Podcasts about hyperpolarisation

Wie funktioniert Sehen? Schau ins Skript (Seitenzahl im Verzeichnis!) und lerne mit: - Was passiert mit den Pigmenten im Stäbchen? - Was passiert bei der Fototransduktion? - Wie kommt es vom Lichtreiz zur Wahrnehmung? Fachbegriffe: Stäbchen, Lichtreiz, Retina, Fototransduktion, Rezeptorzelle, Depolarisation, Hyperpolarisation, Membranpotential, Rhodopsin, Metarhodopsin II, Retinal, Transducin, Natriumionenkanäle, cGMP, ... Fragen und Feedback? Schreib an biologopodcast@gmail.com Instagram: @biologopodcast Bewerte gern bei applepodcast Keep learning!

Hier das SKRIPT. Frage: was passiert bei der Schreckkrankheit? Dazu müssen wir klären: 1) Was ist ein postsynaptisches Potential (IPSP vs. EPSP)? 2) Was hat es mit digitalen und analogen Umwandlungen auf sich? 3) Was ist zeitliche und räumliche Summation? Fachbegriffe: EPSP, IPSP, Depolarisation, Hyperpolarisation, exzitatorsich, inhibitorisch, Glycin, Acetylcholin, GABA, Axonhügel, präsynaptisch, postsynaptisch, zeitliche Summation, räumliche Summation, Integration, Schwellenwert, ... Feedback/Wünsche: biologopodcast@gmail.com oder @biologopodcast bei Instagram.

Folge 024 - Das Aktionspotential | Neurobiologie Teil 4 Show Notes: Bitte unterstützt den Biologie Passion Podcast finanziell ➤ paypal.me/biologiepassionpdcst Hier gehts zum zugehörigen Blogartikel auf meiner Webseite. Wenn dir die Podcastfolge gefallen hat, würde mich eine kurze Bewertung auf iTunes freuen. Trag dich in meinen Newsletter ein, wenn du über neue Podcastfolgen informiert werden willst. Vielen Dank fürs Zuhören!

Gerade in der heutigen Kommunikationsgesellschaft führen Hörstörungen häufig zu einem Verlust der Arbeitsfähigkeit und Lebensqualität. Nicht selten enden sie in einer sozialen Isolation der Patienten. Bisher sind kausale Therapiemaßnahmen zur Behandlung einer Innenohrschwerhörigkeit nur in begrenztem Umfang möglich. Die wichtigste Therapieoption besteht darin, den Patienten mit einem Hörgerät zu versorgen. Nach einer Mitteilung der Bundesinnung der Hörgeräteakustiker wird die Zahl der ca. 2,5 Millionen in Deutschland lebenden Hörgeräteträger aufgrund der demographischen Entwicklung weiter zunehmen. Der Prävention und Behandlung von Innenohrerkrankungen kommt somit aus sozioökonomischer, aber auch aus klinischer Sicht eine große Bedeutung zu. Deshalb ist eine intensive Erforschung der Pathophysiologie von Innenohrstörungen notwendig. Pathogenetisch spielen neben Ursachen wie Hypoxie, Lärm und Hypertonie auch metabolische Erkrankungen wie eine Hypercholesterinämie eine auslösende Rolle. Erste Hinweise auf die schädigende Wirkung von Cholesterin auf das Innenohr ergab bereits im Jahr 1962 eine Untersuchung von Samuel Rosen, welcher die Prevalenz der Presbyakusis bei dem sudanesischen Stamm der Mabaan mit einer Kontrollgruppe aus den USA verglich. Das verminderte Auftreten der Altersschwerhörigkeit bei den Mabaan führte er unter anderem auf eine cholesterinarme Ernährung zurück. Zahlreiche epidemiologische, klinische und experimentelle Studien bestätigen diesen Zusammenhang und weisen unter anderem auch auf eine direkte schädigende Wirkung von Cholesterin auf die Funktion der äußeren Haarzellen hin. Die äußeren Haarzellen sind in der Lage, durch Längenänderungen Schallsignale zu verstärken und die Sensitivität des Corti-Organs zu erhöhen. Dieser Vorgang wird aufgrund seiner Abhängigkeit vom Membranpotenzial auch Elektromotilität genannt. Er wird durch Konformationsänderungen des Motorproteins Prestin, welches in der Zellmembran der äußeren Haarzellen lokalisiert ist, ausgelöst. Bei einer Depolarisation kommt es zur Verkürzung, eine Hyperpolarisation führt zur Verlängerung der Zellen. Obwohl zahlreiche Studien vorliegen, ist die genaue Wirkungsweise von Cholesterin auf die äußeren Haarzellen