Podcasts about chromophor

Die moderne Anrege-Abfrage-Spektroskopie (Pump-Probe-Spektroskopie) ermöglicht es, die Mehrheit der relevanten physikalischen und chemischen Prozesse zeitaufgelöst zu messen. Die Pump-Probe-Spektroskopie wird in der fundamentalen, industriellen, biomedizinischen und Umweltforschung angewendet, um ein breites Spektrum von komplizierten Substanzen zu untersuchen. Diese Dissertation demonstriert das große Potenzial der transienten Spektroskopie für die Untersuchung von ultraschnellen chemischen Reaktionen komplizierter organischer Moleküler (Allylverbindungen). Auch einige praktische Vorschläge zur Verbesserung der spektroskopischen Messroutine werden gegeben. Die Bestimmung des Zeit-Nullpunkts (zeitlicher Überlapp) der Anrege- und Abfragepulse ist sehr wichtige und keine triviale Aufgabe in einem Anrege-Abfrage-Experiment. Im Kapitel 3 werden die Ergebnisse der Untersuchung von bekannten Laserfarbstoffen und anderen Substanzen, die erfolgreich zur Zeit-Nullpunkt Kalibrierung benutzt werden können, beschrieben. In den Kapiteln 4 und 5 werden die Ergebnisse der spektroskopischen Untersuchung von einigen interessanten Allylsystemen präsentiert. Es ist uns gelungen zu zeigen, dass die spezifische molekulare Einheit (die Styrolgruppe) als Chromophor dient, was während der UV-Anregung von Allylen mit Kurzpuls-Lasern zur Lokalisierung der Anregung auf der Styrolgruppe führt. Durch die Benutzung dieser Eigenschaft und den Wechsel von Abgangsgruppen und Substituenten haben wir detailiert den Bindungsbruch und die geminate Ionenpaar-Rekombination von unsubstituierten, symmetrisch und unsymmetrisch substituierten Allylsystemen untersucht.

Photoinduzierte Isomerisierungsreaktionen von Molekülen mit Kohlenstoff-Doppelbindungen sind an zahlreichen wichtigen biologischen und biochemischen Prozessen beteiligt. Ein grundlegendes Verständnis ihrer Reaktionsmechanismen ist deshalb von enormer Bedeutung. Wichtige Anwendungen von Molekülen mit Photoisomerisierungsreaktionen sind ihr Einsatz als mechanische Trigger in Peptidstrukturen oder als optische Datenspeicher. Diese Arbeit stellt eine spektroskopisch bisher unbearbeitete Verbindungsklasse vor, deren Struktur aus zwei verschiedenen Molekülen (Stilben, Thioindigo) zusammengesetzt ist. Die photochrome Verbindung Hemithioindigo isomerisiert im Pikosekundenzeitbereich. Im Rahmen der Arbeit kann gezeigt werden, dass spezielle Hemithioindigo-Derivate als Peptidschalter zum Studium initialer Faltungsprozesse eingesetzt werden können. Diese Demonstration erfordert die detaillierte spektroskopische Analyse der Z/E-Isomerisierungsreaktionen des Moleküls. Die vorliegende Arbeit behandelt dabei die folgenden Fragestellungen: 1) Nach welchem Mechanismus läuft die Z/E-Isomerisierung von Hemithioindigo ab?} Die Kombination verschiedener spektroskopischer Techniken (Absorptions-, Emissions- und Infrarotspektroskopie) erlaubt es, den kinetischen Ablauf der photoinduzierten Isomerisierungsreaktionen zu verfolgen. Unter Ausnutzung aller erzielten Resultate kann ein detailliertes Reaktionsmodell der Pikosekundenreaktionen Z-E und E-Z aufgestellt werden. 2) Wie können bestimmte Charakteristika der Isomerisierung, beispielsweise die Reaktionszeit, kontrolliert werden? Es wird gezeigt, dass die Reaktionsraten der photoinduzierten Isomerisierungen durch Potentialbarrieren im elektronisch angeregten Zustand bestimmt werden. Polare Substituenten erlauben es, die Barrierenhöhe systematisch zu verändern. Diese Effekte können sogar quantitativ durch das Konzept der linearen freien Enthalpie-Beziehung, der Hammett-Gleichung, beschrieben werden. Auf diese Weise kann die Reaktionsgeschwindigkeit kontrolliert und für unbekannte Substanzen vorhergesagt werden. Die Auswirkungen der Substituenten-Effekte auf unterschiedliche Parameter werden diskutiert und in ein gemeinsames Reaktionsmodell eingebettet. 3) Stilben vs. Thioindigo: Welcher Bestandteil dominiert die dynamischen Eigenschaften von Hemithioindigo? Zur Klärung dieser Frage werden die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit mit Reaktionsmodellen von Stilben und Thioindigo verglichen. Es wird sehr deutlich, dass Hemithioindigo und Stilben in vielen Eigenschaften große Ähnlichkeiten aufweisen. 4) Sind Hemithioindigo-Derivate zur Untersuchung initialer Faltungsvorgänge in Chromopeptiden geeignet? Die Arbeit zeigt, dass Hemithioindigo-Aminosäuren als ultraschnelle mechanische Schalter in Peptidsystemen eingesetzt werden können. Dazu werden verschiedene auf Hemithioindigo basierende Pseudoaminosäuren und Chromopeptide vorgestellt. Untersuchungen dieser Modellpeptide zeigen, dass Hemithioindigo auch in Peptidstrukturen eine Isomerisierung ausführt und das Chromophor als spektroskopische Sonde für Peptidfaltungsprozesse genutzt werden kann. Hemithioindigo stellt somit eine vielversprechende Alternative zu bekannten molekularen Schaltern, wie z. B. Azobenzolderivaten, dar.

