunden werden. Dieses Protein ist ebenfalls am ER lokalisiert und Bestandteil eines lokalen Apoptose-Sensors, der einen Proteinkomplex mit Procaspase-8L sowie antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie (Bcl-2 bzw. Bcl-XL) bildet. Des weiteren interagiert Saip auch mit einer Deletionsmutante von Spike (Small protein with inherent killing effect-SpikeN19), einem neuen proapoptotischen BH3-only Protein, das ebenfalls am ER lokalisiert ist, und an Bap31 bindet. Saip ist ein ubiquitäres Protein und wird in sehr vielen der getesteten Gewebe und Zelltypen exprimiert. Im Northern-Blot-Verfahren konnte vergleichsweise eine hohe Expression an humaner Saip-mRNA in Niere, Placenta, Herz, Leber, Dünndarm und Skelettmuskulatur detektiert werden. Mit Hilfe von weiteren Northern-Blots wurde herausgefunden, daß Saip durch diverse Reagenzien, die bekanntermaßen Apoptose induzieren können, transkriptionell hochreguliert wird. So ist zum Beispiel das Signal von Saip nach 5-Fluorouracil-Behandlung (5FU), um das 80-fache gegenüber der Kontrolle erhöht. 5FU ist ein sehr effektives und bekanntes Zytostatikum, das in der Klinik zur Behandlung von Colon- und Mammakarzinomen erfolgreich eingesetzt wird. Wird Saip mittels der RNAi–Methode deaktiviert, wird die 5FU-induzierte Apoptose um 1/3 reduziert. Saip könnte somit eine wichtige Rolle in der Behandlung von Tumoren spielen, die mit 5FU therapiert werden.

Die Eph-Familie von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden, die Ephrine, sind die größte Gruppe von axonalen Zielführungsmolekülen. Die membrangebundenen Ephrine und ihre Rezeptoren sind jedoch nicht ausschließlich für die Etablierung neuronaler Konnektivität, sondern auch für Entwicklungsvorgänge außerhalb des Nervensystems wie die Ausbildung des Blutgefäßsystems und die Steuerung von Zellmigration von Bedeutung. Als charakteristisches Merkmal dieser Molekülfamilie kann jeder einzelne Rezeptor durch eine Vielzahl verschiedener Ephrine aktiviert werden, was eine starke funktionelle Redundanz zur Folge hat. Konventionelle knock-out Experimente liefern daher nur ein unvollständiges Bild von der Funktion dieser Proteine, da eine genetische Deletion von Einzelmolekülen zumindest partiell von anderen Vertretern der Eph-Familie kompensiert werden kann. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine transgene Mauslinie etabliert, welche im gesamten Nervensystem ein sezerniertes, Antikörper-ähnliches Fusionsprotein, einen sog. Rezeptorkörper, exprimiert. In dieser Mauslinie sollte der Rezeptorkörper alle Ephrine der sog. A-Subfamilie zugleich binden und neutralisieren, und damit die funktionelle Redundanz der A-Ephrine überwinden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt der Rezeptorkörper kloniert, in Zellinien exprimiert und hinsichtlich seiner Funktionalität charakterisiert. In einem zweiten Schritt wurde nun das Mikrotubuli bindende Protein Tau gegen die cDNA des Rezeptorkörpers ersetzt (sog. knock-in), und nach Keimbahntransmission des rekombinanten Allels wurde durch Rückkreuzung gegen den Inzuchtstamm C57BL/6 eine congenische Mauslinie erzeugt. In dieser Mauslinie wurde der Rezeptorkörper mit dem räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von tau exprimiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige Eigenschaften der knock-in Mauslinie charakterisiert. Die vollständige Deletion des Tau-Proteins sowie die pan-neuronale Expression des Rezeptorkörpers wurden mit Hilfe von Northern-Transfer, mRNA in-situ Hybridisierung, RT-PCR sowie mit Western-Transfer und immunhistochemischen Experimenten belegt. Tiere mit dem rekombinanten Allel waren fertil, zeigten keine Hinweise für eine erhöhte prä- oder postnatale Letalität, und das äußere Erscheinungsbild der Mäuse war weitgehend unauffällig. Eine erste Analyse der Hirnanatomie mit Hilfe klassischer histologischer Färbemethoden lieferte keine Hinweise auf starke, offensichtliche morphologische Veränderungen. Mit einem Immunassay wurde die Gewebekonzentration des Rezeptorkörpers zu verschiedenen embryonalen und postnatalen Entwicklungsstufen quantifiziert. Auf subzellulärer Ebene wurde mittels immuncytochemischer Färbungen dissoziierter Neuronen demonstriert, daß der Rezeptorkörper nicht auf das Soma der Zellen beschränkt, sondern auch in Nervenfortsätzen lokalisiert war. Die Analyse der Mauslinie auf spezifische Veränderungen im dritten Teil der Arbeit konzentrierte sich auf sensorische Projektionen in Peripherie und Rückenmark, sowie auf physiologische Aspekte des visuellen Systems und Blutgefäße. In neugeborenen Tieren wurden keine offensichtlichen Veränderungen der topographischen Projektionen von Spinalganglien in das Rückenmark detektiert. In der Peripherie wurde in dem