noch weitgehend ungeklärt und Inhalt kontrovers geführter Diskussionen. Die zentrale Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss von Cholesterin auf die Motilität von äußeren Haarzellen qualitativ und quantitativ zu untersuchen. Dazu wurden V. Zusammenfassung und Ausblick 65 die Längenänderungen von insgesamt 77 Zellen bei unterschiedlichen extrazellulären und intrazellulären Bedingungen gemessen. Die äußeren Haarzellen wurden aus der Cochlea von Meerschweinchen frei präpariert und mit der Patch-Clamp-Technik zu Änderungen der Zelllänge stimuliert. Zur Aufzeichnung dieser Bewegungen diente die Videomikroskopie auf Subpixelniveau, die eine Auflösung im Nanometerbereich aufweist. Die Zellen wurden in mehrere Versuchsreihen aufgeteilt. In einer Versuchsreihe wurden die Längenänderungen von 12 äußeren Haarzellen bei physiologischen intra- und extrazellulären Bedingungen gemessen. Diese Zellen dienten als Kontrollgruppe für die weiteren Experimente. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe konnten das Bewegungsmuster der Zellen, das in der Literatur beschrieben worden ist, bestätigen. Es zeigte sich ein asymmetrischer Verlauf der Bewegungen in Depolarisations- und Hyperpolarisationsrichtung mit einer maximalen Längenänderung von ca. 1,5 μm. Um den Einfluss von extrazellulärem Cholesterin auf die Motilität der äußeren Haarzellen zu quantifizieren, wurden die Zellen in Abhängigkeit von der Cholesterinkonzentration untersucht. Insgesamt wurden die Längenänderungen von 12 Zellen mit 0,1 mmol/l, von 10 Zellen mit 0,5 mmol/l, von 12 Zellen mit 1 mmol/l und von 7 Zellen mit 1,5 mmol/l Cholesterin gemessen. Das Versuchsergebnis ergab einen konzentrationsabhängigen Einfluss von Cholesterin auf die Elektromotilität von äußeren Haarzellen. Dieser Effekt war ab einer Cholesterinkonzentration von 1,0 mmol/l mit einem Motilitätsrückgang um 29 % bei der maximalen Verkürzung und um 9 % bei der maximalen Verlängerung signifikant. Gleichzeitig zeigte sich eine Verschiebung der Spannung Vpkc in die hyperpolarisierende Richtung. Vpkc entspricht der Spannung, bei der am effektivsten eine Bewegung der äußeren Haarzellen erzeugt wird. Die Verschiebung von Vpkc wurde in früheren Studien als Stellschraube für die Regulation der Elektromotilität gesehen. Mit diesen Ergebnissen konnte die vorliegende Studie nicht nur den seit Jahrzehnten diskutierten schädigenden Einfluss von Cholesterin auf die äußeren Haarzellen nachweisen, sondern auch Hinweise auf eine Regulationsfunktion von Cholesterin bei der Elektromotilität geben. Der Einfluss von Cholesterin auf die Elektromotilität beruht sowohl auf Wirkungen auf die passive Zellmembran, als auch auf das Motorprotein Prestin. Eine weitere Versuchsreihe sollte Hinweise liefern, ob der Einfluss von Cholesterin eher das Ergebnis von Auswirkungen auf die passiven Eigenschaften der Zellmembran darstellt oder mehr auf einem Effekt auf die Funktion des Motorproteins Prestin beruht. Dazu wurde bei 12 Zellen durch Reduktion der intrazellulären Chloridkonzentration die Prestinfunktion 66 V. Zusammenfassung und Ausblick auf die Hälfte verringert und extrazellulär 1 mmol/l wasserlösliches Cholesterin zugegeben. 12 Zellen mit halbmaximaler Prestinfunktion, bei denen die extrazelluläre Lösung kein Cholesterin enthielt, dienten als Vergleichsgruppe. Bei den mit einer Cholesterinkonzentration von 1 mmol/l behandelten Zellen mit halbmaximaler Prestinfunktion zeigte sich ein Motilitätsrückgang um 18 % bei der maximalen Verkürzung und um 5 % bei der maximalen Verlängerung im Vergleich zu den Zellen mit halbmaximaler Prestinfunktion ohne Cholesterinzugabe. Aus dem Vergleich dieser beiden Zellgruppen mit den Zellen, die nur mit 1,0 mmol/l Cholesterin behandelt wurden, konnte ermittelt werden, dass Cholesterin stärker auf das Motorprotein Prestin als auf die physikalischen Eigenschaften der Zellmembran wirkt. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die in mehreren Studien diskutierte Vermutung, dass zwischen einer Hypercholesterinämie und Hörschädigungen ein Zusammenhang besteht. Sie ermöglichen ein besseres Verständnis der Wirkung von Cholesterin auf die Hörfunktion. Als präventive Maßnahme könnte neben der Vermeidung von Lärmbelastung auch die rechtzeitige Diagnose und Therapie einer Hypercholesterinämie sein. In Studien wurde ein therapeutischer Effekt einer Senkung des Cholesterinspiegels bei einem Hörsturz nachgewiesen. Diese klinischen Beobachtungen scheinen bei Betrachtung der Ergebnisse dieser Arbeit plausibel zu sein. Durch Senkung des Cholesterinspiegels besteht womöglich eine gute Chance, erstmals eine suffiziente Therapie des Hörsturzes zu entwickeln. Die genauen Mechanismen der Wirkung von Cholesterin auf die Zellmembran bzw. auf das Motorprotein Prestin sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Die in dieser Arbeit beschriebenen Hinweise auf eine Regulationsfunktion von Cholesterin bei der Motilität von äußeren Haarzellen bieten durchaus neue Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen auf diesem Forschungsgebiet. Durch das Verständnis grundlegender Pathomechanismen ergeben sich in Zukunft neue Möglichkeiten zur Prävention und Therapie von Erkrankungen des Innenohres wie Altersschwerhörigkeit, Hörsturz und Tinnitus. Angesichts der steigenden Anzahl betroffener Patienten und der überragenden Bedeutung des Gehörsinns für das soziale Zusammenleben sind Erkenntnisse auf diesem Gebiet von großer klinischer Bedeutung

Gefäßzellen und Gefäßabschnitte in Arteriolen der Mikrozirkulation reagieren auf endotheliale Autakoide, Gewebsmetabolite und transmurale Druckänderungen nicht als isolierte Einheiten, sondern in koordinierter Art und Weise, was u.a. auf der Ausbreitung von Membranpotentialänderungen über Gap-Junctions entlang der glatten Muskelzellschicht und dem Endothel beruht. Dies ermöglicht die Koordination des Gefäßtonus in parallel und hintereinander liegenden Gefäßabschnitten, was zur aufsteigenden Vasodilatation und der Zunahme der Skelettmuskeldurchblutung bei Arbeit beiträgt. Diese von Nerven unabhängige intra- und intervaskuläre Kommunikation zeigt sich auch bei lokalisierter Stimulation mit bestimmten vasoaktiven Substanzen durch eine sich weit über den Ort der direkten Wirkung schlagartig ausbreitende Gefäßreaktion (conducted vasomotor response). Um die Auslöser von fortgeleiteten Gefäßreaktionen zu untersuchen, wurden Arteriolen des Cremastermuskels in anästhesierten Goldhamstern mittels einer Mikropipette mit einem Mikrobolus (

Verschiedene Wirkmechanismen des endothelialen Autacoids NO sind an unterschiedlichen, experimentellen Modellen beschrieben worden. Es ist aber noch nicht abschließend geklärt, welche Wirkmechanismen von NO in den Widerstandsgefäßen des Kreislaufs (den kleinen Arterien und Arteriolen)tatsächlich funktionell bedeutsam sind. In der vorliegenden Arbeit sollten daher die Wirkmechanismen von NO am Modell der isolierten Widerstandsarterie des Hamsters untersucht werden. Kleine Arterien (Durchmesser 17435µm) aus dem M. quadriceps weiblicher syrischer Goldhamster wurden mikrochirugisch präpariert, in einem Organbad mit Glasmikropipetten kanüliert und dann an beiden Enden mit monofilem Faden druck- und flüssigkeitsdicht befestigt. Im Gefäß wurde ein hydrostatischer Druck von 45mmHg erzeugt. Die glattmuskuläre Ca2+ - Konzentration wurde mit der Fura-2 Methode und der Außendurchmesser des Gefäßes mittels eines Videosystems bestimmt. Zu Beginn des Versuchs wurden die Gefäße mit Noradrenalin vorkontrahiert. Der NO-Donator SNAP induzierte in niedrigen Konzentrationen (0,1 µmol/l) eine langsame Dilatation