The presented thesis has focused on the interactions between protein and pigments in photosynthetic membrane proteins, and the significance of these interactions in membrane protein assembly. The thesis has been divided into 3 Chapters, two are focused on the interactions between (bacterio)chlorophyll and proteins, and one is focused on the interactions, between carotenoid and proteins. In order to explore these interactions model proteins have been designed based on the peripheral antenna of Rhodobacter sphaeroides. In the model LH2 complexes, portions of the transmembrane helices, in particular, at the pigment binding sites, are replaced simplified alternating by alanine-leucine stretches. In the model sequence context, the effects of particular amino acids are amplified, and thus allow for convenient identification of potentially critical interaction motifs. This approach is employed to study the factors that contribute to pigment binding and pigment-protein assembly. To confirm the significance of thus identified motifs, they are subsequently also examined in the WT sequence context. In Chapter 3, it is shown that the residue at position -4 of the beta-subunit has a critical structural role for the proper organisation of the excitonically coupled BChl dimer in the antenna complex. In WT LH2, the residue at this position makes an H-bond to the C131 keto carbonyl group of one of the dimeric BChl molecules. The potential importance of such a H-bonding motif at the BChl/protein interface is demonstrated by use of the model LH2 in which the H-bond drives the folding and assembly of this transmembrane BChl-protein. The structural role of this residue at the BChl/protein interface is further demonstrated by the linear correlation between the LH2 spectral tuning and the residue-BChl contact. In Chapter 4, the aspect of diastereotopic ligation to the central Mg of BChl is explored, in particular, the consequences of BChl-ligation for folding and assembly of BChl-proteins. The analysis of H-bonding patterns in Chl-binding photosystem I and II showed that H-bonding at the (B)Chl-protein interface is structurally distinct depending on the ligation type. In essence, the C131 keto groups of (B)Chl ligated in the beta-position, contrary to those ligated in the betaposition, are frequently employed to associate Chl-helix units and thus involved in tertiary interactions. Disruption of such H-bonding interactions by site directed mutagenesis significantly altered the structural stability and assembly of the LH2 complex in the membrane. These findings suggest that H-bonding to -ligated bacteriochlorophyll is a key structural motif for the correct assembly of (bacterio)chlorophyll proteins. In Chapter 5, it is shown by mutational analysis of the carotenoid binding pocket of native and model LH2 complexes that the aromatic residues, in particular phenylalanine, are a key factor for carotenoid binding. The phenylalanine not only contributes to the stable Car binding but also lock the Car into a particular molecular configuration. The importance of aromatic residues in Car binding is further supported by statistical analyses of the plant photosystems which show that phenylalanine residues are frequently in the close vicinity of Car moelcules. This study provides, to the best of our knowledge, the first experimental evidence for the central role of aromatic residues in carotenoid binding and functional specification.

Mit Hilfe von spektroskopischen Messmethoden (Absorption, Circulardichroismus, Fluoreszenz) wurde die Entfaltung von Phycocyanin untersucht. Dabei diente der Chromophor als natürliche Sonde, zusätzlich wurde die Sekundärstruktur gemessen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Bedingungen der Untersuchungen festgelegt. Anschließend erfolgte die Entfaltung in steady-state Messungen mittels Harnstofftitration. Als drittes wurde die Kinetik der Entfaltung in 8 M Harnstoff untersucht. Daraus entwickelete sich eine Entfaltungsmodell, sowohl für das integrale Phycocyanin, wie auch für die Untereinheiten.