knock-in hingegen eine signifikante Zunahme von Nervenverzweigungen in verschiedenen Strukturen beobachtet, die bei der Innervierung von Extremitäten sowie bei Interkostalnerven zwischen dem 12. und dem 14. Tag der Embryonalentwicklung (E12-14) besonders ausgeprägt war. Die Untersuchung der Blutgefäße im zentralen Nervensystem adulter Mäuse mit Hilfe von Korrosionsausgüssen ließ in der Mutante keine offensichtlichen Veränderungen erkennen. Mit Hilfe der in Anwendung auf Mäuse neuartigen Technik „Intrinsic Signal Optical Imaging“ wurde die Repräsentation der Retina im Primären Visuellen Cortex juveniler und adulter Mäuse untersucht. Zentraler Befund dieser Experimente war eine Verzerrung der retinotopen Karte in dem knock-in, die in jungen Mäusen erheblich stärker war als in adulten Tieren.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) FGFR4 (Fibroblast Growth Factor Rezeptor 4) in der Tumorentwicklung untersucht. Der FGFR4 besteht aus einer extrazellulären ligandenbindenen Domäne, einer einspännigen Transmembrandomäne und einem intrazellulären Bereich, der neben zwei Kinasedomänen auch eine Reihe von Bindungsmotiven für Adapterproteine mit und ohne enzymatische Aktivität enthält. Die Tyrosinkinase Funktion des FGFR4 wird durch lösliche Liganden, die FGFs, stimuliert. Die häufig starke Aktivität des FGFR4 Gens in Tumorgeweben lässt eine Funktion des FGFR4 in der Tumorentwicklung vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine Mutation in der Transmembrandomäne des FGFR4 nachgewiesen, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 führt (Gly388Arg). Diese Mutation ist homolog zu der seltenen GlycinIn der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der Rezeptor Tyrosin Kinase (RTK) FGFR4 (Fibroblast Growth Factor Rezeptor 4) in der Tumorentwicklung untersucht. Der FGFR4 besteht aus einer extrazellulären ligandenbindenen Domäne, einer einspännigen Transmembrandomäne und einem intrazellulären Bereich, der neben zwei Kinasedomänen auch eine Reihe von Bindungsmotiven für Adapterproteine mit und ohne enzymatische Aktivität enthält. Die Tyrosinkinase Funktion des FGFR4 wird durch lösliche Liganden, die FGFs, stimuliert. Die häufig starke Aktivität des FGFR4 Gens in Tumorgeweben lässt eine Funktion des FGFR4 in der Tumorentwicklung vermuten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal eine Mutation in der Transmembrandomäne des FGFR4 nachgewiesen, die zu einem Austausch der hydrophoben Aminosäure Glycin gegen die hydrophile, stark geladene Aminosäure Arginin an Position 388 führt (Gly388Arg). Diese Mutation ist homolog zu der seltenen Glycin dem Wildtyprezeptor (Gly388) und der Rezeptormutante. Die in vitro Kinase Assays der MAP-Kinase ERK2, die nach FGFR4 Stimulierung in L6 Myoblasten aktiviert wird, bestätigen diese Ergebnisse. In der Fähigkeit zu migrieren, unterschieden sich Brustkrebszellen, die stabil den mutierten FGFR4 exprimierten, dagegen deutlich von vergleichbaren Zellen, die den Wildtyprezeptor exprimierten. Daneben ergab die cDNA Array Analyse in den oben genannten Brustkrebszelllininen unterschiedliche Expressionsstärken für eine Reihe von Genen, die in der Tumorentwicklung eine bedeutende Rolle spielen. Des weiteren gelang es mit einem Fusionsprotein zwischen der extrazellulären FGFR4 Domäne und dem Glutathion-S-Transferase (GST) Protein eine ungewöhnliche Funktion des FGFR4 in der Zelladhäsion nachzuweisen. Nur wenige RTKs waren bis dahin als Vermittler von Zelladhäsion bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass verschiedene Zelltypen exklusiv auf Zellkulturplatten, die mit dem FGFR4-GST Fusionsprotein beschichtet sind, adherieren können. Im Gegensatz zu früheren Befunden ist dieser Prozess abhängig von zweiwertigen Kationen und kann nicht durch einen Überschuss von löslichen Heparin blockiert werden. Weiterhin konnten die spezifische Bindung von zwei Proteinen, deren Identität noch unbekannt ist, an das FGFR4-GST Fusionsprotein nachgewiesen werden, so dass von einer direkten Wechselwirkung zwischen der extrazellulären Domäne des FGFR4 mit weiteren Molekülen ausgegangen werden kann. Die Untersuchungen ergaben außerdem Hinweise auf eine Intgrin-vermittelte Signalkette, die während der Adhesion an FGFR4-GST induziert wird. Es wurde sowohl die Zunahme der Tyrosinphosphorylierung der “Focal Adhesion Kinase” (FAK) als auch die Aktivierung der MAP-Kinasen ERK2 und JNK gezeigt. Die hier erarbeiteten Daten ermöglichen also, eine Funktion des FGFR4 als morpho-regulatorisches Protein zu diskutieren. Darüberhinaus erlauben die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse erstmals eine Diskussion über die Funktion von Sequenzvarianten im FGFR4 in der humanen Pathogenese und insbesondere in der Tumorprogression. Sie zeigen, dass das vererbte FGFR4 Arg388 Allel mit einer schlechten klinischen Prognose in Brust- und Darmkrebs assoziiert ist und weisen auf einen Mechanismus hin, in dem der klinische Verlauf von Tumorerkrankungen durch vererbliche Parameter moduliert wird.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.

Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden für die in vivo Beobachtung dynamischer Prozesse in der Amöbe Dictyostelium discoideum verwendet. Um diese Vorgänge sichtbar zu machen, wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter von Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von 4D-Mikroskopie und Mehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und die intrazelluläre Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und analysiert werden. Es wurde eine Methode entwickelt, spektral unterschiedliche GFP-Varianten im Konfokalmikroskop simultan zu detektieren und verläßlich zu trennen. Aufgrund der Anregungswellenlänge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs zur Erfassung beider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur schonenden Beobachtung lebender Zellen auch über längere Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen darüber hinaus die Verwendung dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer 4D-Messung. In D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen) während der Migration und der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter für spezifische Genexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich der Spitze in den Prespore-Bereich zurück. Dieses Zurückfallen in der zentralen Längsachse läßt sich durch die Organisation der Spitzenregion durch cAMP-Spiralwellen mit einem Zentrum in der Längsachse erklären. Prestalk-Zellen gelangen über diesen Weg aus der Spitze in den Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich sind ehemalige Prestalk-Zellen gemeinsam mit den Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs maßgeblich beteiligt. Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort rotierende Zentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien einzelner Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch cAMPSignale. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es innerhalb dieser Zellen Gruppen gibt, die zu unterschiedlichen Zeiten in neue Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen Spitzen wieder im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem Prespore-Bereich kommen, während pst0-Zellen im gesamten Prestalk-Bereich zu finden sind. Artspezifische Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten wurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Sortierung von D. discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den Aggregationsströmen anfängt und im Mound abgeschlossen wird. Die Trennung erfolgt über Unterschiede in der Zelladhäsion. Erheblich beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang durch die gerichtete chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei den sich in den Zellströmen schneller bewegenden D. mucoroides-Zellen zu einer Anreicherung im Moundzentrum führt. Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam für die artspezifische Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In Mischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht die Aussortierung über die Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe für die Chemotaxis, so daß die Arten getrennt aggregieren. Es konnte gezeigt werden, daß diese getrennte Aggregation sehr spezifisch ist und es dennoch zu einer Interaktion zwischen D. discoideum und fortgeschrittenen Polysphondylium-Aggregaten kommt, da in Polysphondylium in späten Aggregationsphasen cAMP für die interzelluläre Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird von Polysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert. Severin ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das F-Aktin-Filamente fragmentiert und an das (+)-Ende des entstehenden Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurde die intrazelluläre Lokalisierung dieses Proteins in vivo während einer Vielzahl zellulärer Aktivitäten untersucht. Severin ist in den aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex angereichert. Obwohl die Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen Phasen der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von Severin in allen Stadien primär von der Bildung neuer Zellfortsätze trennbar. Die Anreicherung von Severin ist hingegen mit der Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Fortsätze assoziiert. Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen auf das Zytoskelett einzelner Zellen in Aggregationsströmen ausführlich dargestellt.