des Gefäßes ohne signifikante Beeinflussung der glattmuskulären Ca2+ - Konzentration. In niedrigen Dosen dilatiert NO isolierte Widerstandsarterien also nur durch calciumunabhängige Mechanismen, wahrscheinlich durch eine Calciumdesensitivierung des kontraktilen Apparates. Höhere Dosen des NO Donators SNAP (100µmol/l) führten hingegen zu einer zusätzlichen, initialen, schnellen Komponente der Dilatation, die von einem transienten Abfall der Ca2+ - Konzentration ausgelöst wurde. Obwohl die intrazelluläre Ca2+ - Konzentration bereits nach kurzer Zeit den Ausgangswert wieder erreicht hatte, dilatierte das Gefäß weiter. Der zeitliche Verlauf dieser sich anschließenden, zweiten, langsamen Komponente zeigte dabei in Bezug auf Kinetik und Amplitude Ähnlichkeiten zu der langsamen Dilatation, wie sie bereits bei Verwendung von niedrigen SNAP-Konzentrationen beobachtet wurde. Der transiente Abfall der Ca2+ - Konzentration und die damit einhergehende, initiale, schnelle Komponente der Dilatation waren dosisabhängig und vollständig durch Charybdotoxin hemmbar, das hauptsächlich calciumabhängige Kaliumkanäle (BKCa-Kanäle) blockiert. Versuche mit dem L-Typ Calciumkanalblocker Felodipin stützen die Hypothese, daß eine NO-induzierte Aktivierung von calciumabhängigen Kaliumkanälen zur Hyperpolarisation der Zellmembran und schließlich zu einer verringerten Öffnungswahrscheinlichkeit der L-Typ-Calciumkanäle und damit zu einem Abfall des intrazellulären Calciumspiegels führt. Die langsame Komponente der Dilatation, ohne Änderung der intrazellulären Ca2+ - Konzentration, wurde hingegen durch Charybdotoxin nicht beeinflußt. Der transiente Ca2+ - Abfall und die schnelle Komponente der Dilatation kommen also wahrscheinlich durch die Aktivierung von hyperpolarisierenden, calciumabhängigen Kaliumkanälen zustande. Beide Komponenten der NO-induzierten Dilatation waren vollständig durch ODQ, einen Inhibitor der löslichen Guanylatcyclase (sGC), hemmbar. Zwar ist ODQ nicht vollständig spezifisch für die sGC, aber die Versuche legen den Schluss nahe, dass in isolierten Widerstandsarterien des Hamsters die NO-induzierten Calciumabfälle und Dilatationen durch cGMP vermittelt werden. Die Hypothese, dass der „Endothelium Derived Hyperpolarizing Factor“ EDHF eine Cytochrom P450 abhängig gebildete Epoxyeicosatrien-säure (EET) ist, wurde inzwischen durch eine ganze Reihe von pharmakologischen und molekularbiologischen Experimenten untermauert. Allerdings kann auch NO, wie oben beschrieben, glatte Gefäßmuskelzellen durch Hyperpolarisation relaxieren und der Beitrag von EDHF zur agonisteninduzierten Dilatation hängt vom untersuchten Stromgebiet, der Spezies und vor allem der Gefäßgröße ab. Welche Rolle EDHF in den Widerstandsgefäßen des Kreislaufs spielt und über welche zellulären Mechanismen die Wirkungen von EDHF vermittelt werden, ist noch nicht abschließend geklärt. Daher sollten im zweiten Teil der vorliegen-den Arbeit die Wirkmechanismen von EDHF an isolierten, kleinen Widerstandsarterien charakterisiert werden und mit denen des zuvor untersuchten NO verglichen werden. Während auch bei hohen Dosen von NO ein nur transienter Ca2+ - Abfall beobachtet wurde, löste EDHF einen lang anhaltenden Ca2+ - Abfall unter das Ausgangsniveau aus. Der EDHF-induzierte Ca2+ - Abfall und die Dilatation wurden durch ODQ, einen Inhibitor der löslichen Guanylatcyclase, nicht beeinflusst. Während die NO-induzierten Dilatationen im Modell der isolierten Widerstandsarterie des Hamsters vermutlich aus-schließlich durch cGMP vermittelt werden, sind die Effekte von EDHF cGMP-unabhängig. Die beobachteten Effekte von NO und EDHF unterscheiden sich in diesem Modell also grundlegend, denn sie haben verschiedene Charakteristiken und werden durch die Aktivierung von zwei unterschiedlichen Signalketten vermittelt.