In der vorliegenden Arbeit wurden die diffusiven und elektrophoretischen Eigenschaften von Desoxyribonuklein-säure (DNA) und die Selbstassemblierung von DNA-Chromophor-Hybridmolekülen untersucht. Hierzu wurden, neben Gelelektrophorese und temperaturabhängigen Absorptionsmessungen, vor allem Fluoreszenz-Korre-lationsmethoden angewandt. Um quantitative Aussagen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) über die freie Diffusion von doppelsträngigen (ds) DNA-Fragmenten (75 bp - 1019 bp) in wässrigen Lösungen zu treffen, wurden laserleis-tungsabhängige Messungen durchgeführt. Diese Experimente ergaben, dass photophysikalische Effekte wie Triplettrelaxation, Isomerisations- oder Bleichprozesse die Autokorrelation entscheidend beeinflussen. Die Län-genabhängigkeit der gemessenen Diffusionskonstanten kann mit einem Stabmodell beschrieben werden, das für alle verwendeten dsDNA-Fragmente, die Konturlängen von bis zu 7 Persistenzlängen aufweisen, Gültigkeit besitzt. In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass kleinere Diffusionskonstanten lediglich bei der Zuga-be von zweiwertigen Salzen und bei hohen Salzstärken (> 0,1 M) beobachtet werden. Durch eine Komplexierung der dsDNA-Fragmente mit kationischen und neutralen Lipiden war es möglich, dsDNA in ein unpolares Lösungs-mittel (n-Alkan) zu überführen. Durch Messung der freien Diffusion konnte die Monodispersität von Lipid-dekorierten dsDNA-Fragmenten festgestellt werden. In der unpolaren Phase wurde eine kritische DNA-Konzentration (≈ 10 nM) festgestellt, die für die Stabilität der DNA-Lipid-Komplexe notwendig ist. In der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Müllen am Max-Planck-Institut für Polymerforschung in Mainz wurde ein DNA-Chromophor-Hybrid synthetisiert, bei dem an ein zentrales Farbstoffmolekül (Perylen) beidseitig jeweils ein kurzes ca. 20 Basen langes Oligonukleotid (ODN) kovalent angebunden wurde. FCS-Messungen, die die intrinsi-schen Fluoreszenzeigenschaften des Hybrids ausnutzten, konnten die Löslichkeit und Monodispersität der Hybride bzw. der Lipid-Hybrid-Komplexe sowohl in wässriger Phase als auch in Alkanen nachweisen. Durch eine geeigne-te Wahl der ODN-Sequenzen und der Anknüpfungsstelle der ODN an den Farbstoffkern entstanden durch Basen-paarung unterschiedliche, supramolekulare Strukturen, die in Gelelektrophorese-Experimenten nachgewiesen wur-den. Symmetrische DNA-Chromophor-Hybride können neben beliebig langen, linearen Ketten bei entsprechender Modifikation der Bausteine sandwichartige Dimere ausbilden. Asymmetrische Hybride ermöglichen den Aufbau linearer Strukturen definierter Länge (z. B. Dimere). Die thermodynamischen Eigenschaften der unterschiedlichen, supramolekularen Konstrukte wurden durch tempe-raturabhängige Absorptionsexperimente untersucht. Die Denaturierung der linearen kettenartigen Strukturen kann durch ein Zwei-Zustands-Modell beschrieben werden, dessen energetische Eigenschaften sehr gut mit denen der verwendeten ODN übereinstimmen. Im Fall der sandwichartigen Strukturen musste für den Schmelzübergang ein Drei-Zustands-Modell angenommen werden, wobei die eingebauten Farbstoffkerne eine energetische Wechselwir-kung vermittelten. Neben der freien Diffusion von dsDNA wurde deren elektrophoretische Drift untersucht. Dazu wurde ein Mikroe-lektrophorese-System entwickelt, bei dem die Drift im elektrischen Feld mittels zweier Laserfoki detektiert wird, die einen Abstand von ca. 5 µm aufweisen. Hierbei wirken die beiden Foki wie eine mikroskopische „Lichtschran-ke“; die Driftzeit wird dabei durch eine Orts-Orts-Kreuzkorrelation der beiden Fluoreszenzsignale zugänglich ge-macht. Auf Grund der methodisch bedingten sehr hohen Ortsauflösung ist es möglich, detaillierte Aussagen über die elektrophoretischen und elektroosmotischen Anteile an der Drift zu treffen. Experimente mit unterschiedlichen Feldstärken zeigen, dass eine Temperaturänderung durch den Eintrag von Joulscher Wärme nicht vernachlässigbar ist. Die elektrophoretische Mobilität ist in freier Lösung bei der verwendeten dsDNA unabhängig von der Frag-mentlänge und beträgt im Mittel 4,5∙10-4 cm2/Vs. Durch die gleichzeitige Messung von Drift und Diffusion konnte neben der elektrophoretischen Mobilität der dsDNA-Fragmente auch der Einfluss der hydrodynamischen Reibung ermittelt werden. Dadurch zeigt sich, dass neben der elektrostatischen Kraft und der Reibungskraft auch hydrody-namische Abschirmeffekte berücksichtigt werden müssen, um mit einem entsprechenden Kraftbild die Elektropho-rese-Experimente zu erklären. Im Gegensatz zu den Messungen in freier Lösung zeigt die elektrophoretische Drift der dsDNA-Fragmente in ei-nem physikalischen Polyethylenoxid-Netzwerk eine Längenabhängigkeit, die einem Potenzgesetz folgt (exp=-0,3). Berechnet man das Auflösungspotential der Elektrophorese-Experimente und vergleicht dies mit theoretischen Vorhersagen, so ergibt sich, dass die Diffusion im Vergleich zur Detektorausdehnung den deutlich stärker limitie-renden Faktor bezüglich des Auftrennpotentials unterschiedlich langer DNA darstellt. Die Auftrennung unter-schiedlich langer dsDNA-Fragmente in der Lösung konnte experimentell nachgewiesen werden, wobei die Auflö-sungsgrenze ungefähr 400 bp betrug. Die vorgestellten Ergebnisse belegen, dass FCS zur quantitativen Charakterisierung der Diffusion eingesetzt wer-den kann. Darüber hinaus erlaubt die simultane Messung von elektrophoretischer Drift und Diffusion mit Hilfe von Doppelfokus-FCS, die Bildung von supramolekularen Konstrukten im Bezug auf Ladung und Geometrie mit einer Zeitauflösung im Minutenbereich zu verfolgen.

Die zeitaufgel"oste Fluoreszenzspektroskopie stellt einen Zugang zur Dynamik von Molek"ulen dar. Da schnelle molekulare Vorg"ange, wie z.B. Isomerisierungen, innerhalb weniger 100 fs oder sogar darunter ablaufen k"onnen, erfordert ihre Untersuchung Techniken, die Zeitaufl"osungen in diesem Bereich erlauben. Elektronische Me"sverfahren erreichen derartige Zeitaufl"osungen jedoch nicht. Daher wird bei zeitaufgel"osten Fluoreszenzmessungen auf optische Methoden zur"uckgegriffen. In dieser Arbeit wird der Aufbau und die Weiterentwicklung eines Me"ssystems f"ur die zeitaufgel"oste Beobachtung von Fluoreszenzspektren molekularer Proben auf der Basis des Kerr-Effekts vorgestellt. Nach Anregung der Proben mit Laserimpulsen im ultravioletten oder sichtbaren Spektralbereich kann bei einer Zeitaufl"osung von ca. 100 fs gleichzeitig eine Messung "uber einen sehr breiten Spektralbereich vom nahen Ultravioletten bis ins nahe Infrarote durchgef"uhrt werden. Auf dieser Grundlage wird die Fluoreszenz einer Reihe von Proben untersucht, die nach optischer Anregung isomerisieren. Es handelt sich hierbei um die Molek"ule 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol, Bakteriorhodopsin und Proteorhodopsin. Das Push-Pull substituierte Azobenzolderivat 4-Nitro-4'-(Dimethylamino)-Azobenzol (NA) isomerisiert nach Photoanregung ebenso wie das unsubstituierte Azobenzol. Trotz stark unterschiedlicher elektronischer Struktur offenbart sich eine erstaunliche "Ahnlichkeit in der Dynamik beider Molek"ule. Beide Systeme besitzen in der Emission ein "ahnliches biphasisches Verhalten. F"ur NA wurden Zeitkonstanten von 0.08 ps und 0.8 ps und ein verz"ogerter Anstieg der Fluoreszenz im langwelligen Teil der Spektren bestimmt. Ein Unterschied zu unsubstituiertem Azobenzol besteht in den um etwa den Faktor drei k"urzeren Zeitkonstanten von NA. Der prim"are Schritt im Photozyklus von Bakteriorhodopsin (BR) besteht in der Isomerisierung des Retinalmolek"uls, welches als Chromophor dient. W"ahrend die Zeitskalen dieser Isomerisierung aus transienten Absorptionsexperimenten bereits bekannt sind, unterliegen die damit assoziierten molekularen Prozesse weiterhin einer kontroversen Diskussion. In den hier durchgef"uhrten Emissionsmessungen wurde neben den bereits bekannten Zeitkonstanten von < 0.15 ps und 0.45 ps f"ur den Fall niedriger Anregungsdichten das erste Mal ein dynamischer Stokes-Shift auf der Zeitskala von 0.2 ps entdeckt. Im Falle hoher Anregungsdichten k"onnen die deutlichen "Anderungen der zeitaufgel"osten Spektren Mehrphotonenabsorptionen zugeordnet werden. Erst vor kurzer Zeit wurde das Proteorhodopsin (PR) als neues Mitglied der Familie der rhodopsinartigen Proteine entdeckt. Ebenso wie bei BR ist der prim"are Schritt des Photozyklus die Isomerisierung seines Retinalmolek"uls. Hier wurden zum ersten Mal zeitaufgel"oste Fluoreszenzmessungen an PR durchgef"uhrt. Es wurde, wie auch bei BR, ein dynamischer Stokes-Shift gefunden. Im Gegensatz zu BR besitzt PR in der Emission jedoch drei Zeitkonstanten von < 0.15 ps, 0.45 ps und 4 ps. Die dritte Zeitkonstante kann mit einem spektral dunklen Zwischenzustand assoziiert werden.

1. Anthracenderivate Durch Suzuki-Kupplung gelingt es, ausgehend von 9,10-Dibrom-2,6-di-tert-butylanthracen 9,10-diarylsubstituierte Anthracenderivate mit Ausbeuten von 22 - 82 % herzustellen. Die Kupplung von halogensubstituerten Arylen erfolgt durch nucleophile Addition einer Arylgrignardverbindung an 2,6-Di-tert-butylanthrachinon mit anschließender wässriger Aufarbeitung und Reduktion. Eine zweite Gruppe von Anthracenderivaten wird durch Pyrimidin-Kondensation aus Amidinen und Vinamidiniumsalzen mit Ausbeuten von 60-80% synthetisiert. Anhand der Röntgen-Kristallstrukturanalysen kann die Lage der Oligophenylreste und der Einfluss von Packungseffekten auf die Festkörperfluoreszenz untersucht werden. Die Anthracengrundkörper sind im Kristall fischgrätenartig zueinander angeordnet. In beiden Verbindungen sind die Phenyl- bzw. Naphtylreste aus der Anthracenebene herausgedreht, so dass keine Konjugation mit dem Antracenchromophor stattfindet. Die Naphtylgruppen sind annähernd coplanar angeordnet, aber so zueinander versetzt, dass die p-Systeme benachbarter Naphtylsubstituenten nicht miteinander wechselwirken können. Die Absorptionsmaxima der Verbindungen sind im Vergleich zum unsubstituierten Anthracen nur geringfügig bathochrom verschoben, da die Arylsubstituenten im Grundzustand aufgrund des Verdrillungswinkels nicht mit den Chromophor konjugieren können. Die Emissionsbanden werden hingegen durch die Planarisierung der Struktur im angeregen Zustand stark vom elektronischen Charakter der Substituenten beeinflusst, so dass mit steigendem Akzeptorcharakter eine bathochrome Verschiebung erreicht wird. Die Pyrimidin-Derivate zeigen eine stärkere bathochrome Verschiebung der Emissionsbande als die einfachen, arylsubstituierten Verbindungen. 