Die HCN Kanäle sind als molekulare Komponente des Ih Stromes maßgeblich an der Entstehung rhythmischer Erregung beteiligt. Die Genfamilie besteht aus 4 Mitgliedern (HCN1-HCN4), die durch Hyperpolarisation aktiviert und von zyklischen Nukleotiden moduliert werden und sowohl Natrium als auch Kalium leiten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen mHCN2 Untereinheiten sowie mit Proteinen aus einer cDNA-Bibliothek aus Maus-Herz untersucht. Außerdem wurde der Frage nachgegangen, ob die Src-Kinase mit mHCN2 interagiert.

Im Verlaufe der zellulären Reifung wandern (migrieren) unreife Nervenzellen von der Germinalschicht in ihre Zielschicht, in der sie nach dem Auswachsen von Dendriten synaptische Verbindungen bilden. Diese Reifungsprozesse gehen mit Anstiegen der intrazellulären Kalziumkonzentration, sogenannten Kalziumsignalen, einher. Während die Neurotransmitter GABA und Glyzin Nervenzellen des adulten Gehirns hyperpolarisieren und dadurch Aktivität hemmen, depolarisieren sie paradoxerweise unreife Nervenzellen und rufen dadurch Kalziumsignale hervor. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rolle und der Mechanismus dieser Signale während der Nervenzellreifung mit Hilfe hochauflösender Kalzium- und Chloridfluoreszenzmessungen in Gehirnschnitten und in Zebrafischlarven untersucht. Es zeigte sich, dass GABA im Kleinhirn robuste Kalziumsignale sowohl in Körnerzellen während und nach Vollendung der Migration als auch in Purkinjezellen in einer Phase starken dendritischen Wachstums und ausgeprägter Synapsenbildung hervorruft. Als Mechanismus konnte in unreifen Nervenzellen ein Chloridausstrom identifiziert werden, der zu einer Depolarisation mit nachfolgender Aktivierung spannungsabhängiger Kalziumkanäle führt. Im Gegensatz dazu ruft GABA in reifen Nervenzellen einen Chlorideinstrom und dadurch eine Hemmung von Aktivität durch eine Hyperpolarisation der Zellmembran hervor. Neben der Untersuchung in Gehirnschnitten gelang in der vorliegenden Arbeit erstmals der Nachweis GABA-vermittelter Kalziumsignale in intakten Lebewesen. Dabei evozierten GABA und Glyzin Kalziumsignale in Rückenmarksneuronen von Zebrafischlarven zu einem Zeitpunkt, zu dem sie die ersten koordinierten Schwimmbewegungen vollzogen. Insgesamt zeigte sich, dass GABA, im Gegensatz zu seiner hemmenden Wirkung im adulten Gehirn, in unreifen Nervenzellen, die sich in einer Phase dramatischer morphologischer und funktioneller Veränderungen befinden, Kalziumsignale hervorruft. In Anbetracht der Bedeutung von Kalziumsignalen für die Reifung des Gehirns sprechen diese Ergebnisse für eine Rolle von GABA als trophischer Faktor.