2. Fluoranthenderivate Die Oligophenylen-Derivate von Fluoranthen werden durch Suzuki-Kupplung ausgehend von 7,10-Di-(4-Bromphenyl)fluoranthen in Ausbeuten von 25 - 35 % hergestellt. Die Synthese der pyrimidinsubstituierten Fluoranthenderivaten gelingt durch Kondensation von Amidinen und Vinamidiniumsalzen ausgehend von Fluoranthen-7,10-dicarbonsäurediethylesterin Ausbeuten zwischen 27 und 65 %. Es wurde versucht die Löslichkeit dieser Verbindungen durch zusätzliche Substitution mit löslichkeitssteigernden Resten zu erhöhen. Die Einführung von 8,9-Dicarbonsäureestern durch Diels-Alder-Reaktionen und anschließender Suzuki-Kupplung führt zu Verbindungen, die allerdings keine erhöhte Löslichkeit in organischen Lösemitteln zeigen. Die Substitution von Fluoranthen an der Position 8 mit Alkylresten durch Diels-Alder-Reaktionen verläuft nur in äußerst schlechten Ausbeuten von 7 bzw. 12 %. Die Synthese von Carboxylimiden durch eine Diels-Alder-Reaktion mit Maleinsäureanhydrid, anschließender Oxidation und Umsetzung mit Aminen gefolgt von einer Suzuki-Kupplung liefert gut lösliche Produkte in guten Ausbeuten. Die phenylensubstituierten Verbindungen zeigen nur geringen Einluß der Substituenten auf das Hauptabsorptionsmaximum, da die Reste nicht in der Fluoranthenebene liegen. Die p-Bande ist deutlich bathochrom verschoben und die beta-Bande gewinnt merklich an Intensität. Die Lage der Emissionsmaxima verschiebt sich nur geringfügig bathochrom, da sich hier die Phenyle im angeregten Zustand nicht planarisieren und nur gering mit dem Fluoranthengrundkörper konjugieren. Die Absorptions- und Emissionsbanden von Fluoranthen-7,10-dicarbonitril sind aufgrund des elektronenziehenden Charakters der Nitrilgruppe stark hypsochrom verschoben. Ebenso verhalten sich die symmetrischen Pyrimidinderivate in der Absorption, deren Emission aber im Vergleich zum Dinitril bathochrom verschoben ist. Hier kann man davon ausgegangen, dass eine Planarisierung und somit eine Vergrößerung des p-Systems im angeregten Zustand eintritt. Dies wird durch die Absorption und Emission der unsymmetrischen Verbindungen bestätigt. Die Absorption der Isoindol-Derivate ist im Vergleich zu den entsprechenden Fluoranthenderivate stark langwellig verschoben. Die Spektren werden von den Substituenten an Position 9 nicht beeinflusst. Die an Position 3 substituierten Fluoranthenderivate werden durch Suzukireaktion an 3-Bromacenaphthenchinon und anschließender Kondensation der entstandenen Acenaphtenchinonderivate mit 1,2-Phenylendiamin zu Acenaphtho[1,2-b]chinoxalinderivaten synthetisiert. Die Benzo[k]fluoranthen-7,12-dicarbonitrile können durch Kondensation mit 1,2-Benzoldiacetonitril synthetisiert werden. Die Arylsubstitution an Position 3 der Fluoranthen bewirkt eine Verbreiterung und bathochrome Verschiebung der Aborptionsbande. Die Lage der Emissionsbande ist stark abhängig von der Donorwirkung des Phenylsubstituen.

Die α-Untereinheit des Phycoerythrocyanins ist ein Chromoprotein, das eine Rolle bei der Photosynthese von Mastigocladus laminosus, einem Cyanobakterium, spielt. Dieses Protein besitzt einen seltenen Gallenfarbstoff als Chromophor, der nie in freier Form gefunden werden konnte. Daneben ist das Chromoprotein zu einer ausgeprägten reversiblen Photochemie fähig, die der Photochemie des Phytochroms ähnelt. Es konnte ein Rekonstitutionssystem etabliert werden, mit dessen Hilfe die Chromophorbindung aufgeklärt werden konnte. Für die korrekte Bindung des Chromophors ist dabei neben dem Apoprotein und einem Gallenfarbstoff ein neuartiges Enzym, eine sog. Lyase-Isomerase notwendig. Anhand von Rekonstitutionen mit chemisch modifizierten Chromophoren konnte mit Hilfe molekularbiologischer, spektroskopischer und chromatographischer Methoden auch ein Modell für den Mechanismus der Photochemie des Chromoproteins entwickelt werden.

1. Durch eine basenfreie Variante der Suzuki-Reaktion gelingt es neue Aryl und Heteroaryl substituierte Pyrrolopyrrol-1,4-dione herzustellen, die durch N-Butylgruppen in vielen organischen Lösungsmitteln löslich sind. 1.1. Die neuen Farbstoffe zeichnen sich im Vergleich zum methylierten DPP-Grundkörper 24 durch höhere Stokes-Shifts (26-51%) bei guten Fluoreszenzquantenausbeuten (78- 89%) aus. 1.2. Anhand von Röntgen-Kristallstrukturanalysen der Verbindungen 38 und 41 kann der Einfluss von Packungseffekten auf die Festkörperfluoreszenz untersucht werden. Dabei zeigt sich, dass in der Packung von 41 die DPP-Chromophore relativ isoliert vorliegen. Die Anordnung in parallelen Doppelschichten in der Packung von 38 macht π-π- Wechselwirkungen zwischen den Chromophoren möglich, die zu einer bathochromen Verschiebung der Festkörperfluoreszenz führen. 2. In einer Eintopf-Reaktion kann durch Stannylierung mit Hexabutyldizinn und anschließende Stille-Reaktion die dichromophore Verbindung 45 in kleinen Ausbeuten hergestellt werden. Als Vergleichsverbindung wird die dichromphore Verbindung 47 durch Suzuki-Reaktion von 30 mit 4,4‘-Biphenylbisboronsäure synthetisiert. 2.1. Das unerwartete Absorptions- und Emissionsverhalten des Dichromophors 45 kann durch das Modell der Excitonenkopplung erklärt werden. 3. Durch die Verwendung von stöchiometrischen Mengen Tetrabutylammoniumbromid als Halogenidquelle zur Stabilisierung des Palladium-Katalysators gelingt die Umsetzung des Brom substituierten Pyrrolopyrrols 30 mit verschiedenen Styrolderivaten zu trans-Alkenyl substituierten DPP-Farbstoffen (Heck-Reaktion). 3.1. Die um eine Phenylvinyl-Einheit erweiterten Pyrrolopyrrole 55-57 zeigen große Stokes- Shifts bei mäßigen bis guten Fluoreszenzquantenausbeuten (47-78%). 3.2. Durch die freie Aminfunktion ist Verbindung 57 grundsätzlich als Fluoreszenzmarker für Immunoassays geeignet. 4. Alkinyltrialkylstannane reagieren mit 30 oder 31 unter Palladium-Katalyse zu Alkinyl substituierten DPP-Farbstoffen (Stille-Reaktion). 4.1. Das durch Desilylierung von 60 zugängliche Alkin 63 kann oxidativ zum Dichromophor 64 dimerisiert werden oder mit Dimethylaminotrimethylzinn stannyliert werden. Das Stannan 71 ermöglicht die Verknüpfung des DPP-Chromophors über eine Alkin-Brücke mit vielen Halogenaryl-Verbindungen unter sehr milden Bedingungen. 4.2. Die Alkinyl substituierten Pyrrolopyrrole zeigen große Stokes-Shifts bei mäßigen bis sehr guten Fluoreszenzquantenausbeuten (52-92%). 74 weist mit 81 nm den größten Stokes-Shift aller für diese Arbeit hergestellten und auch aller literaturbekannten Pyrrolopyrrol-1,4-dione auf. 4.3. Die über verschieden lange Alkin-Brücken verknüpften Dichromophore 64 und 70 zeichnen sich durch große langwellige Verschiebung der Absorption und der Emission gegenüber dem methylierten DPP-Grundkörper 24 aus. 4.4. Unter dem Aspekt der verminderten Aggregations- und Kristallisationsneigung wird der Tetraphenylmethan-Rest mit dem Pyrrolopyrrol-Chromophor verknüpft. Während das symmetrisch aufgebaute vierfach DPP substituierte Tetraphenylmethan 81 gut kristallisiert, zeigt die einfach DPP substituierte Verbindung 80 die erwartete schlechte Kristallisation. 4.5. Es wurde eine Zweischicht-OLED mit 59 als Emitter gebaut, die eine intensive orangefarbene Emission aufweist. 5. Durch die Palladium-katalysierte Aminierung nach Buchwald und Hartwig können verschiedene aliphatische und aromatische Amine mit dem Pyrrolopyrrol-1,4-dion- Chromophor verknüpft werden. Als effektivstes Katalysator/Basen-System erweist sich Pd2(dba)3/P(t-Bu)3 und Kaliumphosphat. 5.1. Die Cyclovoltammogramme der Verbindungen 83, 85 und 86 zeigen, dass diese Amine im selben Bereich oxidiert werden wie die im OLED-Bereich häufig verwendeten Lochleiter NPD und β-TPD. Die Reduzierbarkeit liegt in einem Bereich, der den Einsatz einer Aluminium- statt einer empfindlichen Calciumkathode in OLEDs möglich erscheinen lässt. 5.2. Aufgrund der Donorstärke der Aminsubstituenten weisen die Amine 83-87 in der Absorption und Emission große bathochrome Verschiebungen gegenüber dem methylierten DPP-Grundkörper 24 auf. 5.3. Mit 95% zeigt das zweifach Carbazol substituierte Pyrrolopyrrol 87 die höchste Fluoreszenzquantenausbeute aller für diese Arbeit hergestellten Verbindungen. 5.4. Die niedrige Fluoreszenzquantenausbeute des Phenothiazinyl substituierten Pyrrolopyrrols 85 von 12% in Chloroform, die im polareren Lösungsmittel Methylenchlorid auf 6% abnimmt, weist auf einen Photoelektronentransfer (PET) vom elektronenreichen Phenothiazin auf den Elektronenakzeptor Pyrrolopyrrol-1,4-dion hin. 5.5. Das aliphatisch substituierte Amin 86 wird in einem Essigsäure/2 N Schwefelsäure- Gemisch protoniert. Dadurch verschieben sich Absorption und Emission hypsochrom um ca. 40 nm. 5.6. 84 und 87 bilden in Essigsäure H-Aggregate aus. Darauf deuten die in Essigsäure um ca. 20 nm hypsochrom gegenüber den Messungen in Chloroform verschobenen Absorptionswellenlängen bei unveränderter Fluoreszenz hin. Die in Essigsäure unveränderte Fluoreszenz kann durch die Emission isolierter Einzelmoleküle erklärt werden. H-aggregierte Moleküle zeigen keine Fluoreszenz. 6. Unter den Bedingungen der Suzuki-Reaktion kann das Dichlor substituierte 1,4- Dimethylaminopyrrolopyrrol 94 mit Arylboronsäuren zu den Aryl substituierten Dimethylaminopyrrolopyrrolen 99-104 umgesetzt werden. 6.1. Die unterschiedlichen Absorptions- und Emissionseigenschaften von 99-104 können durch den Donor/Akzeptor-Einfluss der Arylreste auf die Grenzorbitale des Dimethylaminopyrrolopyrrols nicht vollständig erklärt werden. Erst durch die Berücksichtigung der Verdrillung der Arylreste gegenüber dem Pyrrolopyrrol-Chromophor (aus AM1- optimierten Strukturberechnungen) können die spektroskopischen Daten gedeutet werden. 7. Phenylacetylen und TMS-Acetylen reagieren unter Palladium-Katalyse in Gegenwart von Kupfer(I)iodid und Triethylamin zu den Alkinyl substituierten Dimethylaminopyrrolopyrrolen 105 und 106 (Sonogashira-Reaktion). 7.1. Die geringen Stokes-Shifts von 105 und 106 können auf die – nach AM1-Rechung – planare Geometrie dieser Verbindungen im Grundzustand zurückgeführt werden.