Die Anpassung der Gewebsdurchblutung an die unterschiedlichen Bedarfssituationen, setzt ein koordiniertes Verhalten der Gefäße im mikrovaskulären Gefäßnetz voraus. Diese Koordination der vasomotorischen Reaktionen im mikrovaskulären Gefäßsystem, ist möglicherweise auf die interzelluläre Kommunikation der Endothelzellen angewiesen. Die Endothelzellen und glattten Muskelzellen der Blutgefäße sind über Gap Junctions gekoppelt, auch eine myoendotheliale Kopplung wird diskutiert. Dadurch können Signale in Form von Ionen (und damit Änderungen des Membranpotentials) oder kleinen Moleküle über solche interzellulären Kanäle entlang der Endothelzellschicht weitergegeben werden. Völlig unbekannt ist aber, ob die Permeabilität dieser endothelialen Gap Junctions reguliert wird. Deshalb wurde in dieser Arbeit untersucht, ob vom Endothel gebildete lokal wirksame Gewebshormone (Autakoide, wie NO und Prostacyclin) die Durchlässigkeit der Gap Junctions beeinflussen. Hierzu wurde in konfluenten Kulturen von humanen umbilikalvenösen Endothelzellen (n=190) die Ausbreitung der Farbstoffe Carboxyfluoresein und Calcein nach Injektion in eine einzelne Endothelzelle in die benachbarten Endothelzellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß der injizierte Farbstoff tatsächlich nur über interzelluläre Kanäle von einer Zelle zur nächsten gelangt. Diese Kanäle werden von Connexinen gebildet, denn ein Peptid, das das Aneinanderdocken der Connexine verhindert, reduzierte die Ausbreitung des fluoreszierenden Farbstoffs. Daher kann mit dieser Methode tatsächlich die Kopplung der Zellen über Gap Junctions untersucht werden. Die erhobenen Daten zeigen, daß die Anzahl der fluoreszierenden Zellen nach Hemmung der NO-Synthase mit Nw-nitro-L-Arginin (L-NA, 30µmol/L) um bis zu 29% zunahm, während die anschließende erneute Freisetzung von NO durch zwei differente NO-Donoren (SNAP bzw. SNP, 1 µmol/L) die Zahl der fluoreszierenden Zellen wieder auf den Ausgangswert reduzierte oder sogar unterhalb den, der unbehandelten Kontrollzellen senkte. Diese durch NO hervorgerufene Wirkung blieb in Anwesenheit des Hemmstoffes der löslichen Guanylatcyclase ODQ (10 µmol/L) oder der Radikalfänger Tiron und Superoxiddismutase unverändert. Dies weist daraufhin, daß es sich bei dieser durch NO hervorgerufenen Hemmung um einen direkten Effekt von NO handelt, der weder über die Bildung von cGMP noch über eine gesteigerte Peroxynitritproduktion vermittelt wird. Auch eine Hyperpolarisation der Endothelzellen durch den Aktivator von KATP-Kanälen HOE234 (1 µmol/L) hatte keinen Einfluß auf die Kopplung der Zellen. Im Gegensatz dazu hatte NO in Anwesenheit der Hemmstoffe der Tyrosinphosphatase Orthovanadat (100 µmol/L) und Phenylarsinoxid (1 µmol/L) keinen Einfluß mehr auf die endotheliale Kommunikation via Gap Junctions. Dagegen führte die Behandlung der Zellen mit dem Tyrosinkinase Inhibitor Genistein (100 µmol/L) zu einer deutlichen Reduktion der endothelialen Kopplung (-14%), die mit der Wirkung von NO vergleichbar war. Daraus läßt sich schließen, daß die durch NO hervorgerufene Wirkung auf die interzelulläre Kommunikation über eine Verminderung der Tyrosinphosphorylierung vermittelt zu werden scheint. Außerdem zeigen diese Daten, daß Prostacyclin die endotheliale Kopplung signifikant steigert, und das diese Wirkung über das gebildete cAMP vermittelt wird. Denn nicht nur das Prostacyclin Analogon Iloprost (1 µmol/L), sondern auch der Aktivator der Adenylatcyclase Forskolin (30 µmol/L), verbesserte die Ausbreitung des Farbstoffes signifikant . Schließlich zeigen die Ergebnisse auch, daß die beiden vom Endothel gebildeten Substanzen sich gegenseitig in ihrer Wirkung auf die endothelialen Gap Junctions beeinflussen können. Die erhobenen Daten zeigen erstmals eine Rolle von NO und Prostacyclin in der Regulation der Permeabilität endothelialer Gap Junctions. Diese Regulationsmöglichkeit und die Auswirkungen einer vermehrten oder verminderten Kopplung der Endothelzellen wirft zahlreiche neue Fragestellungen auf z. B. hinsichtlich der Pathophysiologie der coronaren Herzkrankheit oder auch des arteriellen Hypertonus und bietet damit auch die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten.

Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie / Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti - oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische, anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H - Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - - Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken, welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin – Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt. Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet. Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion, die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase, mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde (Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal - Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - - Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60% ) signifikant gesteigert (n=23, p