Durch die genetische Fusion mit dem Grün Fluoreszierenden Protein können seit 1994 Proteine oder Genexpression in vivo visualisiert werden, ein bedeutender Fortschritt für die Lebenswissenschaften. Die Nutzungsmöglichkeiten können z. B. mit der gleichzeitigen Verwendung von fluoreszenzspektroskopisch unterscheidbaren GFP-Varianten (multispektrale Detektion) erweitert werden. Eine Veränderung der spektralen Eigenschaften des Proteins unter Beibehaltung seiner Funktionalität in vivo kann nur durch Mutagenese erfolgen. Das Ziel dieser Arbeit ist es, einen Beitrag zur grundlegenden Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen dem Chromophor und der umgebenden Proteinmatrix zu leisten. Durch die Substitution von T203 in wt-GFP kann gezeigt werden, dass die B-Spezies gegenüber der A- und der I-Spezies durch eine Wasserstoff-Brücke von T203 zum Chromophor gekennzeichnet ist. Diese bewirkt gegenüber der I-Spezies ein Blauverschiebung der Absorption um ca. 23 nm. Die I-Spezies kann durch Doppelmutationen stabilisiert werden und stellt unter den GFP-Varianten einen neuen spektralen Phänotyp dar. Die Tendenz zur Dimerisierung ermöglicht die absorptionsspektroskopische Darstellung einer Population der I-Spezies in wt-GFP. Gleichzeitig wird das Dimerisierungsmodell experimentell bestätigt und mit einer relativ schwachen Dimerisierungskonstante von ca. 3 mM-1 ergänzt. Die spektroskopischen Eigenschaften wichtiger GFP-Varianten lassen sich nun mit einem molekularen Modell erklären. So wird bewiesen, dass die Absorptionsrotverschiebung um 33 nm durch die Mutation T203Y (YFP-Varianten) nur zu ca. 1/3 auf spezifisch aromatischen Wechselwirkungen beruht. Zusammen mit den EGFP-Varianten eignet sich die T203V-Variante für eine neue Art der multispektralen Detektion auf der Grundlage der sehr gut separierten Anregungsspektren. Die Kenntnisse über die Vorgänge bei der Dimerisierung von wt-GFP bzw. GFPuv lassen sich prinzipiell für die intrazelluläre und lokale in vivo-Messung effektiver Proteinkonzentrationen bzw. von Protein-Protein-Wechselwirkungen nutzen. Durch kombinatorische Mutagenese wurde deutlich, dass der schnelle Protonentransfer (ESPT) nach Anregung der A-Spezies das negativ geladene E222 als Akzeptor benötigt. Ansonsten wird der Prozess deutlich verlangsamt, was mit einer entsprechenden Abnahme der Quantenausbeute für die grüne Emission einhergeht. In der Variante S65G/T203V/E222Q wird zusätzlich der strahlunglose Verlust der Anregungsenergie von A* stark verringert. Dadurch dominiert die blaue A*-Emission das Emissionsspektrum. Dieser neue spektrale GFP-Phänotyp ist für multispektrale Anwendungen geeignet. Von den GFP-homologen Proteinen, die erst seit Ende 1999 entdeckt werden, hat das stark rot emittierende aus Discosoma (DsRed) die langwelligste Emission und ist deshalb für in vivo Applikationen am interessantesten. Es wird bewiesen, dass der Chromophor des Proteins über die langsame kovalente Modifikation des intermediär entstehenden GFP-Chromophors gebildet wird. Mit der Entfaltung des Proteins wird dieser Prozess teilweise revertiert. Aus einer Proteinbibliothek konnten Varianten identifiziert werden, in denen räumlich gruppierte Einzelmutationen diesen finalen Maturierungsschritt in verschiedenem Ausmaß unterdrücken. Die Emission des intermediären GFP-Chromophors kann von dem finalen DsRed-Chromophor absorbiert werden (FRET), was auf eine starke Oligomerisierung hindeutet.

Tue, 24 Jul 2001 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/456/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/456/1/Spoerlein_Sebastian.pdf Spörlein, Sebastian ddc:530, ddc:500, Fa

In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion ausgesuchter Aminosäuren in der archaealen Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (BR) bei der Entstehung der zweidimensional kristallinen Purpurmembran (PM) in Halobacterium salinarum untersucht. Mittels gerichteter Mutagenese wurden aromatische Gruppen (W12, Y64, W80) gegen andere Reste ausgetauscht und die mutierten Gene homolog exprimiert. Die Tryptophanmutationen hatten dabei eine drastische Störung der PM-Bildung zur Folge, was auf wichtige Wechselwirkungen mit Lipidmolekülen schließen ließ. Insbesondere der Tryptophanrest W80, der mit dem Phythanylrest eines Glykolipids im Zentrum des Trimers wechselwirkt, zeigte seine essentielle Bedeutung für die PM-Bildung. Eine Abhängigkeit der PM-Bildung von der vorhandenen BR-Menge und Wachstumsphase konnte beim Wildtyp (WT) ausgeschlossen werden. Gefrierbruchelektronenmikroskopische Aufnahmen von ganzen Zellen zeigten bei der Mutante BR-W12I zahlreiche kleinere kristalline Bereiche auf der Oberfläche, während die Zellen mit BR-W80I nahezu keine geordneten Flächen aufwiesen. Mit Hilfe von Rotationsdiffusionsmessungen in Vesikeln und Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie von spinmarkierten Cysteinmutanten wurde eine Zunahme der Mobilität der markierten Seitenketten und des mittleren Abstands der BR-Moleküle nachgewiesen. Lichtinduzierte Proteinvernetzung zeigte eine deutliche Auflockerung der kristallinen Struktur der mutierten BR-Moleküle in der Zellmembran, vor allem bei BR-W80I. Die Funktion von BR als Protonenpumpe wurde durch die Mutationen nicht beeinträchtigt, ebenso wurde keine durch die PM bewirkte höhere Photophosphorylierungsrate in den Zellen nachgewiesen, weshalb eine Begünstigung dieser Prozesse als Erklärung für die in vivo- Kristallisation ausgeschlossen wurde. Der Einfluß der Mutationen auf die spektroskopischen Eigenschaften war vergleichsweise gering. Jedoch bot die Abnahme der Lichtadaptationsfähigkeit und Zunahme des Anteils an inaktiven 9- und 11-cis-Retinalisomeren in lichtadaptierten Proben eine plausible Erklärung für die Bildung der kristallinen PM. Die Bildung des 9-cis-Isomeren führt zur Spaltung der Bindung zwischen Retinal und dem Protein. Dies wurde durch Belichtung von Zellen mit BR-W80I nachgewiesen, die innerhalb weniger Stunden ihren aktiven Chromophor in BR verloren. Demnach wird durch die kristalline Anordnung von BR die thermoreversible Isomerisierung von all-trans- zu 13-cis-Retinal so stark bevorzugt, dass die funktionelle Stabilität des Proteins gewährleistet ist. Dies erklärt den evolutionären Vorteil des kristallinen Form des BR als Purpurmembran. Das Vorkommen von zweidimensionalen Kristallen von Halorhodopsin (HR) mit hexagonaler Ordnung im Überexpressionsstamm D2 wurde mittels Gefrierbruchelektronenmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Anordnung wurde in 3D-Kristallen gefunden, die im Rahmen dieser Arbeit durch Aufreinigung des Proteins und Kristallisation in kubischen Lipidphasen erhalten wurden (Kolbe et al., 2000). Damit wurde gezeigt, dass in den 3D-Kristallen von HR die gleiche Anordnung wie in der Zellmembran auftreten kann. Dies ließ auch auf eine physiologische Relevanz des Palmitatmoleküls schließen, das im Innern des HR-Trimers in der Kristallstruktur gefunden wurde. Die Affinität dieser Fettsäure zu HR wurde durch Markierung der Zellen mit 3H-Palmitat untersucht. Aus diesen Experimenten ging hervor, dass die Affinität der Palmitinsäure zu HR im Vergleich zu BR nicht höher ist. Eine BR-Mutante, die in einer nichtkristallinen Anordnung vorlag, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Klonierung und homologe Expression von Genen für lösliche Proteine als Fusionsprotein am C-terminus von BR ermöglicht. Dies wurde mit dem Gen für das Ferredoxin von H. salinarum erfolgreich durchgeführt. Die rasche Aufreinigung der entstandenen PM mittels Zentrifugation in einem Saccharosedichtegradienten führte zu einer einfachen Abtrennung von einem Großteil anderer Proteine. Durch Einführung spezifischer Proteaseschnittstellen wurde auch eine Spaltung des Fusionsproteins ermöglicht. Die Koexpression löslicher Proteine mit BR in der PM bietet enorme Vorteile aufgrund der hohen Expressionsrate des Bacterioopsingens (bop), der Induzierbarkeit des bop-Promoters, die einfache Aufreinigung und der Möglichkeit zur Expression von Mutanten von essentiellen Genen ohne deren vorherige Deletion. Die Eignung dieses Systems für die einfache Isolierung von löslichen Proteinen als Fusionsprotein mit BR wurde im Rahmen dieser Arbeit bestätigt.